survivin反义寡核苷酸抑制HL-60细胞增殖并诱导细胞凋亡

目的：探讨survivin反义寡核苷酸(ODN)对人白血病细胞系HL-60细胞增殖和凋亡的影响。方法：人工合成survivin基因反义和正义ODN,并进行硫代磷酸化修饰,通过脂质体途径分别转染HL-60细胞;应用RT-PCR和W estern B lot检测survivin mRNA和蛋白表达;应用MTT法检测survivin反义ODN对HL-60细胞增殖的影响;流式细胞仪检测细胞周期变化及细胞凋亡比率。结果：体外培养的HL-60细胞可表达较强的survivinmRNA和蛋白;survivin反义ODN可呈浓度依赖性地抑制survivin mRNA和蛋白表达,1 000 ng/mL AS-ODN几乎完全抑制survivin mRNA和蛋白表达。MTT研究结果表明,survivin反义ODN可呈浓度依赖性地抑制HL-60细胞增殖,1 000 ng/mL AS-ODN对细胞生长的抑制率可达78.14%;诱导细胞凋亡,使细胞阻滞于G2/M期。survivin正义ODN对survivin mRNA和蛋白以及HL-60细胞的增殖和细胞周期无明显的抑制作用。结论：脂质体介导转染survivin反义寡核苷酸可抑制细胞增殖、诱导细胞发生G2/M期阻滞而促进细胞凋亡。     

应用RNA干扰技术抑制骨肉瘤细胞中基质金属蛋白酶-1基因表达的研究

目的构建针对人基质金属蛋白酶-1（MMP-1）基因的特异性短发卡RNA（shRNA）真核表达载体，并观察其在人骨肉瘤细胞MG63中对MMP-1基因表达的抑制作用。方法培养骨肉瘤细胞MG63，根据MMP-1基因cDNA编码序列，设计并合成针对MMP-1基因的特异性RNA干扰片断，将其克隆入pSilencer 3．0-H1 neo质粒，构建MMP-1基因shRNA真核表达载体siRNA MMP-1。与阴性对照质粒分别转染MG63细胞，G418筛选稳定转染的细胞系。采用RT—PCR、Western blot检测MMP-1 mRNA和蛋白的表达水平，同时进行体外侵袭试验。结果成功构建了MMP-1基因shRNA真核表达载体siRNA MMP-1。获得了稳定转染siRNA MMP-1载体和阴性对照载体siRNA neg的细胞系，并发现MG63／siRNA MMP-1细胞MMP-1 mRNA和蛋白表达均受到明显抑制，细胞侵袭能力也显著下降。结论特异性shRNA能够明显抑制MMP-1基因在MG63细胞中的表达，这为进一步研究MMP-1在MG63细胞中的生物学功能和作用机制奠定了实验基础。     

小分子干扰技术缄默Survivin基因表达对Jurkat细胞凋亡和化疗敏感性的影响

目的研究应用短发夹RNA(shRNA)技术缄默Survivin基因表达后对白血病细胞株Jurkat细胞凋亡及对化疗药物敏感性的影响。方法构建shRNA-Survivin重组质粒,电击转染至Jurkat细胞,G418筛选得到稳定表达重组质粒的细胞系,反转录(RT)-PCR检测转染细胞中Survivin mRNA表达水平变化,化疗药物长春新碱(VCR)及柔红霉素(DNR)分别作用各转染组细胞,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定各组细胞的增殖抑制率,流式细胞术测定药物对各组细胞的凋亡效应。结果 DNA测序证实表达质粒构建成功,RT-PCR检测结果显示重组质粒能明显抑制Jurkat细胞Survivin mRNA表达,与对照组及阴性质粒转染组比较,差异均有统计学意义(Pa<0.05)。VCR及DNR作用转染细胞后,可有效抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡,与对照组及阴性质粒转染组比较,差异均有统计学意义(Pa<0.05)。结论 Survivin基因对Jurkat细胞生长有重要作用,转染shRNA-Survivin表达质粒能有效抑制细胞Survivin mRNA表达,缄默Survivin基因表达的细胞对化疗药物的敏感性显著增高。     

反义Survivin对血管瘤内皮细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨脂质体转染Survivin反义寡核苷酸(ASODN)对体外培养的增生期血管瘤内皮细胞增殖、凋亡的影响.方法 人工合成Survivin ASODN,通过脂质体转染到体外培养的增生期血管瘤内皮细胞,光镜和倒置相差显微镜观察转染后细胞形态变化;用四氮唑盐(MTT)法观察转染后48 h不同浓度Survivin ASODN对细胞生长抑制的影响;RT-PCR、Western-blot及免疫组化法检测转染后内皮细胞Survivin mRNA水平、蛋白水平表达及Caspase-3蛋白表达.结果 不同浓度的Survivin ASODN作用后内皮细胞多数变圆、变小、脱落,胞膜皱褶、卷曲,细胞核固缩、碎裂,核被染成深蓝色或蓝黑色,以600 nmol/L作用72 h改变最明显.细胞生长受到明显抑制,600 nmol/LSurvivin ASODN时细胞生长抑制率最高,可达70.5%.与对照组相比,实验组Survivin mRNA、蛋白水平表达均明显下调,Caspase-3蛋白表达明显上调.结论 在体外RNA干扰靶向抑制Survivin基因可以显著抑制增生期血管瘤内皮细胞增殖,促进细胞凋亡;Survivin可能是控制血管瘤内皮细胞增殖或凋亡的关键基因之一.

Abstract：

Objective To evaluate the effects of survivin on cell proliferation and apoptosis in proliferative hemangioma endothelial cells. Methods Hemangioma endothelial cells were cultured in vitro and transfected with Survivin antisense oligonucleotides. The morphological changes were assessed with light microscopy and inverted phase contrast microscopy and electron microscopy. MTT assay was carried out to determine cell proliferation in proliferative hemangioma endothelial cells treated with antisense compounds. By using RT-PCR and Western blot, the expression levels of survivin mRNA and proteins were quantified. Active caspase-3 was evaluated by immunohistochemistry. Results Some morphological changes (e. g. round endothelial cells, reduced cell volume, folded cell membrane and condensed nuclei ) were revealed after transfection with increasing concentration of survivin ASODN, and these changes were most significant at the dose of 600nM at 72 hours. Endothelial cell growth was suppressed at the concentration of 600nmol/L Survivin ASODN. Survivin mRNA, protein were down-regulated significantly and Caspase-3 was up-regulated significantly in the experimental groups. Conclusions Down-regulation of survivin expression induced by the antisense compounds reduces cell growth potential, promotes apoptosis in proliferative hemangioma endothelial cells. Survivin protein is a key molecule associated with proliferation and apoptosis,and antisense oligonucleotides targeting survivin could be used as a potential therapy of proliferative hemangioma.     

microRNA-21及靶基因PDCD4、PTEN蛋白在肝母细胞瘤细胞中的表达情况及临床意义研究

目的研究肝母细胞瘤HUH-6株与正常肝LO2细胞株microRNA-21及其靶基因PDCD4和PTEN表达的差别;研究抑制microRNA-21表达后肝母细胞瘤HUH-6细胞株中microRNA-21及其靶基因PDCD4和PTEN的变化,以及反义抑制后HUH-6细胞凋亡、细胞增殖周期的变化。方法正常肝LO2细胞株与肝母细胞瘤HUH-6株作为研究对象,将肝母细胞瘤HUH-6细胞株分为3组,包括:空白对照组(正常培养的HUH-6细胞);microRNA-21抑制组(转染microRNA-21抑制序列的细胞);阴性对照组(转染无关序列的HUH-6细胞)。运用实时荧光定量PCR技术分析各组细胞中的microRNA-21的表达水平。运用流式细胞技术检测反义抑制microRNA-21后HUH-6细胞凋亡以及细胞增殖情况。用Westen-blot检测细胞中PDCD4和PTEN的表达情况。结果与正常肝LO2细胞株相比,肝母细胞瘤HUH-6株microRNA-21表达上调;反义抑制后HUH-6细胞中microRNA-21表达下降;反义抑制后HUH-6细胞增殖率下降,凋亡率增加;反义抑制后HUH-6细胞P...     

反义寡核苷酸抑制神经母细胞瘤LA-N-5细胞血管内皮生长因子mRNA表达及其生物效应的研究

摘要 目的 研究血管内皮生长因子（VEGF）反义寡核苷酸（ASODN）转染对神经母细胞瘤LA-N-5细胞VEGF mRNA表达的影响以及对肿瘤细胞增殖、分化的影响。方法 用LipofectamineTM2000介导的VEGF ASODN和错义寡核苷酸（MSODN）转染LA-N-5细胞，半定量RT-PCR检测各组细胞VEGF165和VEGF121 mRNA转染前后不同时间表达的变化；MTT法测定转染后各组细胞的生长曲线及抑制率。结果 半定量RT-PCR检测结果显示，在转染后72 h VEGF165和VEGF121 mRNA的表达：ASODN组为0.346±0.029和0.227±0.036，ASODN+LipofectamineTM2000组为0.275±0.035和0.165±0.017。ASODN组和ASODN+LipofectamineTM2000组均显著抑制VEGF mRNA的表达，ASODN+LipofectamineTM2000组抑制作用较ASODN组更强（P<0.05）；转染后ASODN组和ASODN+LipofectamineTM2000组细胞增殖显著受抑，在48 h时抑制率最高，分别为（39.92±2.74）%及（55.80±2.52）%,ASODN+LipofectamineTM2000组对细胞增殖的抑制作用较ASODN组更为明显（P<0.05）。MSODN组、MSODN+LipofectamineTM2000组对LA-N-5细胞增殖抑制作用与对照组差异无统计学意义（P>0.05）。结论 VEGF ASODN可抑制神经母细胞瘤LA-N-5细胞VEGF在mRNA水平的表达，并能抑制神经母细胞瘤LA N 5细胞的增殖和分化，LipofectamineTM2000能明显增强VEGF ASODN的抑制效果。     

RNA干扰对人神经母细胞瘤VEGF-A表达的抑制作用

目的 构建VEGF-A的短发夹RNA真核表达载体,并通过其介导的RNA干扰抑制人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y VEGF-A的表达.方法 根据VEGF-A的cDNA序列合成两对寡核苷酸片段,退火后分别插入真核表达载体组成重组质粒psc001、psc002,对重组质粒进行PCR、测序鉴定验证并经Western Blot筛选,然后将筛选所得的质粒转染人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y.转染48h后行Annexin V和PI双重标记流式细胞仪检测转染细胞凋亡情况,ELISA检测VEGF-A蛋白的表达水平.结果 PCR和测序证实寡核苷酸片段已成功插入质粒psc001、psc002中,流式细胞仪检测结果 显示转染的外源基因未引起显著的神经母细胞瘤细胞凋亡,ELISA结果 显示转染后细胞株SH-SYSY的VEGF-A蛋白表达受到显著抑制(P<0.05).结论 成功构建人VEGF-A的短发卡RNA真核表达载体,转染人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞后能显著抑制VEGF-A的表达,但没有引起显著的细胞凋亡(P0.05).     

RNA干扰对人神经母细胞瘤VEGF-A表达的抑制作用

目的 构建VEGF-A的短发夹RNA真核表达载体,并通过其介导的RNA干扰抑制人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y VEGF-A的表达.方法 根据VEGF-A的cDNA序列合成两对寡核苷酸片段,退火后分别插入真核表达载体组成重组质粒psc001、psc002,对重组质粒进行PCR、测序鉴定验证并经Western Blot筛选,然后将筛选所得的质粒转染人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y.转染48h后行Annexin V和PI双重标记流式细胞仪检测转染细胞凋亡情况,ELISA检测VEGF-A蛋白的表达水平.结果 PCR和测序证实寡核苷酸片段已成功插入质粒psc001、psc002中,流式细胞仪检测结果 显示转染的外源基因未引起显著的神经母细胞瘤细胞凋亡,ELISA结果 显示转染后细胞株SH-SYSY的VEGF-A蛋白表达受到显著抑制(P<0.05).结论 成功构建人VEGF-A的短发卡RNA真核表达载体,转染人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞后能显著抑制VEGF-A的表达,但没有引起显著的细胞凋亡(P0.05).     

转神经生长因子基因诱导神经母细胞瘤分化的研究

目的观察转染神经生长因子（nerve growth factor，NGF）基因诱导神经母细胞瘤（neuroblastoma，NB）细胞系的分化，探讨NGF在NB细胞分化中的作用。方法取本院住院NB患儿新鲜手术标本，进行原代细胞培养并分离纯化，建立细胞系，作为细胞模型。通过脂质体法介导含有NGF基因的载体质粒转染NB细胞。倒置相差显微镜观察转染前后细胞的形态学变化；MTT法及有丝分裂指数测定细胞增殖的改变。结果转染后的NB细胞表达较高水平的NGF，细胞增殖受到抑制并发生形态学改变。结论所建立的NB为可诱导型，即N型；转染NGF基因的NB细胞表达较高水平的NGF；转染NGF基因的NB细胞系表现为增殖抑制和分化。     

RNA干扰对人神经母细胞瘤VEGF-A表达的抑制作用

目的 构建VEGF-A的短发夹RNA真核表达载体,并通过其介导的RNA干扰抑制人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y VEGF-A的表达.方法 根据VEGF-A的cDNA序列合成两对寡核苷酸片段,退火后分别插入真核表达载体组成重组质粒psc001、psc002,对重组质粒进行PCR、测序鉴定验证并经Western Blot筛选,然后将筛选所得的质粒转染人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y.转染48h后行Annexin V和PI双重标记流式细胞仪检测转染细胞凋亡情况,ELISA检测VEGF-A蛋白的表达水平.结果 PCR和测序证实寡核苷酸片段已成功插入质粒psc001、psc002中,流式细胞仪检测结果 显示转染的外源基因未引起显著的神经母细胞瘤细胞凋亡,ELISA结果 显示转染后细胞株SH-SYSY的VEGF-A蛋白表达受到显著抑制(P<0.05).结论 成功构建人VEGF-A的短发卡RNA真核表达载体,转染人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞后能显著抑制VEGF-A的表达,但没有引起显著的细胞凋亡(P0.05).     

siRNA抑制K562细胞survivin基因的初步研究

目的 利用RNA干扰(RNAi)技术,以survivin为靶基因,设计针对survivin的siRNA,通过Hiperfect介导转染K562细胞,研究survivin基因在白血病发生发展中的作用,为以survivin为靶点的白血病治疗奠定基础.方法 体外化学合成抑制survivin基因的siRNA片段,通过Hiperfect转染到K562细胞内,以无关siRNA、Hiperfect和未转染的细胞为对照,采用SYBR Green荧光染料Ⅰ的实时荧光定量RT-PCR方法检测siRNA的抑制效果,利用流式细胞仪Annexin Ⅴ-FITC/PI法检验细胞凋亡率,用四氮唑盐(MTT)法观察转染后48 h,72 h对细胞增生的影响.结果 siRNA转染K562细胞后,SYBR Green荧光染料Ⅰ的实时荧光定量RT-PCR结果显示survivin mRNA的表达量48 h、72 h分别比空白组下降了85.21%、94.35%,细胞生长受抑制,增殖能力减弱,其增殖抑制率于转染后48 h、72 h分别为45.02%和50.88%,细胞的凋亡率升高,分别为12.28%、21.55%.结论 靶向survivin的siRNA能特异性下调目的基因的表达、并能在体外抑制白血病细胞株的生长.survivin将成为白血病基因治疗的一个新靶点.     

Antisense attenuation of nestin accumulation causes neural tube deformation in rat embryo cultures

ABSTRACT The roles of nestin in neural tube development were studied using immunostaining and antisense experiments in rat embryos. Nestin was detected in the neural tube of embryos of day 10.5 of gestation (E10.5), while no nestin staining was observed in E9.5 embryos in which the neural plate comprised 3 to 4 layers of neuroepithelial cells. As embryos developed, the neural tube became comprised of multiple cell layers and staining was observed in filamentous structures spanning from the ventricular surface to the pial surface of the neural tube. Nestin accumulation was suppressed in the neural tube of embryos treated with nestin antisense oligodeoxynucleotide (ODN). The treated embryos showed two types of neural tube deformation. One type was a thin neural tube which had 3 to 4 layers of neuroepithelial cells and the other was a local distribution of neuroepithelial cells near the basement membrane. While neuroepithelial cells in the neural tube were fewer in embryos treated with nestin antisense ODN than in controls, the percentage of Islet-1-positive neurons relative to the neuroepithelial cells was not different between the treated and control embryos. These results suggested that nestin plays roles in the proliferation of neural tube cells and in the formation and the maintenance of multiple cell layers in the neural tube but not in suppression of development of Islet-1-positive neurons.     

RNA干扰联合小剂量阿糖胞苷对K562细胞增殖、凋亡的影响

目的探讨利用RNA干扰(RNAi)技术沉默同源盒(HOX)A10基因联合小剂量阿糖胞苷(Ara-C)对K562细胞增殖、凋亡的影响,为白血病的基因治疗提供实验依据。方法设计合成针对HOXA10的特异性短发卡RNA寡核苷酸链,构建pGPHI/GFP/Neo-HOXA10真核表达载体并测序,应用阳离子脂质体转染K562细胞。RNAi与小剂量Ara-C单独和联合应用后,应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果成功构建pGPHI/GFP/Neo-HOXA10载体,并转染K562细胞,结果显示该载体能有效降低HOXA10 mRNA表达水平,HOXA10/β-actin灰度比值(ODR)为(38.86±4.49)%;RNAi联合小剂量Ara-C作用于K562细胞后,细胞增殖能力明显下降,细胞增殖抑制率(IR)为(75.58±8.11)%,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);荧光显微镜可见红色荧光凋亡细胞明显增加,凋亡率显著升高,可达(29.71±1.24)%,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论靶向HOXA10的RNAi技术联合小剂量Ara-C能有效抑制K562细胞增殖,并诱导其凋亡,有望成为白血病基因治疗的新方案。     

人端粒酶反转录酶催化酶亚单位基因对肝母细胞瘤细胞株体外生物学特性的影响

目的　研究人端粒酶反转录酶催化酶亚单位 (hTERT)基因对肝母细胞瘤细胞株体外生物学特性的影响。方法　体外将已构建好的正、反义hTERT真核表达载体转染HepG2 肝母细胞瘤细胞株 ,经G4 18及聚合酶链反应 (PCR)筛选鉴定获得分别转入了正、反义hTERT载体的抗性克隆细胞HepG2 s和HepG2 as。运用逆转录 PCR(RT PCR)技术及TRAP 银染法对各组细胞内源性hTERTmRNA的表达及端粒酶的活性进行了检测 ;同时还采用MTT法、双层软琼脂克隆形成试验、流式细胞术观察和分析了反义hTERT对肝母细胞瘤细胞体外生长增殖活力的影响及是否能诱导瘤细胞的凋亡。结果　与空白对照组、正义hTERT组相比 ,反义hTERT能显著降低HepG2 细胞内源性hTERTmRNA的表达 (n =10 ,t =7 6 1,P <0 0 1)和下调端粒酶活性。当各组细胞传至第 2 0代后 ,与HepG2 、HepG2 s比较 ,HepG2 as细胞的生长速度和集落形成能力明显地减慢和降低 (n =10 ,t=4 5 4 ,P <0 0 1和n =10 ,t=3 96 ,P <0 0 1) ,同时伴有凋亡率的显著增加 (n =10 ,t=9 2 4 ,P <0 0 1和n =10 ,t=8 37,P <0 0 1)。结论　反义hTERT体外可抑制肝母细胞瘤细胞的生长增殖能力 ,在抗肿瘤基因治疗中具有特异的靶向性和潜在应用的广谱性     

RNAi阻断NPM-ALK基因表达及对大细胞间变性淋巴瘤细胞的影响(英文)

目的：应用RNA干扰技术抑制大细胞间变性淋巴瘤细胞系(Karpas299)中NPMALK融合基因表达,观察其对肿瘤细胞生长的影响。方法：针对NPMALK融合位点设计两个siRNA序列siRNAI与siRNAII,经PCR反应构建含U6启动子siRNA正义和反义线性表达载体,通过脂质体转染Karpas299细胞,应用实时荧光定量RTPCR、Westernblot检测siRNA片段对NPMALKmRNA和蛋白表达的抑制作用,MTT、Hoechst荧光染色检测siRNA对肿瘤细胞生长的影响。结果：siRNAI可导致NPMALKmRNA下降约75%(P<0.05),转染72h后可导致蛋白表达下降;转染siRNAII细胞NPMALKmRNA下降为35%(P<0.05),但蛋白水平无明显改变。转染siRNAI的细胞可抑制Karpas299细胞的增殖和诱导凋亡发生,siRNAII则无明显的抑制增殖和诱导凋亡作用。结论：含有针对NPMALK融合位点特异siRNA序列的U6表达载体,可特异地抑制NPMALK基因mRNA和蛋白的表达,并能抑制大细胞间变性淋巴瘤肿瘤细胞株Karpas299细胞的增殖,导致肿瘤细胞凋亡增加,提示NPMALK融合基因的异常表达与大细胞间变性淋巴瘤形成密切相关,为研究NPMALK基因功能和大细胞间变性淋巴瘤基因靶向治疗提供了新策略。     

短发夹RNA介导调节S100A4表达对子宫内膜癌KLE细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨应用短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)调节子宫内膜癌KLE细胞中S100A4基因表达,对KLE子宫内膜癌的细胞增殖和凋亡的影响.方法 通过利用慢病毒shRNA技术,将S100A4-OVER、S100A4-shRNA转染进子宫内膜癌KLE细胞,应用无源性的OVER-NC细胞株和shR...     

RNA干扰沉默HOXA9基因逆转U937细胞多药耐药

目的采用小干扰RNA(siRNA)沉默HOXA9基因,探讨siRNA转染后人白血病细胞株U937能否逆转化疗药物的耐药性。方法设计合成针对HOXA9的特异性siRNA寡核苷酸链,应用阳离子脂质体介导瞬时转染U937细胞。实验分为3组:实验组(脂质体转染靶向HOXA9的siRNA)、细胞对照组(仅加等量细胞及培养基)和阴性对照组(脂质体转染阴性对照siRNA)。利用反转录(RT)-PCR法、蛋白免疫印迹法分别检测各组细胞HOXA9 mRNA、蛋白的表达;四甲基偶氮唑蓝法(MTT)、流式细胞术检测U937细胞转染前后对长春新碱(VCR)、依托泊苷(VP-16)的敏感性及凋亡率变化。结果靶向HOXA9的siRNA可有效沉默HOXA9的表达,HOXA9 mRNA及蛋白相对水平明显下降。siRNA转染后实验组U937细胞可明显增加对VCR、VP-16的敏感性,实验组细胞的半数抑制浓度值显著低于细胞对照组及阴性对照组(Pa<0.05)。流式细胞术检测结果表明,siRNA干扰后实验组细胞联合化疗药物较细胞对照组及阴性对照组细胞凋亡率显著增高(Pa<0.05)。而阴性对照组与细胞对照组之间差异均无统计学意义(Pa>0.05)。结论靶向HOXA9的siRNA可有效沉默HOXA9基因表达,增加其对VCR、VP-16的敏感性,能逆转白血病细胞对化疗药物的耐药性。