应用DNA测序技术检测血友病B患者FⅨ基因突变

为了研究3名中国汉族非亲缘系血友病B患者凝血因子Ⅸ（FⅨ）基因突变的类型,常规检测患者血浆APTT及FⅨ：C,进行表型诊断;抽提患者外周血白细胞基因组DNA,应用PCR技术分8段扩增FⅨ基因外显子序列,用双脱氧终止法检测核酸序列,结果表明：与正常对照者相比,HB患者APTT测定值明显升高,FⅨ：C测定值明显降低,胛测定值正常、测序结果显示3例HB患者均有相应的基因序列改变,患者1有外显子6G22119A点突变,患者2有外显子1G7932C点突变,患者3有外显子T32685C点突变。结论：3例HB患者均检测到相应的基因序列改变,这为HB患者基因缺陷的分子机制提供了证据.     

中国汉族血友病B家系五种新的FⅨ基因突变的研究

目的探讨中国汉族无关血友病B家系先证者的凝血因子Ⅸ基因的突变和发病的分子机制。方法对19例中国汉族无关血友病B家系先证者，静脉采集各家系先证者外周血，表型诊断确诊后，用PCR对FⅨ8个外显子及其侧翼序列进行扩增，用末端标记双脱氧法检测核酸序列。结果19例血友病B家系先证者均检测到相应的基因序列的改变。结论19例中国汉族无亲缘关系的血友病B家系先证者FⅨ基因在编码外显子的核苷酸部位均发现有基因突变，其中发现五种新的突变，即6444T→A（Cys23Stop）；10497G→C（Cys82Ser）；31101G→T（Arg327Ile）；31102InsertT；30984T→G（Ile288Ser）为国际上首次报道。     

三个血友病B家系的基因诊断

目的 探讨中国汉族3个无关血友病B家系先证者凝血因子Ⅸ(FⅨ)基因突变及分子发病机制,对家系女性成员进行携带者诊断.方法 家系先证者及成员采静脉血,先证者表型诊断确诊后,检测先证者及其家系成员6个STR位点的基因多态性,进行家系遗传连锁分析,应用PCR法对先证者及可疑携带者FⅨ8个外显子及其侧翼序列进行扩增,用末端标记双脱氧法检测核酸序列.结果 家系1先证者FⅨ基因外显子6发现G22119A突变,家系2先证者FⅨ基因外显子2发现G7392C突变,家系3先证者FⅨ基因外显子8发现T32685C突变.结论 血友病B先证者FⅨ基因缺陷是其发病的分子机制.     

凝血因子Ⅸ的研究进展

本文综述了凝血因子Ⅸ(F Ⅸ)的结构与激活、基因多态性和突变、F Ⅸ抗原和活性检测、F Ⅸ基因突变检测以及血友病B基因治疗的研究进展。     

高分辨率熔解曲线分析在血友病B F9基因突变检测中的应用

目的 利用高分辨率熔解曲线(HRM)技术建立简便有效的血友病B(HB)基因诊断的方法.方法 收集2005年1月至2010年6月就诊于上海瑞金医院的55例HB患者的外周血标本,抽提外周血基因组DNA.采用PCR扩增结合测序的方法对40例HB患者进行F9基因突变检测,利用其中21例带有F9基因1～7号外显子突变的HB患者标本建立相应的HRM突变筛查方法.采用F9基因1～7号外显子的PCR-HRM突变筛查方法及8号外显子的DNA直接测序方法,对15例未知F9基因突变的HB患者进行基因诊断.结果 通过PCR扩增结合测序,40例HB患者均检测到F9基因突变.21例带有F9基因1～7号外显子突变的HB患者标本中,19例(90％)患者的突变可通过PCR-HRM技术进行检测.通过F9基因1～7号外显子PCR-HRM突变筛查及8号外显子的DNA直接测序,15例未知F9基因突变的HB患者均检测到F9基因突变.55例HB患者中共检测到34种F9基因突变.结论 HB基因诊断的新方法,即PCR-HRM筛查F9基因1～7号外显子突变结合8号外显子的DNA测序法操作简便、结果可靠.     

40例血友病乙患者的基因分析及发病机制研究

血友病乙(Hemophilia B,HB)为X染色体连锁的隐性遗传性出血性疾病,其发病机制多为凝血因子IX(F9)基因突变致凝血因子IX缺乏或结构功能的异常。本研究对40例明确诊断为血友病乙的男性患者进行基因序列分析以寻找其分子发病机制并为遗传学咨询奠定基础。2009年6月-2012年6月收集血友病乙男性患者40例,均根据临床表现、血浆凝血因子IX活性检测及家族史等资料确诊。常规方法收集患者及亲属血样,分离血细胞和血浆,提取DNA,用聚合酶联反应(PCR)扩增结合直接测序法分析先证者的F9基因的所有外显子及其侧翼序列,并将测序结果和国际F9基因突变数据库进行比对,发现突变后排除多态性。结果表明,对40例HB患者基因分析共发现34种基因突变,突变类型包括插入框移突变2种,无义突变6种,剪切位点的突变2种,错义突变24种,其中29种突变为已报道的突变类型,5种突变在国际上未见报道。34种突变中发生在信号肽序列的有2种,前肽及γ-羧基化结构域的有7种突变,表皮生长因子样结构域有7种,活化肽区域有3种,丝氨酸蛋白酶催化结构域有15种突变。结论:40例HB患者的基因分析表明F9基因突变具有明显的异质性,且错义突变仍是目前F9基因的主要突变方式,与重型HB有更密切的联系。F9基因突变所常见的外显子部位与他们编码的氨基酸在蛋白行使功能时所起的作用有关。直接进行基因测序及短串联重复序列连锁分析将会对血友病乙的携带者诊断及产前诊断提供了一种快速、准确的诊断方法。     

10例血友病B患者凝血因子Ⅸ基因突变分析

血友病B(HB)系凝血因子Ⅸ(FⅨ)基因缺失、突变或重排所致的X染色体性连锁隐性遗传病,占血友病的11％ ～15％.男性发病率为1/30000,女性罕见[1].70％的患者有家族史,30％为散发病例,发病原因均为FⅨ基因突变[2].FⅨ基因序列于1982年被完整克隆[3],并于1985年完成测序[4].本研究我们采用PCR及基因测序技术对10例HB患者进行基因分析,初步探讨HB的分子机制,以期应用于HB家系中FⅨ基因携带者的诊断及产前诊断. 对象和方法 1.研究对象:2010年2月至2012年5月期间广西医科大学第一附属医院收治的10例男性HB患者纳入本研究.所有患者的诊断和分型均符合《血友病诊断与治疗中国专家共识》[5].进入本研究前患者均签署知情同意书. 2.标本采集、处理及DNA提取:采集10例患者外周静脉血,枸橼酸钠抗凝,检测APTT及FⅨ活性,12000 r/min离心(离心半径8 cm)2 min后,移除上清,保留沉淀并提取基因组DNA,DNA提取试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司产品,按说明书操作,提取的DNA于保存于-20℃备用.     

FⅨ基因全外显子测序技术在血友病B基因携带者检测及产前基因诊断中的应用

目的 探索应用FⅨ基因全外显子测序技术进行血友病B(HB)基因携带者检测和产前基因诊断.方法 在取得5个无血缘关系的汉族HB家系成员知情同意后,采集相关家系成员标本.3个产前诊断标本中,2例为胎儿脐血标本,1例为羊水标本.从标本中提取基因组DNA,通过PCR扩增FⅨ基因所有外显子及其侧翼序列,将产物进行全外显子直接测序.结果 5个家系的HB患者以及FⅨ基因携带者共检出5种突变:c.484 C＞T (p.R162X)、c.1022G＞A(p.R341Q)、c.1135C＞T(p.R379X)、c.799C＞T(p.H267Y)和c.1232G＞T(p.S411I).在产前诊断中,发现1例c.484 C＞T(p.R162X)突变,另2例未检出FⅨ基因突变的胎儿出生后血浆FⅨ促凝活性分别为52.7％和76.2％.结论 首次报道中国汉族HB家系FⅨ基因c.1022G＞A(p.R341Q)、c.1135C＞T(p.R379X)、c.799C ＞T (p.H267Y)和c.1232G＞T(p.S411I)突变;在严格的质量控制下,FⅨ基因全外显子直接测序是一种快速准确的诊断HB基因携带者及产前基因诊断的方法.     

F9基因Arg327Ile新突变导致血友病B的分子发病机制研究

目的探讨F9基因Arg327Ile(R327I)突变导致血友病B的分子发病机制研究。方法对1名血友病B患者作实验室和基因诊断,定点突变法构建F9基因R327I突变的表达质粒;瞬时转染HEK293细胞,一期法检测细胞上清液中凝血因子Ⅸ活性(FⅨ∶C),ELISA法检测细胞上清液和裂解中FⅨ抗原(FⅨ∶Ag),Western blotting检测R327I突变蛋白的分子量及表达量;免疫荧光共定位染色法检测突变蛋白在内质网和高尔基体内分布。结果瞬时表达显示该患者突变细胞标本上清液中R327I突变型FⅨ∶C为野生型的4.49%,明显降低;细胞上清液和裂解液FⅨ∶Ag分别为野生型的31%和129%,为交叉反应物质减低型(CRMR)。Western blotting显示细胞上清液中R327I突变蛋白分子量与野生型相同,但含量比野生型明显降低;免疫荧光共定位染色显示R327I突变蛋白在内质网中分布较野生型多,而在高尔基体中较野生型少。结论 F9基因R327I突变影响蛋白质合成和分泌,突变蛋白较野生型表达量偏低,同时R327I突变蛋白存在凝血功能缺陷从而导致血友病B。     

桂林地区乙肝患者HBV核苷类似物耐药位点分析

检测桂林地区乙型肝炎患者体内HBV逆转录酶基因的耐药突变情况,为制订合理的治疗方案提供依据.方法:提取乙肝患者血清中HBV DNA,巢式PCR扩增其逆转录酶基因后测序,Vector NTI Suite 8.0及chromaslite201分析测序结果,Mega4.0进行基因分型.结果:171例患者测序结果中18例发现有基因耐药突变,其中rtA181位点突变7例,占突变总数的38.9％.多药耐药基因突变12例,点突变总数的66.7％.B基因型患者耐药突变率为10.4％,C基因型患者耐药突变率为10.8％,两基因型分布比率的差异无统计学意义(P＞0.05).结论:桂林乙肝患者HBV逆转录酶基因耐药突变组合较为复杂,多药耐药基因突变比率较高.耐药突变的HBV基因型分布比率在所检测患者中无明显差异.     

甲型血友病的基因诊断研究

目的 建立甲型血友病的基因诊断方法.方法 对33例甲型血友病患者以一期法检测血浆凝血因子FⅧ(F8)活性.采用长距离聚合酶链式反应扩增法(LD-PCR)进行FⅧ内含子22倒位检测,并对反应体系进行优化;聚合酶链式反应(PCR)技术检测内含子1倒位,凝胶成像技术分析扩增产物.捕获测序技术检测是否存在其他突变类型.结果 33例患者的FⅧ活性检测结果均小于1%,为重型;LD-PCR技术检测出13例患者存在Int22倒位,倒位发生率为39.4%;Int1倒位患者1人,发生率3%;对13例内含子 22倒位患者进行测序比对,未发现其他基因突变.结论 LD-PCR技术和多重PCR技术可以有效的检测重型甲型血友病FⅧ的基因倒位.     

血友病携带者与产前基因诊断

目的建立1种简便、快速的血友病携带者检测与产前诊断体系。方法对38个血友病A家系,用长链PCR及序列特异PCR作F8基因内含子22及1倒位检测;有家族史家系可联合F8基因内外的8个多态性位点进行遗传连锁分析,DXS 52(ST14)位点多态性以PCR产物凝胶电泳法检测,7个STR位点(F8C ivs13、CA22、DXS15、DXS9901、G6PD、DXS1073、DXS1108)的多态性以多重荧光PCR法检测,产前诊断加用性别位点(Amelo);对于散发家系,通过直接核苷酸测序查找先证者的基因突变,继而对家系女性成员作携带者与产前诊断。对12个血友病B家系采用直接核苷酸测序法确定基因突变,多重荧光PCR法检测F9基因外6个STR位点(DXS1192、DXS1211、DXS8094、DXS8013、DXS1227、DXS102)的多态性。结果38个血友病A家系中,10名先证者的F8基因内含子22倒位检测为阳性,1例先证者为F8基因内含子1倒位阳性,对于有家族史的家系,综合应用倒位检测和遗传连锁分析,携带者与产前诊断率均为100%;4个散发家系均可找到致病突变;38个血友病A家系的携带者及产前诊断总诊断率为94.81%。12个血友病B家系中有10个家系通过直接测序可找到突变,联合F9基因外6个STR位点对血友病B家系的遗传连锁分析的可诊断率为96.88%。结论F8基因内含子22及1倒位筛检联合F8基因内、外多个位点的遗传连锁分析可以进行血友病A的携带者及产前诊断;直接核苷酸测序可确定F9基因突变,而联合基因外多个多态性位点检测并进行遗传连锁分析,是血友病B携带者检测与产前诊断的简便、快速的方法。     

因子Ⅸ portland:一种无义突变(CGA→TGA)所致的血友病乙

血友病乙约占血友病的四分之一.其发病原因是因子Ⅸ(FⅨ)的基因缺陷.已报道FⅨ基因缺陷有30余种.作者研究了一个有三例血友病患者的家系,其FⅨ活性均在正常1%以下,FⅨ抗原稍高于1%.将此家系患者的DNA提取后用TaqⅠ、EcokⅠ及HindⅢ酶解,以cDNA探针杂交,由Southern印迹杂交结果表明此家系为FⅨ外显子8的第一个TaqⅠ位点(TCGA)的突变.作者进一步合成了     

1例血友病病人行玻璃体切割手术的围术期护理

血友病(hemophilia)是一组性联隐性遗传的出血性疾病,其临床上分为血友病A型[凝血因子Ⅷ(FⅧ)缺陷症]和血友病B型[凝血因子Ⅸ(FⅨ)缺陷症]两种类型,分别由FⅧ和FⅨ基因突变所致.在男性人群中,血友病A型的发病率为1/5000,血友病B型的发病率为1/25 000;所有血友病男病人中,A型血友病占80%～85%,B型血友病占15%～20%.而女血友病病人极其罕见[1].近日,我病房收治1例血友病A型病人,其因外伤致右眼玻璃体积血,需行玻璃体切割术,住院期间对该病人进行替代疗法、对症治疗和眼部手术,治疗效果满意.现介绍如下.     

两个同源重组血友病家系的基因诊断

目的探讨特殊血友病家系的基因诊断。方法通过FⅧ基因内含子22倒位及内含子1倒位的直接检测与遗传连锁分析的间接诊断相结合对1个血友病A（HA）家系进行基因诊断；采用核酸直接测序法对FⅨ各外显子及其侧翼序列进行检测，并联合FⅨ基因相关的6个微卫星（STR）位点对1个血友病B（HB）家系进行基因诊断。结果HA家系先证者为FⅧ内含子1倒位阳性，家系中要求做携带者诊断的女性成员为内含子1倒位携带者；而FⅧ基因内外8个多态性位点遗传连锁分析证实该女性成员发生同源染色体重组。HB家系先证者除7号外显子测序未成功外，其余部分均未找到突变，家系中要求做携带者与产前诊断的女性，其羊水细胞经直接核酸测序未找到突变，利用FⅨ相关的6个STR位点进行遗传连锁分析发现该女性有染色体同源重组现象存在，胎儿为正常男性。结论在应用间接诊断方法进行HA和HB的携带者及产前基因诊断时，要考虑到染色体同源重组现象的发生可能导致误诊与漏诊的情况。在中国人群中应该开发更多的FⅧ和FⅨ分子中信息量大的多态性位点，以提高HA和HB的携带者及产前诊断的准确率。     

非小细胞肺癌EGFR基因突变与扩增的比较及其与血清CEA水平的关系

目的 比较分析非小细胞肺癌(NSCLC)表皮生长因子受体(EGFR)基因突变与扩增的关系,并探讨其与血清癌胚抗原(CEA)水平有无相关性. 方法 对270例确诊非小细胞肺癌的肺组织标本(包括手术切除及经纤支镜活检取得)用实时荧光定量PCR法技术检测EGFR基因突变状态,用荧光原位杂交技术检测EGFR基因的扩增情况.治疗前抽取患者静脉血,用化学发光法检测血清CEA水平. 结果 270例NSCLC中EGFR基因突变率为31.11％,EGFR基因扩增率为20％,基因突变并扩增的占10.74％.基因突变组、基因扩增组、基因突变并扩增组和基因无突变无扩增组血清CEA平均水平分别为[3.03(1.68-6.22)] ng/mL、[3.19(1.8-17.17)]ng/mL、[3.39(1.85-20.87)] ng/mL和[2.54(1.5-4.62)] ng/mL.基因突变组与基因扩增组、基因突变组与基因无突变无扩增组血清CEA比较无显著性差异(P＞0.05).基因扩增组与基因无突变无扩增组、基因突变并扩增组与基因无突变无扩增组血清CEA比较有显著性差异(P＜0.05).EGFR基因突变、基因扩增及基因突变并扩增与血清CEA水平有明显相关性. 结论 在NSCLC中EGFR基因突变率大于扩增率,其机制有待进一步阐明.EGFR基因与血清CEA水平有明显相关性.血清CEA水平有可能成为指导非小细胞肺癌EGFR靶向治疗的指标.     

中国汉族人与美国高加索人乳腺癌患者线粒体基因细胞突变的比较

目的:探讨不同种族乳腺癌患者线粒体DNA体细胞性突变的差异。方法:利用时相温度梯度凝胶电泳方法对2000/2003所保存的肿瘤样本中,随机抽取的54例中国汉族人和19例美国高加索人乳腺癌患者乳腺组织和距肿瘤边缘5cm以上的正常乳腺组织进行前瞻性突变分析研究。采用32对重叠引物扩增了来自所有患者的肿瘤组织和配对正常组织的线粒体全长基因,对肿瘤和正常组织中不同的电泳条带类型的DNA片段进行测序以辩明其突变类型。结果:747%(14/19)高加索人乳腺癌具有体细胞性线粒体基因突变,汉族人中乳腺癌体细胞性突变的发生率仅37%(24/54),但后者未记录于MitoMap数据库的新突变数明显多于前者。两组均以D环区突变密度最高,汉族人rRNA区突变密度高于高加索人,而D环区则较之为低(χ2=9.27,P=0.026)。结论:中国汉族人与美国高加索人乳腺癌患者线粒体基因体细胞性突变频率、各基因区域的突变分布和突变密度具有一定的差异。在中国汉族人群乳腺癌患者出现较多的未记录于MitoMap数据库的新突变,显示出汉族人具有与高加索人不同的线粒体基因体细胞性突变特征。本研究为肿瘤预防性干预提供理论依据。     

凝血因子Ⅸ的研究进展

本文综述了凝血因子Ⅸ的结构与激活，基因多态性和突变，ＦⅨ抗原和活性检测，ＦⅨ基因突变检测以及血友病Ｂ基因治疗的研究进展。     

原发性血小板增多症患者CALR、JAK2 V617F、MPL W515K基因突变率及临床特征分析

目的:分析原发性血小板增多症患者CALR、MPL W515K与JAK2 V617F基因突变率及临床特征。方法:对本院56例原发性血小板增多症患者,通过基因组DNA-PCR扩增产物直接测序法检测CALR与MPL W515K基因突变,并通过等位基因特异性PCR法检测JAK2 V617F基因突变。结果:56例患者中CALR基因突变14例,发生率为25.00%,其中Ⅰ型6例,Ⅱ型5例,Ⅲ型3例。Ⅰ型与Ⅱ、Ⅲ型CALR基因突变的患者在性别、年龄、血小板计数(Plt)、白细胞计数(WBC)及血红蛋白(Hb)水平的比较均无明显差异(P0.05);Ⅲ型患者WBC计数较Ⅱ型者显著升高(P0.05),而Ⅲ型和Ⅱ型组患者的性别、年龄、Hb及Plt的比较均无明显差异(P0.05)。MPL W515K基因突变3例,发生率为5.36%;JAK2 V617F基因突变21例,发生率为37.50%。MPL W515K与JAK2 V617F阴性患者(18例)中CALR基因突变13例,发生率为72.22%(13/18),并无检出任一2种基因突变共存的病例。CALR突变者外周血Hb、WBC的水平较JAK2 V617F突变者均显著降低(P0.05)。56例患者中,染色体核型异常3例,发生率为5.36%。染色体核型异常者CALR基因突变率(66.67%)较正常核型者(20.75%)显著升高(P0.01)。结论:JAK2 V617F基因在原发性血小板增多症患者中的突变率较高,且MPL W515K与JAK2 V617F基因突变阴性者CALR突变率较高,这可能与染色体核型异常存在密切联系;CALR基因突变的原发性血小板增多症患者外周血Hb、WBC的含量较JAK2 V617F突变者均显著降低。     

Ph阴性骨髓增殖性肿瘤中ASXL1与CALR突变共存的检测及临床意义

目的:研究原发性血小板增多(ET)和原发性骨髓纤维化(PMF)患者ASXL1与CALR基因突变共存情况,比较其与单基因突变及突变阴性患者部分临床参数间的差异性。方法:采用基因组DNA-PCR扩增产物直接测序法检测263例ET患者及29例PMF患者ASXL1基因12号外显子、CALR基因9号外显子和MPL基因10号外显子突变;采用等位基因特异性PCR检测JAK2V617F突变情况。结果:292例患者总的突变检出率为72.6%(212/292),ASXL1、CALR、JAK2V617F及MPL基因突变发生率分别为5.8%、30.5%、39.0%及2.4%;5.1%(15/292)的患者同时携带双基因突变,包括ASXL1/CALR(n=11)、ASXL1/JAK2V617F(n=2)、MPL/CALR(n=1)及ASXL1/MPL(n=1),其中ASXL1/CALR突变共存发生率明显高于其它突变类型。与单基因CALR及JAK2V617F突变相比,CALR/ASXL1双突变组的ET患者有更高的血小板水平及较低的血红蛋白水平(P0.05),但在中位年龄及外周白细胞计数方面无明显差异(P0.05);与突变阴性组相比,CALR/ASXL1双突变ET组具有较低的白细胞数及血红蛋白水平,但具有较高的血小板水平,差异均有统计学意义(P0.05);在中位年龄方面差异无统计学意义(P0.05)。结论:ASXL1与CALR突变共存在ET患者中有较高的检出率,与单基因突变及突变阴性组相比,具有较高的血小板水平及较低的血红蛋白水平。