罗丹明B单克隆抗体的的制备及鉴定

目的制备抗罗丹明B[9-(2-羧基苯基)-3,6-双(二乙氨基)]小鼠单克隆抗体(mAb),初步鉴定其特性,为罗丹明B快速检测方法的开发奠定基础。方法采用活性酯法使罗丹明B偶联于载体牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA),合成免疫抗原罗丹明B-BSA和检测抗原罗丹明B-OVA。将罗丹明B-BSA免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术获得杂交瘤细胞株17F2,并通过对添加回收率的测定初步建立了罗丹明B的快速检测方法。结果将该细胞株注射Balb/c小鼠制备腹水mAb,腹水纯化后效价为1∶1.28×105,属于IgG1型。罗丹明B mAb的灵敏度为0.05μg/L,IC50为0.42μg/L。mAb与丁基罗丹明B、异硫氰酸罗丹明B、罗丹明6G、5-羧基四甲基罗丹明、罗丹明110、丽丝胺罗丹明B、罗丹明123的交叉反应率均小于0.3%。辣椒油中罗丹明B的添加回收率在80.6%～104.4%之间,变异系数在16.0%～28.8%之间。结论制备出的罗丹明B mAb为研制罗丹明B的快速检测方法奠定了基础。     

Wnt5a基因对肝癌细胞增殖及迁移能力的影响

目的探讨Wnt5a基因对人肝癌细胞MHCC97L生物学行为的影响。方法脂质体法介导Wnt5a表达及阴性对照质粒转染MHCC97L细胞;RT-PCR及Western blot法检测质粒DNA片段插入和Wnt5a蛋白的表达;借助生长曲线、平板克隆形成、细胞周期和划痕试验对转染细胞的生物学活性进行检测。结果 pcDNA3.1组细胞生长速度明显快于Wnt5a表达组细胞;pcDNA3.1组细胞克隆形成率明显高于Wnt5a表达组(P<0.05);流式细胞仪检测结果显示Wnt5a表达能抑制细胞由G1期→S期的进程;划痕试验显示,Wnt5a表达组较阴性对照组细胞迁移速度明显减慢,当加入Wnt5a抗体阻遏信号通路时,细胞迁移速度加快。结论 Wnt5a可抑制人肝癌细胞MHCC97L的增殖和迁移能力,在肿瘤生长过程中发挥肿瘤抑制基因样作用。     

鼠抗人CD86 单克隆抗体的制备及对肿瘤细胞生长与迁移的影响

目的:制备鼠抗人CD86分子的单克隆抗体(m Ab),分析其对天然表达CD86分子的恶性肿瘤细胞株的生长与迁移的影响。方法:采用小鼠腹水诱生法制备CD86 m Ab,Protein A亲和层析法纯化抗体。采用流式细胞术(FCM)检测抗体对细胞膜型CD86分子的识别。以Raji、Daudi和8266细胞为观察对象,加入CD86 m Ab共同孵育,用FCM检测抗体对细胞凋亡的诱导作用,MTT检测抗体对细胞增殖的影响,Transwell~(TM)研究抗体对细胞迁移的影响。结果:本实验获得的CD86 m Ab能很好地识别细胞膜型分子,其与Raji、Daudi和8266细胞的结合率分别为96. 5%、99. 0%和83. 9%。FCM结果显示,共同孵育24 h,当抗体浓度为20μg/ml时,上述细胞的凋亡率分别为16%、18%及14%,均明显高于同型对照组(P0. 05)。MTT结果显示,共同孵育48 h,20μg/ml抗体对细胞的增殖己可产生抑制作用,40μg/ml抗体对上述细胞增殖的抑制效果更明显(P0. 05),抑制率依次为23%、25%及26%。TranswellTM结果显示,共同孵育48 h,20μg/ml抗体组的Raji、Daudi和8266细胞的迁移率分别为26%、23%和24%,均明显低于同型对照组(P0. 05)。结论:本实验制备的抗体能很好地识别细胞膜型分子,其对表达CD86分子的肿瘤细胞的增殖及迁移具有抑制作用,同时可诱导肿瘤细胞发生凋亡,提示该抗体对表达相应抗原分子的肿瘤具有一定的抗瘤效应。     

十溴联苯醚对宫颈癌细胞体外增殖的影响

目的探讨十溴联苯醚（PBDE-209）对宫颈癌HeLa细胞体外增殖的影响。方法观察HeLa细胞经不同浓度PBDE-209暴露后发生的形态学变化,并用MTT方法检测细胞存活率改变,采用免疫荧光化学方法检测细胞增殖核抗原Ki67表达变化,流式细胞术观察HeLa细胞细胞周期的分布变化。结果随着浓度升高,细胞增殖明显,细胞间隙变小。MTT方法检测发现PBDE-209促进HeLa细胞增殖,细胞增殖率的升高呈时间和浓度依赖效应,200nmol/LPBDE-209作用24、48和72h后细胞增殖率分别是阴性对照组的1.2、1.5和1.8倍（P〈0.05）。Ki67表达强度随着PBDE-209浓度升高而增强。流式细胞术检测发现200nmol/LPBDE-209作用72h后,G0/G1期细胞比例下降了8%,而S期细胞比例升高了7%,与阴性对照组比较差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论低浓度PBDE-209暴露使HeLa细胞G0/G1期细胞减少,S期细胞增加,从而促进细胞增殖。     

C6胶质瘤细胞体外诱导神经干细胞的迁移

目的：体外观察 C6胶质瘤细胞的培养上清是否有诱导神经干细胞迁移的作用。方法：实验组取处于指数生长期的 C6胶质瘤细胞或星形胶质细胞的无血清培养上清加入细胞培养室的下室,并加无血清培养基;培养室的上室加处于对数生长期的神经干细胞球悬液,培养箱中共培养,光镜下计数迁移的细胞球数。结果：C6胶质瘤细胞的上清引起神经干细胞球迁移的数目明显多于星形胶质细胞的上清和新鲜无血清培养基。结论：C6胶质瘤细胞的培养上清中存在诱导神经干细胞球迁移的物质,这将为研究诱导神经干细胞迁移的物质提供很大的便利。     

抗人活化B淋巴细胞单克隆抗体制备及鉴定

自儿童手术摘除的新鲜扁桃体分离人Ｂ淋巴细胞，经ＰＭＡ（佛波醇）激活后得到人活化Ｂ淋巴细胞，用于免疫ＢＡＢＬ／Ｃ小鼠后，取免疫小鼠之脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０融合，融合后细胞于含ＨＡＴ－ＩＭＤＭ完全培养基的２％甲基纤维素半固体培养基选择生长，经细胞酶联免疫吸附（ＣＥＬＩＳＡ）筛选间接免疫荧光流式细胞仪鉴定，获培养上清对活化Ｂ细胞及３Ｄ５细胞株细胞反应阳性，而Ｊｕｒｋａｔ细胞株细胞反应阴必的杂交     

人UNC5CL原核蛋白的表达及多克隆抗体的制备和鉴定

目的:构建UNC5CL基因的原核表达载体,纯化GST-UNC5CL融合蛋白,并以其为抗原免疫家兔,制备抗人UNC5CL多克隆抗体,并鉴定其反应性和特异性。方法:用PCR方法扩增UNC5CL基因(表达其280-518位氨基酸)片段并克隆至pGEX-4T-2原核表达载体中,转化大肠杆菌BL21诱导融合蛋白GST-UNC5CL(aa 280-518)表达;所获得的可溶性蛋白经亲和层析纯化,免疫家兔制备抗血清,再采用ELISA、Western blot和免疫组化的方法检测抗体的效价及特异性。结果:测序证实原核重组质粒构建成功;经IPTG诱导,可表达Mr为52 000的GST-UNC5CL(aa280-518)的融合蛋白;谷胱甘肽亲和层析柱纯化的融合蛋白免疫家兔制备的抗血清经Western blot和免疫组化检测证实可识别目的蛋白。结论:制备了兔抗人UNC5CL的多克隆抗体,且抗体对内源性UNC5CL具有较好的反应性和特异性,为进一步研究UNC5CL的功能奠定了基础。     

牛主动脉平滑肌细胞体外钙型的制备

目的利用β-甘油磷酸盐处理牛主动脉平滑肌细胞(BASMC)制备体外血管钙化模型。方法移植块法原代培养牛主动脉中膜平滑肌细胞,8代内的传代细胞添加10 mmol/Lβ-甘油磷酸盐培养10 d,Von Kossa染色、茜素红S染色和电镜检查鉴定钙化,同时测量细胞层钙沉积、碱性磷酸酶活性及培养上清的骨钙素含量。结果10 d后细胞层出现大量钙盐沉积,并且β-甘油磷酸盐时间依赖性增加钙沉积,碱性磷酸酶活性及骨钙素含量各时间点均较正常培养细胞显著增加(P<0.01)。结论甘油磷酸盐能在短期内诱导出BASMC广泛钙化,用此方法制备的BASMC是一种良好的研究血管钙化的体外模型。     

抗DNA单克隆抗体的制备及对DNA受体的影响

高滴度抗双链DNA(ds-DNA)抗体是系统性红斑狼疮(SLE)典型的血清学特征之一。它在SLE致病中的作用一直引起人们极大的兴趣。目前,人们尚未能用天然ds-DNA免疫动物获得抗ds-DNA抗体,用单链DNA(ss-DNA)、z-DNA、RNA、     

Periostin表达对鼻咽癌细胞体外侵袭行为的影响

探讨Periostin表达对体外鼻咽癌（NPC）细胞侵袭行为的影响及其机制。 方法 采用Western blotting检测激光捕获显微切割纯化的鼻咽癌间质和正常鼻咽黏膜间质、鼻咽癌低转移潜能细胞系6-10B和高转移潜能细胞系5-8F及NIH 3T3成纤维细胞中Periostin的表达水平。应用阳性脂质体法将pCMV-neo-Periostin质粒瞬时转染到NIH 3T3细胞,运用Western blotting检测转染前后NIH 3T3细胞中Periostin的表达水平,利用Boyden小室穿膜侵袭实验检测Periostin蛋白对肿瘤细胞的体外侵袭能力的影响,明胶酶谱法检测其对基质金属蛋白酶（MMPs）活性的影响。 结果 Periostin在纯化的鼻咽癌间质中高表达,在纯化的正常鼻咽黏膜间质中及高转移细胞系5-8F中弱表达,在低转移细胞系6-10B及NIH 3T3细胞中不表达。瞬时转染过表达Periostin的NIH 3T3细胞中Periostin的表达明显增强。Boyden小室实验提示,分泌蛋白Periostin可明显增强鼻咽癌细胞6-10B的体外侵袭能力,转染组穿膜的细胞数与空白对照组及未转染对照组比较,明显增多(P<0.01);转染组与6-10B细胞共培养后,培养上清中MMPs的活性较对照组明显增强。 结论 Periostin 蛋白能增强鼻咽癌细胞的侵袭能力,其机制可能与上调MMPs的活性有关。     

抗人血清载脂蛋白B100单克隆抗体的制备及鉴定

低致度脂蛋LDL中98%以上为载脂蛋白B100(ApoB100)。许多研究表明LDL含量与动脉硬化、冠心病呈正相关。高水平ApoB是致动脉硬化的主要原因。     

抗CD43单克隆抗体对B细胞增殖及抗体分泌的影响

目的：研究抗CD43 mAb（DFT1）对B细胞增殖及其抗体分泌的影响。方法：细胞培养，^3H-TdR掺入法测定不同时间抗CD43 mAb对B细胞增殖的影响，ELISA测定其对PWM诱导系统内抗体分泌的水平。结果：单独加入抗CD43 mAb对B细胞增殖无影响，但在TPA诱导系统内加入抗CD43 mAb，培养72h可见显著增殖反应，为单独加入TPA引起增殖反应的3倍，在培养开始加入抗CD43 mAb可引起显著的增殖反应，而延迟加入抗CD43 mAb对B细胞增殖的影响不显著。抗CD43 mAb对PWM诱导系统内B细胞的抗体分泌不产生影响。结论：抗CD43抗体可引起TPA诱导系统内B细胞的显著增殖。而PWM诱导系统内B细胞抗体的分泌无影响。     

人血管内皮钙黏蛋白5单克隆抗体的制备及应用

目的制备并鉴定人血管内皮钙黏蛋白5(VECDH5)的单克隆抗体(m Ab)。方法用重组原核人VECDH5蛋白免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术进行细胞融合;间接ELISA筛选阳性克隆,得到稳定分泌抗VECDH5抗体的杂交瘤细胞株,ELISA测定其效价;Western blot法、流式细胞术、免疫荧光细胞化学染色、免疫组织化学染色鉴定其特异性及抗原表位。结果制备并获得1株可分泌特异性抗VECDH5的杂交瘤细胞株(2C11)。ELISA测定腹水效价高达1∶10 000。多种方法均证实该抗体能特异性识别人VECDH5蛋白,并可在上述不同方法中应用。经抗原表位鉴定,研究制备的2C11识别的氨基酸序列为LDREVVPWYNLTVEA。结论成功制备了亲和力高、特异型好的抗人VECDH5的m Ab。     

抗死亡受体-5单克隆抗体的制备及特性鉴定

目的:研制抗DR5单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性。方法:以纯化的DR5免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗DR5mAb。用Ig亚类ELISA试剂盒鉴定抗DR5mAb的亚类。用ELISA法测定sDR5对抗DR5mAb与DR5结合的阻断作用及流式细胞术检测与Jurkat细胞膜上DR5结合的阻断作用,以鉴定mAb的特异性。用间接ELISA法检测腹水mAb的效价、亲和常数并进行表位分析。结果:获得4株可分泌抗DR5mAb的的杂交瘤细胞系YM366EC、YM366ED、YM369F5和YM369E6。4株mAb的Ig亚类均为IgG1;腹水mAb效价为1×10-4~5×10-6;亲和常数为1×109水平,4株mAb可识别2种不同的抗原表位。结论:获得4株抗DR5的mAb,为进一步用于临床诊断和实验研究创造了条件。     

重组TFPI-2影响人卵巢癌细胞体外迁徙浸润能力的研究

目的 :从功能角度研究重组组织因子途径抑制物 2 (TFPI 2 )对人卵巢癌细胞体外迁徙、浸润能力的影响。方法 :①迁徙实验 ,加不同浓度TFPI 2培养的A2 780细胞和不加TFPI 2的A2 780细胞 ,通过Boyden小室体外浸润转移模型 ,以迁徙到聚碳脂微孔滤膜 (PVPF)背面的每高倍镜视野中的平均细胞数作为评价人卵巢癌细胞迁徙能力强弱的指标。②浸润实验在PVPF膜铺上基底膜基质胶 (Matrigematrix)后 ,行迁徙实验。结果 :①迁徙实验中 ,将A2 780 TFPI 2不同浓度组与A2 780对照组细胞穿过PVPF膜的细胞数进行比较 ,经t检验 ,没有统计学意义 (P >0 .0 5)。②浸润实验中 ,将A2 780 TFPI 2不同浓度组与A2 780对照组的细胞穿过人工膜的细胞数进行比较 ,及TFPI 2不同浓度组间的细胞数进行比较 ,经t检验 ,均有非常显著差异 (P <0 .0 1)。结论 :重组TF PI 2对人卵巢癌细胞体外自身运动能力无影响 ,但可显著抑制人卵巢癌细胞的体外浸润能力 ,为卵巢癌的蛋白酶抑制剂治疗提供一可能的靶向依据。     

B淋巴细胞刺激物单克隆抗体的制备与特性鉴定

B淋巴细胞刺激物(Blymphocyte stimulator，BLyS，也称为BAFF、TALL-1、THANK及zTNF4)是1999年发现的TNF超家族中的新成员，与该超家族中的多数成员一样也表达于淋巴组织中，对免疫系统的发育和调节具有重要作用。BLyS作为B细胞的共刺激物，不仅参与了体液免疫的调控，如果强烈刺激B细胞增殖、分化并分泌大量免疫球蛋白；在T细胞介导的免疫应答中可能也发挥着重要作用。     

幽门螺杆菌尿素酶B单克隆抗体的制备、鉴定及应用

目的：制备幽门螺杆菌（Hp）尿素酶B（ureB）单克隆抗体并鉴定。 方法： 以Hp重组纯化蛋白ureB为抗原，运用杂交瘤技术制备ureB单克隆抗体，用间接ELISA法检测抗体免疫学活性，用双抗夹心的IRMA法检测不同单抗是否识别相同的表位，并用于检测Hp感染。 结果： 获得两株识别不同表位的ureB单抗杂交瘤细胞，可测得Hp 感染的相关抗原。 结论： 抗ureB单抗可特异性与Hp结合，可用于建立幽门螺杆菌现症感染的检测方法。     

shWnt5a重组慢病毒的制备及其对黑素瘤细胞侵袭的抑制作用

目的构建下调人Wnt5a基因表达的重组质粒并制备重组慢病毒,感染黑素瘤细胞后,观察其对该细胞侵袭的影响。方法构建下调人Wnt5a基因表达的重组质粒pLKO.1-shWnt5a,利用pLKO.1慢病毒包装系统和HEK293T细胞包装、制备携带shWnt5a的重组慢病毒颗粒,并感染WM793B黑素瘤细胞,建立稳定低表达Wnt5a的WM793BWnt5a-黑素瘤细胞株。采取细胞迁移与侵袭实验检测Wnt5a对黑素瘤细胞侵袭的影响。结果成功制备了携带shWnt5a的重组慢病毒,建立低表达Wnt5a的稳定转染细胞株WM793BWnt5a-,细胞迁移与侵袭实验证明抑制Wnt5a基因的表达可以显著抑制黑素瘤的侵袭能力。结论下调Wnt5a基因的表达对黑素瘤的侵袭能力有明显的抑制作用。     

驻极体对瘢痕成纤维细胞生长及迁移能力的影响

目的：研究驻极体调控瘢痕成纤维细胞生长和迁移的作用及相关机制。方法：采用常温等离子体放电系统 将聚丙烯薄膜分别制成5 000 V 驻极体（5 000 V 组）和-5 000 V 驻极体（-5 000 V 组）,借助于等效表面电位测 量其电荷储存的稳定性。利用打孔器完整切除兔耳腹侧全层皮肤,并剥离软骨膜形成兔耳瘢痕模型。通过测量瘢 痕组织的增殖指数和CCK-8 实验研究正、负极性驻极体对瘢痕成纤维细胞增殖能力的影响,应用流式细胞仪研究 正、负极性驻极体对瘢痕成纤维细胞生长周期的影响。通过细胞迁移实验研究在静电场环境下生长的瘢痕成纤维 细胞的迁移能力。结果：正、负极性驻极体可提供稳定的静电场作用于瘢痕成纤维细胞。-5 000 V 驻极体不仅可 以促进G1 期细胞增殖,还可以抑制S 期DNA 的合成或缩短其停留时间,加速其进入G2 期,并促进瘢痕成纤维 细胞向伤口迁移。5 000 V 驻极体则通过抑制S 期DNA 的过度合成,抑制瘢痕成纤维细胞的生长与迁移。但驻极 体作用较长时间（4 ～ 6 周）,驻极体可以随着伤口愈合的不同阶段调控瘢痕增生,最终抑制其生长。 结论：电 场可引起瘢痕成纤维细胞的细胞周期发生变化,从而调控细胞的分化与增殖,且正、负极性驻极体对抑制瘢痕的 作用机制各有侧重,2 种不同极性的驻极体有望分别应用于不同时期的瘢痕生长过程,最终抑制病理性瘢痕增生。