多孔羟基磷灰石陶瓷修复颅骨缺损的实验研究

为了探索多孔羟基磷灰石陶瓷（ＨＡＣ）作为人工材料修复颅骨缺损的可能性，选健康家兔２４只，切除颅顶骨造成缺损，分别用多孔ＨＡＣ植片及无孔甲基丙烯酸甲脂－苯乙烯共聚物（ＭＭＡＳ）植片修复家兔颅骨缺损，于术后第１，２及３个月处死动物，进行术后反应及组织学观察。结果发现：术后动物精神状态及活动均正常，无头皮下积液。组织学显示在不同阶段，多孔ＨＡＣ植片标本有肉芽组织、纤维组织和新生血管向微孔中生长及成骨细胞形成的骨小梁。界面结构未见异型细胞及炎性细胞浸润。无孔ＭＭＡＳ植片表面有纤维膜形成。实验表明，由于ＨＡＣ具有优良的生物学性能，有可能作为颅骨缺损的修复材料。     

大鼠骨髓间充质干细胞与多孔双相磷酸钙陶瓷支架体外黏附的实验研究

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞(marrowmesenchymalstemcells,MSCs)诱导培养后在多孔双相磷酸钙(biphasiccalciumphosphate,BCP)陶瓷支架材料上的黏附和生长。方法SD大鼠MSCs经矿化诱导培养、扩增,具有成骨细胞表型后,与多孔BCP陶瓷支架及普通多孔羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)陶瓷支架体外复合培养,扫描电镜观察比较MSCs在两种材料支架表面的黏附数量和形态;同时以0.5、1.0、2.0、3.0和4.0×106/ml浓度细胞悬液接种于多孔BCP支架材料,检测适宜的接种浓度及单位体积支架材料可黏附MSCs数量。结果大鼠MSCs经诱导培养14d后,行矿化沉积茜素红染色、型胶原免疫细胞化学染色及碱性磷酸酶细胞化学染色,结果均为阳性。大鼠MSCs黏附于多孔BCP陶瓷上的细胞数(88.00±6.58)明显高于HA陶瓷组(39.00±3.65),两组比较差异有统计学意义(P<0.01)。当接种浓度为2.0×106/ml时,单位体积的陶瓷支架材料最多可黏附MSCs数量为1.28×107个/cm3,为细胞适宜接种浓度。结论大鼠MSCs在体外经矿化诱导培养可表达成骨细胞表型,细胞浓度为2.0×106/ml时与多孔BCP陶瓷支架材料具有良好的黏附能力。     

富含血小板血浆和骨髓基质干细胞复合物修复兔颅骨缺损

目的:在骨缺损中植入骨髓基质细胞和富含血小板血浆(Platelet Rich Plasma, PRP)的复合物,观察缺损的修复情况,为临床骨缺损的修复探索新的途径。方法:体外扩增兔骨髓基质干细胞(Bone marrow stem cell, MSCs),将MSCs与PRP混合形成MSCs/PRP复合物,使细胞的终浓度为5×106个/ml。将MSCs/PRP复合物用牛凝血酶固化为凝胶体,植入细胞供体兔颅骨直径15mm缺损中,以单纯植入PRP作为对照。术后8周取材,通过大体观察、X线检查、组织学检查观察骨缺损的修复情况。结果:MSCs/PRP凝胶植入8周后,缺损大部分获得修复,组织学分析显示缺损中有大量新骨形成。结论:应用PRP复合MSCs可以提高骨缺损的修复效果。     

磷酸钙人工骨结合骨髓基质干细胞移植修复骨缺损的实验研究

目的制备磷酸钙人工骨(calcium phosphats artifieal bone, CPC)与骨髓基质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)复合物，通过动物实验研究其对骨缺损的修复作用。方法分离、扩增兔的BMSCs，并以CPC为载体制备cPc／BMSCs复合物，植入兔桡骨15mm骨缺损处。于术后不同时间处死动物，通过X线摄片、组织学染色分析和放射性核素监测，观察新骨形成和材料降解情况。同时以单纯的CPC及空白对照组作为对照研究，评价CPC／BMSCs复合物对骨缺损的修复能力。结果CPC／BMSCs复合物可再生新骨组织并完好地修复桡骨缺损，且其修复能力明显优于单纯的CPC。结论以CPC为载体的自体骨髓细胞移植能有效的修复骨缺损。     

复合骨髓间充质干细胞生物陶瓷修复兔松质骨缺损

目的 评估复合骨髓间充质干细胞(MScs)的生物陶瓷在修复兔松质骨缺损中的作用。方法 分别对单纯燃烧骨、复合MSCs燃烧骨、三磷酸钙(β-TCP)及复合MSCsβ-TCP行：①体外研究：电镜观察复合后MSCs的生物学行为；②裸鼠异位成骨研究；②兔股骨锻松质骨缺损(φ6mm、深12mm)修复：18只兔32侧骨缺损分为5组(其中一组未加任何处理)，于2、4、8周末分别行组织学检查。结果 ①MSCs在燃烧骨及β-TCP上的黏附及生长情况良好，4d基本长满表面，6d起开始重叠生长；②在裸鼠体内，单纯β-TCP或燃烧骨无成骨，而复合MSCs组自2周开始成骨，并随时间延长而增加，但β-TcP组成骨与材料降解相平衡，而煅烧骨组仅在孔壁周围形成板层骨；③兔股骨锻缺损：未经处理不能自行愈合，2周内各组均无骨长入，4周开始由周边长入，8周时各组的骨长入率分别为40％、56％、45％、60％，无论在燃烧骨抑或β-TCP组中复合MSCs组的成骨量均高于对照组(P＜0．05)。结论 复合MSCs的生物陶瓷是修复负重区松质骨缺损的一种有效方法。     

自体骨髓基质干细胞组织工程骨修复颅骨缺损的临床研究

目的探讨人骨髓基质干细胞(hBMSCs)作为种子细胞的组织工程骨修复外伤后颅骨缺损的可行性。方法自2006年6月至2007年2月,共4例外伤后颅骨缺损患者,抽取患者骨髓,分离得到hBMSCs,体外扩增和成骨诱导后,将hBMSCs与部分脱钙骨复合,体外共培养1周后,手术植入颅骨缺损区。分别于术后1周和3个月、6个月进行临床和三维CT检查随访。结果术后1周,三维CT均显示骨缺损区被所植入的组织工程骨充填;术后3～6个月,CT显示组织工程骨形成并修复骨缺损,新生骨与骨缺损断端融合。高龄患者及骨缺损面积过大患者,组织工程骨体内成活率较差。结论通过选择适宜的病例,以自体hBMSCs作为种子细胞,运用组织工程技术可以在人体内形成稳定的组织工程骨并可用于修复颅骨缺损。     

兔骨髓间质干细胞用于构建组织工程软骨组织的初步报告

目的 采用组织工程方法,以培养后的兔骨髓间质干细胞（MSC）制成人工软骨培养物,经体内外培养后发育出成活的软骨组织。方法 抽取兔人经密度梯度离心得到单个核细胞,再经体外分离、培养获得兔骨髓MSC。向MSC培养液内加入地塞米松、转化生长因子－β1（TGF－β1）和维生素C进行软骨起源诱导培养3周,部分细胞开始转变为圆形并分泌基质。将诱导后的细胞与牛Ⅰ型胶原及人纤维蛋白按一定的比例混合,制成软骨样的培养物并分别做体内外培养。结果 体外培养2周后,培养物内大部分细胞已萎缩消失。但剩余的少量细胞成活,形成类似的软骨陷窝并分泌甲苯胺蓝异染的软骨基质。体内移植培养3周后,培养物已发育成颗粒状成熟的软骨组织。结论 骨髓间质干细胞可用于组织工程软骨组织的构建,是一种非常有前途的人工软骨组织构建中的功能细胞。     

兔骨髓间质干细胞修复肌腱缺损效果观察

目的　观察兔骨髓间质干细胞(MSCs)修复肌腱缺损的效果。　方法　分离培养家兔MSCs,检测CD44mRNA进行鉴定。6只家兔分为实验组和对照组,每组3只。在兔跟腱处造成3cm长的缺损,实验组家兔以自体MSCs为种子细胞、以胶原聚羟基乙酸(PGA)为生物支架构建肌腱并移植于跟腱缺损处,对照组家兔仅以PGA生物支架修复跟腱缺损。于术后4、8、12周对移植部位进行大体和组织学观察。　结果　MSCs培养11d时CD44mRNA显示阳性。实验组术后8周肉眼可见移植处形成腱样组织, 12周时组织学观察可见形态一致、顺应力学方向排列于胶原中的腱样细胞,类似正常肌腱组织。对照组所形成的新生组织较实验组细小且与周围组织粘连, 12周时组织学观察见细胞排列紊乱,胶原纤维呈松散网丝状。　结论　应用组织工程技术以自体MSCs修复肌腱缺损具有可行性。     

骨髓基质细胞修复颅骨缺损的实验研究

目的为验证三维打印研究中动物模型的可靠性，采用骨髓基质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）修复裸鼠颅骨缺损。方法共10只裸鼠，其中实验组（n=5只）：颅骨缺损区植入BMSCs／脱钙骨；材料对照组：颅骨缺损区植入单纯脱钙骨，采用实验组自身对照（n=5只）；空白对照组（n=5只）：双侧颅骨区造成缺损后旷置。术后3个月取材进行大体观察、组织学和免疫组化（骨钙蛋白）检查。结果术后3个月，实验侧组织质地较硬，组织学表现为骨结构，骨钙蛋白免疫组化阳性；对照侧质地较软，组织学表现为结缔组织，骨钙蛋白免疫组化阴性；空白对照组仍表现为颅骨缺损。结论采用BMSCs可修复裸鼠颅骨缺损，验证了三维打印研究中动物模型的可靠性。     

人骨髓间质干细胞的优化培养

目的探索人骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的优化培养条件.方法应用不同条件,研究原代培养方法、接种密度、首次换液时间、培养基、血清浓度及种类对细胞生长的影响,并以选定的条件培养、扩增MSCs,扩增后向成骨细胞和软骨细胞诱导.结果在其它条件不变的前提下,密度梯度分离法优于全骨髓法,2.5×105/cm2是人MSCs原代培养的适宜接种密度,原代第5天首次换液为最佳换液时间,DMEM培养基优于α-MEM培养基,血清C为适宜的血清,10%为适宜的血清浓度.所选条件培养的MSCs可在体外扩增15代以上,形态保持不变,并具有良好的分化潜能.结论建立了人MSCs的体外优化培养条件,为其在组织工程方面的应用作出了新的探索.     

多孔碳酸钙陶瓷修复骨缺损的实验研究

目的 探讨多孔碳酸钙陶瓷修复骨缺损的可行性。方法 取20只新西兰大白兔，采用兔桡骨干1．5cm缺损的动物模型并植入多孔CaCO3陶瓷，分别于术后2、4、8、12及16周处死后取材，行大体、X线、扫描电镜和组织切片观察。结果 植入材料4周扫描电镜显示材料的骨结合紧密、且无纤维组织界面；组织学观察12周植入材料内有较多板层骨生成、植入材料被吸收，骨缺损得到修复。结论 多孔CaCO3陶瓷具有良好的生物相容性和降解率，是一种替代自体骨修复骨缺损较理想材料。     

转基因人骨髓间质干细胞在支架中增殖及矿化的研究

目的:观察携带骨形态发生蛋白2基因(BMP-2)的人骨髓间质干细胞(hMSCs)在生物衍生骨支架环境中的增殖及矿化.方法:利用BMP-2腺病毒载体转染hMSCs后种植生物衍生骨支架中,扫描电镜观察细胞生长增殖,能量谱仪测定钙质分泌,RT-PCR检测培养液上清中BMP-2表达.结果:转染后,hBMSC呈ALP、Ⅰ和Ⅱ型胶原阳性表达;细胞在支架中伸展良好,生长旺盛,并产生钙盐沉积;RT-PCR显示培养液上清中存在BMP-2基因表达.结论:转染BMP-2基因的hMSCs在生物衍生骨支架中能够立体生长、增殖,并继续表达目的基因,为基因修饰的组织工程骨修复骨缺损奠定了基础.     

富集骨髓基质干细胞复合多孔β-磷酸三钙促进骨缺损修复的实验研究

目的 评估富集骨髓基质干细胞(BMSCs)复合β-磷酸三钙(β-TCP)在促进骨缺损修复中的作用. 方法 抽取12只崇明山羊骨髓血,用梯度离心法分别将其中的BMSCs富集、分离后与β-TCP复合.12只山羊双侧股骨内髁钻孔,制备骨缺损模型.所有山羊左侧股骨内髁缺损通过富集BMSCs/β-TCP进行局部填充治疗(实验组),其中10只羊右侧股骨内髁缺损以单纯β-TCP颗粒填充治疗(对照组),2只羊右侧股骨内髁缺损旷置(空白组),评价富集效率.术后16周处死取材,将所得标本进行影像学观察和形态学计量,实验组和对照组之间进行比较. 结果 BMSCs富集后有核细胞数和碱件磷酸酶染色呈阳性的细胞集落形成单位(CFUs/ALP+)数均有显著提高,差异有统计学意义(P<0.05).X线侧位片和μ-CT形态计量分析显示实验组新生骨长入率(70.27%±8.47%)显著高于对照组(21.40%±5.77%),差异有统计学意义(t=11.97,P<0.05).X线侧位片、CT平扫与三维重建以及μ-CT图像均可见实验组疗效优于对照组. 结论 在促进骨缺损修复中,富集BMSCs/β-TCP的疗效优于单纯β-TCP颗粒,有良好的应用前景.     

骨髓基质干细胞与生物衍生骨复合修复山羊胫骨缺损的影像学研究

目的探讨骨髓基质干细胞(MSCs)与生物衍生骨复合修复山羊胫骨的长段骨-骨膜缺损,以及修复负重骨缺损的可行性. 方法将18只12月龄健康杂种青山羊(雌雄不限),制备成双侧胫骨中段20 mm骨-骨膜缺损模型,常规钢板螺钉固定;MSCs与生物衍生骨于体外复合培养;对同一只山羊将复合物植入右侧胫骨缺损处作为实验组,以单纯材料植入左侧胫骨缺损处作为对照组,空白组不植入任何材料;在8、12、16和24周各时间点分别行标本的大体观察、X线片观察和骨密度测试,比较其修复骨缺损的能力. 结果大体观察、X线片和骨密度测试显示:实验组8周骨缺损部分修复,12、16周骨缺损完全修复,8、12和16周其骨密度较对照组高,差异有统计学意义(P＜0.05);24周实验组与对照组骨密度差异无统计学意义;空白组骨缺损未修复. 结论组织工程骨早期修复骨缺损能力较强,且较单纯材料成骨量大、迅速,能够对负重骨缺损进行有效的修复.     

骨髓间充质干细胞复合消旋聚乳酸/明胶修复兔关节软骨缺损的实验研究

目的 研究骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells，MSCs）复合消旋聚乳酸（poly-L-lacticacid，PLLA）／明胶修复兔膝关节全层软骨缺损的效果。方法 4～6月龄青紫兰兔36只，体重2．5～3．5kg，雌雄不拘。体外分离培养MSCs，取第2代MSCs种植于PLLA／明胶支架体外复合培养。将36只青紫兰兔制备双侧膝关节全层软骨缺损模型，根据修复方法不同随机分为A、B、C3组（n=12）。A组，将MSCs与PLLA／明胶支架材料复合物植入兔双膝缺损处；B组，将单纯PLLA／明胶支架材料植入兔双膝缺损处；C组，缺损处不作任何处理，作为对照。A、B组在植入时均加入25μg／L转化生长因子β（transforming growth factorp1，TGF-β1）0．4ml。分别于术后4、8和12周，取材行大体、组织学及免疫组织化学染色观察，并将12周大体及组织学标本按照O’driscoll等评分标准进行评分。结果大体观察：术后12周，A组修复组织与正常软骨结合处完整，表面光滑，界限模糊；B、C组缺损处修复组织呈纤维组织或无修复，表面不平整或呈虫蚀样改变。组织学观察：A组术后4周，细胞数较多，呈梭形、圆形或椭圆形；8周修复组织与周围软骨大部分结合，细胞呈圆形，以透明软骨样细胞为主，有软骨陷窝，表层有梭形纤维样细胞；12周修复组织细胞为透明软骨样细胞，柱状排列，与周围软骨及软骨下骨整合良好；B组，术后4～8周细胞数较少，细胞层次排列差；12周修复组织菲薄，呈纤维软骨样，基质染色接近正常；C组，术后4～8周缺损组织由薄层纤维组织覆盖；12周缺损区纤维组织进一步增厚，与周围软骨未结合。免疫组织化学染色显示，A组修复组织Ⅱ型胶原染色呈阳性，B组呈弱阳性，C组无表达。术后12周大体观察总评分，A、B及C组分别为2．75±0．89、4．88±1．25和7．38±1．18，A组优于B、C组，B组优于C组，且差异均有统计学意义（P〈0．05）；组织学观察总评分，A、B及C组分别为3．88±1．36、8．38±1．06和13．13±1．96，A组与B、C组以及B组与C组差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论 应用软骨组织工程原理，以PLLA／明胶为支架材料复合自体MSCs移植是一种修复软骨缺损行之有效的方法。     

人骨髓间质干细胞库的初步建立

目的 探讨建立生物学性状稳定的人骨髓间质干细胞(human marrow mesenchymal stem cells，hMSCs)库的可行性，为组织工程种子细胞的来源作初步探索。方法对分离得到的hMSCs采用液氮低温冻存，并在一定时间复苏培养，以流式细胞仪检测其表面抗原，在诱导培养基中对其行成骨和成软骨诱导培养，光镜：电镜观察细胞的形态，采用组织化学、免疫组织化学及分子生物学的方法检测成骨和成软骨诱导的特异标志物：碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原及骨钙素，研究其生物学性状。结果从骨髓中分离得到了纯度达96％以上的hMSCs，复苏后的hMSCs形态和表面抗原保持不变，可继续扩增10代以上，倍增时间40h。复苏后第2、6、10代hMSCs均保持较强的向软骨细胞、成骨细胞的分化能力。结论初步建立了hMSCs库，可为骨及软骨组织工程提供较好的种子细胞。     

骨髓间质干细胞与Ⅱ型胶原修饰的PLGA黏附性的观察

[目的]优化骨髓问质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）体外分离培养技术，改良生物材料聚乙醇酸-乳酸共聚物（poly lactide-co glycolide，PLGA）的细胞黏附性，观察BMSCs与Ⅱ型胶原修饰的PIJIGA的黏附性。[方法]密度梯度离心法分离BMSCs，流式细胞分析法（FACS）对细胞表面抗原、细胞活力、细胞周期进行检测，相差显微镜观察细胞形态。相分离法制做PLGA，Ⅱ型胶原进行表面修饰，取第三代干细胞与PLGA附和，扫描电镜观察细胞与材料的黏附情况。[结果]BMSCs可在体外分离扩增，表达CD29、CIM4和CD106，不表达CD34和CIM5，细胞活力为88．96％，GO．G1细胞占90．32％。细胞形态为长梭形，Ⅱ型胶原表面修饰的PLGA平均孔径为100μm，与BMSCs有较好的黏附性。[结论]BMSCs可在体外长期、稳定培养，是理想的组织工程种子细胞。Ⅱ型胶原表面修饰的PLGA与干细胞有较好的黏附性，可用来做组织工程生物材料。     

兔骨髓间充质干细胞修复膝关节软骨缺损的实验研究

目的研究由同种异体兔骨髓间充质干细胞(MSCs)诱导分化的软骨细胞和聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)双层支架构建复合体对兔软骨缺损的修复作用。方法用密度梯度离心法和贴壁培养法获得5月龄兔骨髓来源间充质干细胞,在体外培养并进行分化诱导后作为种子细胞复合双层PLGA构建成复合体。36只兔在股骨髁间制造骨软骨缺损模型,分成三组,A组植入复合体,B组植入单纯双层PLGA支架,C组植入自体骨软骨。第24周取材进行大体观察、组织学检查和Wakitani评分。结果 A组及C组植入物愈合良好,组织学检查见Ⅰ、Ⅱ型胶原纤维形成。A组可见透明软骨修复。Wakitani评分A组2.75,B组7.00,C组1.98,A、C组与B组间统计学分析单项指标得分差异有统计学意义(P0.05),A组与C组间差异无统计学意义(P0.05)。结论诱导兔MSCs+PLGA双层支架能较好地修复兔膝关节骨软骨损伤。     

组织工程骨修复兔颅骨缺损中骨形态发生蛋白的表达

目的 探讨组织工程骨修复骨缺损,内源性骨形态发生蛋白（BMP）在组织工程骨再生过程中的分布及作用,方法 将自体成骨样细胞即刻种植在胶原包埋的聚羟基乙酸（PGA）基质材料上, 然后将该复合体或单纯基质材料移植到兔颅骨的一侧全层骨缺损区,作为实验侧Ⅰ或实验侧Ⅱ。对凤对照,不作任何植入。18只新西兰兔分别于术后3、8及14天处死,标本行组织学及BMP免疫组织化学检查,切片上,确定骨缺损区中央,距骨断端2mm、5mm为A、B、C三区,利用真彩色计算机图像分析系统在各区间测量BMP值。结果 术后3天,实验侧Ⅰ基质间存在BMP阳性细胞,8天时,实验侧Ⅰ新骨形成明显优于实验侧Ⅱ及对照侧。14天时,实验侧Ⅰ可见骨小梁形成,对照侧为纤维组织修复。BMP定量分析中,实验侧（Ⅰ、Ⅱ）三区的BMP值高于对照侧,但实验侧的浓度梯度差值小于对照侧。结论 即刻种植于PGA基质材料上的成骨样细胞在体内可合成和分泌BMP,利用组织工程技术将内源性BMP局限于骨缺损区,提高内源性BMP浓度并改善其分布,可能是组织工程骨诱导骨再生机制之一。