不同年龄人骨髓间充质干细胞体外培养增殖的研究

目的本研究分析不同年龄段人骨髓间充质干细胞的生长和增生情况,探讨年龄对于骨髓间充质干细胞的影响。方法采集61例不同年龄人的骨髓,分为少年组、中青年组和老年组,分离间充质干细胞,进行体外培养,观察其形态变化,对比分析其首次传代和每次传代时间、细胞克隆形成数量、细胞增长曲线的变化情况。结果体外培养的干细胞在形态上无年龄差异,均成梭形纤维状,早期呈克隆状生长。细胞的首次传代时间从少年到老年呈逐渐增加的趋势,老年组明显长于另外两组;3组的体外培养倍增时间无明显差异,但老年组的干细胞克隆数量减少（差异尚未达到统计学意义）,细胞的增殖显著低于另外两组（P<0.05）。结论人骨髓间充质干细胞的生长增殖能力随着增龄而逐渐减退,尤其在老年组呈现出更明显的变化。     

人骨髓间充质干细胞体外培养及其生物学特性分析

目的探讨人骨髓间充质干细胞（MSC）的体外分离培养方法,并分析其生物学特性。方法无菌条件下抽取健康志愿者骨髓,采用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞,培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中,用贴壁筛选法纯化获得MSC。相差显微镜下观察细胞形态学变化,细胞计数法绘制生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面抗原及细胞周期。结果原代和传代培养的细胞呈梭形,具有较强的生长增殖能力。细胞表面CD90、CD105表达阳性,CD34、CD11b阴性。第1、3、5代MSC生长曲线呈S形,均经历潜伏期、对数生长期和平台期。第3代MSC中,G0/G1期细胞约占77.42%,S＋G2/M期细胞约占22.58%。结论采用密度梯度离心结合贴壁筛选培养法可获得纯度较高的MSC,且该细胞增殖活性较强。密度梯度离心结合贴壁筛选培养法是一种简单、有效的分离纯化MSC的方法。     

老龄兔骨髓间充质干细胞体外培养影响因素的研究

目的研究体外培养老龄兔骨髓间充质干细胞(MSCs)的影响因素。方法以密度梯度离心技术及贴壁筛选法相结合,在体外分离检测MSCs表面CD29、CD34、CD44、CD45的表达;诱导分化反向证明部分细胞可分化为成骨细胞及脂肪细胞,具有分化潜能,鉴定该细胞群为干细胞。细胞记数法计算MSCs倍增时间;观察供体自然老龄情况下,不同换液时间、不同血清浓度、不同种植密度等因素对MSCs生长的影响。结果MSCs CD29和CD44表达阳性,不表达造血干细胞标志CD34和CD45。高密度接种(3×106~4×106个/cm2),低浓度(8%~10%)血清的低糖DMEM培养,在体外可保持MSCs未分化增殖状态,并获得纯度较高同源性较好的干细胞群,高浓度血清(20%)并不加速细胞生长,而促进分化。结论MSCs具有体外多分化潜能,老龄供体骨髓中MSCs的生长、增殖特性受不同换液时间、不同血清浓度及不同种植密度等因素的影响。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为心肌样细胞的实验研究

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养及向心肌样细胞转化的条件。方法获取成年大鼠胫骨干骨髓,采用贴壁法进行间充质干细胞的培养、传代,观察经5-氮胞苷诱导后骨髓间充质干细胞的生长和分化。结果大鼠骨髓基质细胞贴壁呈集落生长,5-氮胞苷诱导骨髓基质细胞转化为心肌样细胞。结论骨髓基质细胞能够在体外被诱导分化为心肌样细胞,为自体心肌细胞移植提供了一种良好的来源。     

兔骨髓间充质干细胞体外成内皮细胞能力的研究

目的　探讨骨髓间充质干细胞体外扩增及其向内皮细胞定向分化能力。方法　无菌条件下采集兔骨髓 ,肝素抗凝 ,经淋巴细胞分层液密度梯度离心分离骨髓单个核细胞 ,通过贴壁培养法获得MSC ,然后在内皮细胞生长环境中进行诱导分化 ,最后对扩增的细胞特征进行鉴定 ,同时初步研究其体外成血管特性。结果　MSC每扩增一代 ,细胞数量增加 5～ 8倍 ,7.6 5× 10 3 个原代MSCs体外扩增 3代即获得 1.2 6× 10 8个细胞。在 70 %～80 %融合时呈现“铺路石”样形态 ,细胞免疫组化证实扩增细胞表达CD31和vonWillebrandfactor(vWF) ,具有吞噬ac LDL的功能 ,且扩增细胞在体外参与网状血管样结构形成。结论　MSC扩增能力强 ,在体外能诱导其向内皮细胞方向分化。     

脑瘫患者骨髓间充质干细胞体外培养特性分析

目的分析不同年龄脑瘫患者骨髓间充质干细胞(Human mesenchymal stem cells,hMSCs)体外增长速率及细胞的传代时间,为其临床应用提供参考。方法选取38例脑瘫患者,其中1～3岁11例(婴幼儿组)、4～6岁9例(学龄前组)、7～19岁10例(学龄组),20～35岁8例(成人组),使用离心贴壁法分离各组骨髓hMSCs,体外培养,保留贴壁细胞传代。观察各组hMSCs的P0及P1、P2、P3、P4代细胞传代时间;计算P0及P1、P2、P3、P4代细胞的增长速率。结果各组P0～P1、P1～P2传代时间相近,成人组P2～P3和P4～P5传代时间明显长于其余三组,各组P4～P5传代时间均明显长于P1～P2传代时间;成人组P0代和P1代细胞增长速率明显慢于其他三组,婴幼儿组和学龄前组P4代细胞增长速率明显慢于P1代细胞;各年龄组P4代细胞增长速率相近。结论脑瘫患者自体hMSCs是理想的种子细胞,且<20岁患者的hMSCs培养速度快,生长效率高。     

SD大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养及表型、纯度鉴定

目的探索获得高纯度MSCs简单、系统的实验方法。方法采用贴壁培养法体外培养SD大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）,确定最佳接种密度,经数次传代后纯化,以表面抗原CD29、CD44作为标志分子,CD34作为阴性对照,免疫荧光法鉴定MSCs的生物学特性及纯度。结果以0．5—1×10^10个／L的细胞密度接种骨髓细胞原代培养时间明显缩短,免疫荧光法鉴定MSCs生物学特性好,第3代时已达较高纯度。结论本实验建立了较为理想的MSCs体外培养体系,纯化速度快,鉴定方法简单,为进一步研究MSCs生物学行为及临床应用奠定了基础。     

骨髓间充质干细胞心肌样分化的微环境因素

目的:探讨促使骨髓间充质干细胞(MSCs)心肌样分化的微环境因素。方法:分离大鼠MSCs并传至第6代,随机分为混合培养组、条件组及对照组,分别将MSCs与大鼠心肌细胞共同培养(混合培养组),或将心肌细胞培养上清液加入MSCs培养体系(条件组)。1周后,检测MSCs的心肌特异性蛋白titin、Cx43及MHC表达情况。结果:MSCs能在心肌细胞培养上清液及与心肌细胞共同培养中正常生长;条件组MSCs表达titin、Cx43显著增加,但未观察到肌小节样结构;混合培养组MSCs可表达上述蛋白,且部分细胞中可观察到肌小节样结构,与心肌细胞交界面上有Cx43的聚集。3组MSCs均未检测到MHC表达。结论:心肌细胞自身、源于心肌的体液因素及MSCs分化过程中形成的感应器是MSCs心肌样分化的必要条件。     

人骨髓间充质干细胞体外长期传代培养及恶性转化趋势实验研究

目的 探讨人骨髓间充质干细胞体外长期传代培养、扩增及其生物学特性,观察其恶性转化趋势的可能性.方法 采用密度梯度离心差速贴壁法对人骨髓来源的间充质干细胞进行分离纯化,并进行体外长期传代,观察细胞形态及生长方式;鉴定细胞分化能力;相关癌标志P53、Ki67的表达与成瘤性检测.结果 经过长期体外培养的人间充质干细胞,至36代时,细胞逐渐老化;成骨分化诱导能力丧失;相关癌标志表达阴性;无成瘤性.结论 人骨髓间充质干细胞在体外可以有限传代,无显著恶性转化趋势.     

人骨髓间充质干细胞的生物学特性分析

目的对人骨髓间充质干细胞（HMSCs）的生物学特性进行初步分析,为其临床应用奠定基础。方法抽取4例健康人髋骨内骨髓5～20ml,密度梯度离心法分离HMSCs。体外培养扩增后流式细胞仪检测HMSCs表面标记物;MMT法绘制生长曲线,计算细胞倍增时间;吉姆萨染色法检测细胞核型。结果HMSCs表面标记物CD29、CD44、CD71、CD105、CD166、HLA-ABC、UEA-1阳性表达;CD34、CD45、HLA-DR阴性表达;生长曲线呈S形,细胞倍增时间随代次增加而延长;核型分析显示第3、6代HMSCs的染色体数目未发生改变。结论密度梯度离心法可得到纯度较高的HMSCs,表可达人类间充质干细胞的表型特征。HMSCs可在体外较长时期培养。在第7代之前细胞增殖旺盛,之后细胞增殖能力逐渐下降;在第6代之前染色体数目未发生改变。     

骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌细胞

目的观察5-氮杂胞苷(5-aza)体外诱导分化骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)成为心肌细胞的作用,并为进一步体内研究而进行细胞标记.方法提取小型猪骨髓20ml,体外分离培养骨髓间充质干细胞,分为对照组和诱导组,其中诱导组在培养第3天加入5-aza(10 μmol/L),分别在培养2周和4周时观察两组细胞光镜、电镜下形态,4周时进行磷钨酸-苏木素染色(PTAH)和肌动蛋白(actin)免疫组化染色.诱导组MSCs加入5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU,5μg/ml),分别在作用后第2周和第4周,利用BrdU单克隆抗体免疫组化检测BrdU标记方法.此外,用含有LacZ基因的复制缺陷腺病毒转染诱导组MSCs,利用X-gal染色检测LacZ基因表达的半乳糖苷酶,观察诱导分化后MSCs的体外标记情况.结果体外能够成功地分离骨髓MSCs,5-aza诱导分化2周和4周后的MSCs在光镜下明显成为梭形,形态类似肌细胞.电镜下诱导分化后的MSCs在2周时出现肌丝结构,4周时肌丝明显增多.PTAH染色显示超过70%的细胞具有横纹肌的染色性质,actin免疫组化染色显示超过80%的诱导后MSCs肌动蛋白呈阳性表达.体外BrdU单克隆抗体检测BrdU掺入到MSCs细胞核中,X-gal染色证明LacZ基因能够进入MSCs并表达,两种体外标记方法在标记2周和4周时都为阳性.结论5-aza能够诱导骨髓MSCs成为心肌细胞,BrdU掺入和含有LacZ基因的复制缺陷腺病毒转染能够成功对诱导分化后MSCs进行标记,并且标记持续至少4周.     

An Inhibitor of Stem Cell Proliferation in Normal Bone Marrow

S ummary . A saline extract from normal bone marrow cells having a molecular weight in the range 50 000–100 000 daltons has been found to protect rapidly proliferating haemopoietic spleen colony forming cells (CFU_s) from the lethal effects of large doses of tritiated thymidine. This extract is non-toxic to the cells. It is not found in regenerating marrow where the CFU_s population is rapidly proliferating. Its effect appears to be specific for the CFU_s since it has no effect on the proliferation of its close descendant, the granulocytic precursor cell (CFU_c), and no effect on the average cytoplasmic structuredness of the whole bone marrow cell population. The active material is probably protein since it is degraded by trypsin.     

同种异体骨髓间充质干细胞移植对扩张型心肌病心功能衰竭大鼠左心室功能的影响

目的探讨同种异体大鼠骨髓间充质干细胞移植在阿霉素诱导的扩张型心肌病心功能衰竭大鼠心脏内存活、分化的情况及对左心室功能的影响。方法雌性Wistar大鼠55只,随机分成正常对照组(n=10)、模型组(n=15)、诱导前移植组(n=15)和诱导后移植组(n=15)。体外分离培养雄性大鼠骨髓间充质干细胞,传至一代后用10μmol/L5-氮胞苷诱导4周,DAPI标记后,诱导前移植组移植诱导前的骨髓间充质干细胞,诱导后移植组移植诱导后的骨髓间充质干细胞;4周后检测左心室功能及移植细胞存活、分化情况。结果异体骨髓间充质干细胞移植4周后可存活并分化成心肌细胞,表达心肌细胞特异性蛋白;与模型组比较,细胞移植组左心室功能明显改善,且两细胞移植组间差异无显著性。结论同种异体骨髓间充质干细胞移植4周后可存活并分化成心肌细胞,对扩张型心肌病心功能衰竭大鼠的左心室功能有保护作用。     

犬骨髓间叶干细胞体外定向诱导分化心肌细胞的实验研究

目的:旨在建立骨髓间叶干细胞(MSCs)体外定向诱导分化心肌细胞的方法,为心肌疾患的移值修复治疗提供成体干细胞来源.方法:利用Percoll密度梯度法及MSCs黏附贴壁生长特性进行分离培养与扩增骨髓MSCs,并予以鉴定证实.应用5-氮胞苷对培养早期的骨髓MSCs进行定向诱导分化心肌细胞.通过细胞形态学、细胞免疫组化、透射电镜等技术观察分化细胞的肌管,心肌细胞特异性蛋白与细胞特异性超微结构以鉴定诱导分化的效果.结果:利用Percoll密度梯度法与细胞黏附贴壁生长特性,可分离培养与扩增足量骨髓MSCs.应用化学诱导剂5-氮胞苷10～20 μmol/L孵育早期培养的骨髓MSCs4～5周,可见细胞形成肌管;肌细胞特异性蛋白α-肌动蛋白,肌球蛋白以及心肌细胞特异性分子标志肌钙蛋白I免疫组化染色阳性;透射电镜可见肌丝与房性颗粒.结论:骨髓MSCs可在体外5-氮胞苷的诱导下定向转化为具有典型结构的心肌细胞.     

骨髓干细胞移植与缺血性心脏病

近些年来 ,国内外大量动物实验研究及临床应用研究表明 ,骨髓干细胞移植在缺血性心脏病治疗上具有极广阔的前景 ,从而为人类解决缺血性心脏病这一公共卫生问题带来新的希望。本文就骨髓干细胞移植在缺血性心脏病中应用进展作一综述。     

骨髓干细胞移植治疗在心血管疾病的研究进展

心血管疾病仍是全球主要的死亡原因,它的最终结局都是心力衰竭,其共同特点是有完整舒缩功能的心肌细胞数量相对和绝对减少,受损心肌由纤维组织瘢痕修复。骨髓干细胞移植治疗在心血管疾病领域是一种很有前景的治疗手段。现针对骨髓干细胞概念、分类及在心血管疾病方面的研究进展等进行综述。     

骨髓间充质干细胞及其在缺血性脑血管病中的应用

骨髓间充质干细胞是骨髓中的一群非造血干细胞，具有较强的自我更新能力和多向分化潜能，在体外不同诱导条件下可分化为骨细胞、神经细胞和平滑肌细胞等多种细胞。骨髓间充质干细胞已应用于缺血性脑血管病的治疗研究。文章对骨髓间充质干细胞及其在缺血性脑血管病中的应用做了综述。     

骨髓间充质干细胞拮抗氧化型低密度脂蛋白

目的 探讨骨髓间充质干细胞(MSC)对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡的影响及有关机制.方法 将对数生长期的HUVEC分成三组:对照组单纯培养HUVEC;ox-LDL组的HUVEC给予100 mg/L ox-LDL培养24 h;ox-LDL+ MSC组使用细胞培养池共同培养HUVEC和MSC,并加入100mg/L ox-LDL培养24 h.采用流式细胞术检测HUVEC的凋亡情况,采用ELISA检测细胞培养上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和血管内皮生长因子(VEGF)的含量,并通过Real-timePCR检测HUVEC中凋亡相关基因Bcl-2与Bax mRNA的表达情况.结果 在100 mg/L ox-LDL作用24 h后,细胞凋亡率明显上升,细胞培养上清液中TNF-α、VEGF含量明显上升,Bcl-2 mRNA表达下调,而Bax mRNA表达上调.MSC与HUVEC共培养可增加上清液中VEGF含量,减少TNF-α含量,上调Bcl-2 mRNA表达,下调Bax mRNA表达,使内皮细胞凋亡率明显下降.结论 MSC可以拮抗ox-LDL诱导的血管内皮细胞凋亡,可能与其分泌VEGF、抑制炎性反应并上调Bcl-2 mRNA表达及下调BaxmRNA表达有关,为MSC治疗动脉粥样硬化等内皮损伤性疾病进一步提供了理论基础.