miR-219与TGFBR2的调控关系在肾脏纤维化中的作用

目的:研究微小RNA-219(miR-219)通过靶向调控转化生长因子βⅡ型受体(TGFBR2)在肾脏纤维化中发挥的作用。方法:收集2017年9月～2018年3月于我院就诊的70例肾脏纤维化患者,选取同期来本院体检的20例健康人设为对照组,RT-qPCR检测肾脏纤维化患者及对照组血清中miR-219的表达水平,并检测血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激大鼠肾成纤维细胞NRK49F后miR-219的表达水平。Western blot检测转染miR-219模拟物(miR-219 mimics)的NRK49F细胞在AngⅡ刺激后α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的蛋白表达情况。筛选出miR-219的潜在靶基因TGFBR2,并通过萤光素酶报告基因法进行验证。RT-qPCR和Western blot检测miR-219 mimics对TGFBR2的mRNA及蛋白表达的影响。RT-qPCR检测miR-219 mimics对α-SMA、结缔组织生长因子(CTGF)、Ⅰ型胶原α1链(COL1A1)和COL3A1的mRNA表达水平的影响。构建单侧输尿管闭塞(UUO)小鼠模型并检测其肾脏组织中miR-219的表达水平,对UUO小鼠注射miR-219后观察肾脏纤维化的变化情况,并检测COL1A1和COL3A1的mRNA表达水平。结果:肾脏纤维化患者血清中miR-219的表达水平明显低于对照组,UUO小鼠肾脏组织中miR-219的表达显著下降(P0.01);AngⅡ刺激NRK49F细胞后miR-219的表达水平明显降低,且miR-219 mimics可抑制α-SMA蛋白的表达(P0.01);miR-219 mimics对TGFBR2具有靶向调控作用,可抑制TGFBR2的mRNA及蛋白表达;miR-219 mimics可抑制α-SMA、CTGF、COL1A1和COL3A1的mRNA表达水平;miR-219可下调UUO小鼠中COL1A1和COL3A1的mRNA表达水平并抑制其肾脏纤维化进程。结论:miR-219可通过抑制TGFBR2的表达从而抑制肾脏纤维化的发展,可能成为肾脏纤维化诊断及治疗的新靶点。     

miR-433在NIH-3T3细胞纤维化和矽尘诱导的小鼠肺纤维化中的作用

目的:本研究旨在探究微小RNA-433(miR-433)在纤维化中的作用及机制。方法:采用TargetScan预测miR-433的潜在靶基因。检测转化生长因子β1(TGF-β1)处理小鼠胚胎成纤维细胞(NIH-3T3细胞)24h后miR-433表达的变化。检测miR-433 mimic对TGF-β1处理的NIH-3T3细胞中p-SMAD2、纤维连接蛋白(FN)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和结缔组织生长因子(CTGF)表达水平的影响。采用CCK-8法和流式细胞术检测转染miR-433 mimic对TGF-β1诱导的NIH-3T3细胞生长和S期阻滞的影响。构建矽尘诱导的小鼠肺纤维化模型并使用agomiR-433进行干预,HE染色和Masson染色观察miR-433对小鼠肺纤维化的影响,采用免疫组化检测小鼠肺组织中α-SMA的表达。结果:miR-433能特异性结合SMAD2的3'-UTR,并抑制其蛋白和mRNA的表达。TGF-β1能下调NIH-3T3细胞中miR-433的表达水平,上调p-SMAD2蛋白的水平,同时也增强FN、α-SMA和CTGF蛋白和mRNA的表达,并增强细胞活力,诱导S期细胞数量增加;而miR-433 mimic能逆转TGF-β1对NIH-3T3细胞活力和S期阻滞的影响。在矽尘诱导的小鼠肺纤维化模型中,agomiR-433能抑制肺纤维化进程,减少小鼠肺组织中α-SMA的表达。结论:miR-433可能通过靶向调控SMAD2干预TGF-β1/SMAD2信号通路,从而参与调节纤维化的病理过程。     

柚皮素通过抑制TGF-β1/smad信号传导通路缓解糖尿病肾病大鼠肾损伤

目的探讨柚皮素对糖尿病肾病大鼠肾脏的保护作用及其对TGF-β1/smad信号传导通路的影响。方法将糖尿病肾病模型大鼠随机分为糖尿病肾病组和糖尿病肾病+柚皮素组,用药治疗6周。检测大鼠24 h尿蛋白定量、肌酐清除率和肾脏指数;HE染色观察肾组织形态和检测肾小球面积;实时荧光定量PCR检测Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白、TGF-β1、Smad2和Smad7 mRNA的表达;Western blot检测Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白、TGF-β1、smad7、总smad2和磷酸化smad2蛋白。结果糖尿病肾病组大鼠24 h尿蛋白(P0.01)和肾脏指数(P0.01)显著升高,肌酐清除率明显下降(P0.01),肾小球明显肥大(P0.05),Ⅳ型胶原和纤维连接蛋白的mRNA水平和蛋白表达量均升高,TGF-β1和磷酸化smad2蛋白的表达量均升高,smad7蛋白表达量降低;经柚皮素50 mg/kg治疗后能明显降低糖尿病肾病大鼠的24 h尿蛋白(P0.01)和肾脏指数(P0.05),提高肌酐清除率(P0.05),减轻肾小球肥大(P0.05),Ⅳ型胶原和纤维连接蛋白的mRNA水平和蛋白表达量降低,TGF-β1和磷酸化smad2蛋白的表达量均降低,smad7蛋白表达量升高。结论柚皮素可能通过调控糖尿病肾病肾组织TGF-β1/smad信号通路表达,减轻肾脏病理损害。     

miR-30a在心肌梗死大鼠心肌纤维化中的作用机制及对心功能的影响

目的探讨miR-30a在大鼠心肌梗死后对心肌纤维化的作用机制及对心功能的影响。方法构建携带大鼠miR-30a基因的载体,在HEK293细胞中包装病毒载体r AAV9-miR-30a及阴性对照r AAV9-miR-30a-NC,提取纯化后通过冠脉注射方法分别传导PBS缓冲液、r AAV9-miR-30-NC和r AAV9-miR-30a至大鼠心脏,再建立大鼠心肌梗死模型,分别设为PBS组、miR-30-NC组和miR-30a组,同时设立假手术组(sham组)。用心脏彩色多普勒超声检测心功能指标,包括短轴缩短率(FS)及左室射血分数(LVEF);Masson染色观察心肌胶原容积分数(CVF);免疫组化法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原表达;实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测心肌miR-30a及TGF-β1和CTGF mRNA表达;蛋白印迹法(Western blot)检测TGF-β1及CTGF蛋白的表达。结果 miR-30a组心功能较PBS组及miR-30-NC组显著改善(P0.05)。miR-30a组的心肌CVF及Ⅰ、Ⅲ胶原表达水平、Ⅰ/Ⅲ型胶原比值较PBS组及miR-30-NC组显著降低(P0.01);miR-30a组心肌TGF-β1 mRNA及蛋白表达水平与PBS组及miR-30-NC组比较显著下降(P0.001);CTGF mRNA及蛋白表达水平较PBS组及miR-30-NC组显著降低(P0.001)。结论 miR-30a过表达能下调心肌梗死后心肌TGF-β1、CTGF mRNA及蛋白水平,从而减少心肌胶原产生,抑制心肌纤维化,进而改善心功能。     

黄芩苷通过调控TGF-β1/TAK-NF-κB通路对胰腺纤维化的防治作用

目的:观察黄芩苷对慢性胰腺炎(CP)小鼠胰腺组织转化生长因子β1(TGF-β1)/TGF-β活化激酶(TAK)-核因子κB(NF-κB)信号通路的影响,探讨黄芩苷防治胰腺纤维化的作用机制。方法:健康雄性昆明小鼠58只,随机分为空白对照组、CP模型组和黄芩苷治疗组。除空白对照组外,其余小鼠均给予腹腔注射20%L-精氨酸诱发CP,治疗组于造模后2周开始腹腔注射黄芩苷(100 mg/kg,每天1次)。造模后2周、4周和6周分别处死动物,下腔静脉采血,摘取小鼠胰腺组织,HE及Masson染色检测各组小鼠胰腺组织形态学改变及纤维化程度;ELISA检测血清TGF-β1的表达;免疫组织化学法观察胰腺组织纤维连接蛋白(FN)和NF-κB的表达;Western blot检测胰腺组织FN、转化生长因子βⅠ型受体(TGF-βRⅠ)、磷酸化TAK1(p-TAK1)及NF-κB蛋白的表达;real-time PCR检测胰腺组织基质金属蛋白酶1(MMP-1)及金属蛋白酶组织抑制物1(TIMP-1)的mRNA表达。结果:腹腔注射20%L-精氨酸2周、4周和6周后,HE及Masson染色显示胰腺组织有纤维沉积,FN表达升高;而黄芩苷治疗后小鼠的胰腺损伤及胶原纤维沉积程度明显减轻,FN表达减少(P<0.01)。CP模型组小鼠胰腺组织TGF-β1、TGF-βRⅠ、p-TAK1、NF-κB及TIMP-1的水平均升高,MMP-1表达降低;而黄芩苷治疗组TGF-β1、TGF-βRⅠ、p-TAK1、NF-κB及TIMP-1的水平降低,MMP-1表达升高(P<0.01)。结论:黄芩苷通过抑制TGF-β1/TAK-NF-κB信号通路的活化,调节MMP-1/TIMP-1的相对平衡,发挥抗CP小鼠胰腺纤维化的作用。     

miR-140-5p靶向调控HAND2影响TGF-β1诱导肾小管上皮细胞生长

目的探讨miR-140-5p调控心脏神经脊衍生物表达转录因子2(HAND2)对转化生长因子β1(TGF-β1诱导肾小管上皮细胞生长的影响。方法实验设置TGF-β1组、对照(NC)组、miR-NC组、miR-140-5p组、anti-miRNC组、anti-miR-140-5p组、miR-NC+TGF-β1组、miR-140-5p+TGF-β1组、si-NC+TGF-β1组、si-HAND2+TGF-β1组、miR-140-5p+pcDNA-NC+TGF-β1组、miR-140-5p+pcDNA-HAND2+TGF-β1组。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-140-5p和HAND2 mRNA表达水平;蛋白质印迹(Western blot)法检测HAND2、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cleaved-caspase-3)、磷酸化磷脂酰肌醇3激酶(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)蛋白表达;四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞增殖率;流式细胞术检测细胞凋亡;双荧光素酶报告实验验证miR-140-5p和HAND2的靶向关系。结果 TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞中miR-140-5p低表达,HAND2高表达。高表达miR-140-5p或低表达HAND2,TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞中CyclinD1表达水平升高,Cleaved-caspase-3表达水平降低,细胞增殖率升高,细胞凋亡率降低(P0.05)。miR-140-5p靶向调控HAND2,高表达HAND2可以逆转miR-140-5p对TGF-β1处理的肾小管上皮细胞增殖和凋亡的影响。高表达miR-140-5p,p-PI3K、p-AKT表达水平升高;而高表达HAND2逆转了miR-140-5p对PI3K/AKT信号通路的促进作用。结论过表达miR-140-5p通过靶向下调HAND2激活PI3K/AKT信号通路促进肾小管上皮细胞增殖,抑制响TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞凋亡。     

抗纤灵方对单侧输尿管梗阻大鼠TGF-β1-Smad通路的影响

目的:研究中药复方抗纤灵对单侧输尿管梗阻(UUO)所致肾纤维化大鼠TGF-β1-Smad通路的影响,借以初步探讨其发挥疗效的作用机制。方法:雄性SD大鼠18只随机分为3组,假手术组、模型组、中药治疗组。用单侧输尿管结扎术建立大鼠肾纤维化模型,抗纤灵治疗两周后检测梗阻肾羟脯氨酸含量;HE染色和电镜观察肾组织病变;采用RT-PCR检测肾组织TGF-β1 mRNA水平;蛋白免疫印迹法检测肾组织转化生长因子I型受体(TβRI)、转化生长因子II型受体(TβRII)、Smad2蛋白表达及磷酸化变化。结果:与假手术组比较,模型组大鼠梗阻肾羟脯氨酸含量明显增多;病理观察可见肾小球毛细血管基底膜明显增厚,间质成纤维细胞和胶原沉积明显增多;肾组织TGF-β1mRNA及TβRI、TβRII蛋白表达显著增多,Smad2蛋白磷酸化及总蛋白表达水平均显著增多。与模型组比较,中药干预组大鼠梗阻肾羟脯氨酸含量明显减少;肾小球和肾小管基底膜仅见轻度增厚,间质成纤维细胞和胶原沉积较模型组减轻;肾组织TβRI、TβRII蛋白表达明显下调,Smad2蛋白磷酸化及总蛋白表达水平均明显下调。结论:抗纤灵可抑制单侧输尿管梗阻大鼠TGF-β1-Smad通路,抑制梗阻肾TβRI、TβRII、Smad2蛋白表达及Smad2蛋白磷酸化,从而改善梗阻性大鼠的肾间质纤维化,减少纤维化肾脏中胶原蛋白含量。     

结缔组织生长因子-siRNA对糖尿病肾病大鼠肾组织中转化生长因子-β1及层黏连蛋白表达的影响

目的:探讨结缔组织生长因子(CTGF) si-RNA对糖尿病大鼠肾组织中转化生长因子β(TGF-β1)及层黏连蛋白表达的抑制作用.方法:取健康雄性Wistar大鼠,随机分为正常对照组、糖尿病模型组、CTGF-siRNA隐性对照组、CTGF-siRNA实验组.腹腔注射1％链脲佐菌素(STZ)建模.特殊转染载体通过尾静脉注射CTGF-siRNA.免疫组织化学观察肾组织中TGF-β1的表达,RT-PCR方法观察肾皮质中TGF-β1、层黏连蛋白mRNA表达的变化.结果:CTGF-siRNA实验组肾组织中TGF-β1的表达减少,同时肾皮质中TGF-β1、层黏连蛋白mRNA表达也减少.CTGF-siRNA注射结束后第4周,尿蛋白明显降低.结论:CTGF-siRNA对糖尿病大鼠肾组织中TGF-β1、层黏连蛋白表达有抑制作用,缓解肾组织的纤维化作用,同时对糖尿病肾功能有明显改善作用.     

丹皮酚通过抑制miR-21表达减轻博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化

目的研究丹皮酚(PAE)通过抑制微小RNA-21(miR-21)减轻博莱霉素(BLM)诱导肺纤维化的相关机制。方法将SD大鼠随机分为对照组、BLM组、阳性对照(PC)组、PAE组,比较各组大鼠的肺纤维化相关指标,miR-21、Smad7的mRNA相对表达水平,及Smad7、TGF-β1、COLIA1、α-SMA蛋白水平;将制备好的纤维细胞分为对照组,TGF-β1组,PAE-L组,PAE-M组,PAE-H组,miR-21抑制剂组,检测各组细胞中miR-21、Smad7的mRNA相对表达水平及Smad7、COLIA1、α-SMA蛋白水平,并验证miR-21与Smad7的靶向关系。结果与对照组相比,BLM组大鼠的肺系数、羟脯氨酸、肺纤维化程度,miR-21mRNA表达水平,TGF-β1、COLIA1、α-SMA蛋白表达水平显著升高均显著升高(P0.01),Smad7的mRNA及蛋白表达水平显著降低(P0.01),与BLM组相比,PC组和PAE组大鼠的肺系数、羟脯氨酸、肺纤维化程度均显著降低(P0.01);与BLM组相比,PC组和PAE组大鼠肺组织中miR-21 mRNA水平,TGF-β1、COLIA1、α-SMA蛋白水平显著降低,Smad7的mRNA及蛋白水平显著升高(P0.01);与对照组相比,TGF-β1组成纤维细胞中miR-21的mRNA及COLIA1、α-SMA蛋白水平显著升高(P0.01),Smad7的m RNA及蛋白水平显著降低(P0.01);与TGF-β1组相比,PAE-L组、PAE-M组、PAE-H组、miR-21 inhibitor组成纤维细胞中miR-21的mRNA水平及COLIA1、α-SMA蛋白水平显著降低(P0.01),Smad7的mRNA及蛋白表达水平显著升高(P0.01);靶基因数据库预测及双荧光素酶报告实验表明,miR-21靶向抑制Smad7。结论 PAE可能通过抑制miR-21表达靶向促进Smad7表达,并抑制TGF-β1表达来减轻BLM诱导的肺纤维化。     

p-Smad2/3、Smad7在大鼠实验性肾间质纤维化模型中的表达

目的观察TGF-β1/Sm ads信号传导途径在大鼠肾间质纤维化中的表达。方法W istar大鼠分为对照组、假手术组及模型组。行单侧输尿管结扎术(UUO)建立肾梗阻模型,分别于术后第3、6、14和28天处死动物。MASSON染色观察肾间质病变程度,免疫组化检测TGF-β1、p-Sm ad2/3、I型胶原以及α-SMA的改变,W estern b lot和RT-PCR方法分别检测TGF-β1、p-Sm ad2/3、Sm ad7蛋白及其mRNA表达水平。结果与对照组、假手术组相比,模型组于术后3天肾TGF-β1蛋白及mRNA、p-Sm ad2/3蛋白水平开始升高,Sm ad7蛋白表达开始减少而mRNA水平却升高,同时I型胶原、α-SMA水平升高。第14天TGF-β1、Sm ad7的变化达到峰值(P<0.01),在第28天有所回落。结论TGF-β1/Sm ads信号传导途径在肾间质纤维化形成中可能起着重要促细胞外基质沉积的作用。     

抗纤灵方对单侧输尿管梗阻大鼠TGF-β1-Smad通路的影响

目的： 研究中药复方抗纤灵对单侧输尿管梗阻（UUO）所致肾纤维化大鼠TGF-β₁-Smad通路的影响，借以初步探讨其发挥疗效的作用机制。方法: 雄性SD大鼠18只随机分为3组，假手术组、模型组、中药治疗组。用单侧输尿管结扎术建立大鼠肾纤维化模型，抗纤灵治疗两周后检测梗阻肾羟脯氨酸含量；HE染色和电镜观察肾组织病变；采用RT-PCR检测肾组织TGF-β₁ mRNA水平；蛋白免疫印迹法检测肾组织转化生长因子I型受体（TβRI）、转化生长因子II型受体（TβRII）、Smad2蛋白表达及磷酸化变化。结果: 与假手术组比较，模型组大鼠梗阻肾羟脯氨酸含量明显增多；病理观察可见肾小球毛细血管基底膜明显增厚，间质成纤维细胞和胶原沉积明显增多；肾组织TGF-β₁ mRNA及TβRI、TβRII蛋白表达显著增多，Smad2蛋白磷酸化及总蛋白表达水平均显著增多。与模型组比较，中药干预组大鼠梗阻肾羟脯氨酸含量明显减少；肾小球和肾小管基底膜仅见轻度增厚，间质成纤维细胞和胶原沉积较模型组减轻；肾组织TβRI、TβRII蛋白表达明显下调，Smad2蛋白磷酸化及总蛋白表达水平均明显下调。结论: 抗纤灵可抑制单侧输尿管梗阻大鼠TGF-β₁-Smad通路，抑制梗阻肾TβRI、TβRII、Smad2蛋白表达及Smad2蛋白磷酸化，从而改善梗阻性大鼠的肾间质纤维化，减少纤维化肾脏中胶原蛋白含量。     

川芎嗪对肾间质纤维化中TGF-β1/miR-29表达的影响

目的:观察川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)对单侧输尿管结扎(unilateral ureteral obstruction,UUO)大鼠模型肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis,RIF)、间质损伤及TGF-β1/miR-29表达的影响.方法:50只雄性Wistar大鼠随机分为5组:正常对照组(Ctrl组)、假手术组(Sham组)、模型组(UUO组)、缬沙坦组(VAN组)和TMP组各10只.经相应处理后,通过HE,Masson染色观察肾组织的病理学表现;同时采用SP免疫组织化学法检测各组病变组织中TGF-β1的表达情况;最后采用RT-PCR技术比较各组TGF-β1,miR-29基因的表达.结果:HE染色结果显示Ctrl组、Sham组、UUO组、VAN组及TMP组的肾间质损伤评分分别为0.27±0.10,0.30±0.12,8.79±1.03,6.23±0.81及4.57±0.74.Masson染色胶原半定量分析结果显示Ctrl组、Sham组、UUO组、VAN组及TMP组的评分分别为0.21±0.03,0.23±0.06,2.49±0.33,1.63±0.07及1.32±0.04.SP免疫组织化学染色显示模型组TGF-β1的蛋白表达高于对照组;而缬沙坦和TMP可部分逆转TGF-β1蛋白的表达,且TMP的效果优于缬沙坦.RT-PCR结果显示模型组的TGF-β1 mRNA表达增高、miR-29 mRNA表达降低.TMP组和缬沙坦组TGF-β1 mRNA表达明显低于模型组,而miR-29 mRNA表达则明显高于模型组;且TMP 组TGF-β1 mRNA表达高于缬沙坦组.结论:缬沙坦和TMP可明显减轻UUO致RIF中肾组织学损伤,且TMP的疗效优于缬沙坦.此外TMP还可抑制TGF-β1而促进miR-29的表达.     

细胞增殖抑制基因调控慢性阻塞性肺疾病大鼠 Wnt/PCP通路抑制气道成纤维细胞增殖

目的探讨细胞增殖抑制基因(HSG)在大鼠慢性阻塞性肺疾病(COPD)气道重建中Wnt/PCP通路的作用及其机制。方法将大鼠分为对照组和COPD模型组;采用烟熏+气道内注射脂多糖建立;取气管做小气道成纤维细胞原代培养,第3代细胞系用于实验。HE染色鉴定肺组织是否造模成功。ELISA检测培养上清液中MMP-9、PDGF和TGF-β1的表达;real-time PCR检测成纤维细胞中HSG、PDGF、TGF-β1和RhoA的mRNA的表达;Western blot法检测成纤维细胞HSG和RhoA蛋白表达。结果模型组成纤维细胞上清液中PDGF、TGF-β1和MMP-9表达显著高于对照组(P0.01);模型组成纤维细胞中HSG mRNA及蛋白表达显著低于对照组(P0.01);RhoA蛋白及PDGF、TGF-β1和RhoA mRNA表达显著高于对照组(P0.01)。HSG表达与MMP-9、PDGF、TGF-β1和RhoA表达呈负相关(P0.01)。结论 HSG可能通过调控Wnt/PCP通路,抑制大鼠气道成纤维细胞的增殖从而参与气道重建。     

miR-499通过靶向TGF-α抑制人骨肉瘤细胞系Saos2迁移和促凋亡

目的 探索miR-499靶向TGF-αmRNA蛋白水平调控人骨肉瘤细胞系Saos2细胞迁移和凋亡参与骨肉瘤的发病机制。方法 RT-qPCR检测miR-499和TGF-α在骨肉瘤组织中的表达差异;采用双荧光素酶报告基因实验检测miR-499和TGF-α靶向关系;Transwell小室法和TUNEL凋亡实验检测Saos2细胞迁移和凋亡;构建骨肉瘤裸鼠移植瘤模型,检测miR-499/TGF-α轴在体内实验中的调控机制。结果 骨肉瘤组织,miR-499表达降低(P<0.01),而TGF-αmRNA高表达(P<0.01)。miR-499靶向负调控TGF-αmRNA蛋白表达(P<0.01)。转染miR-499模拟物能抑制Saos2细胞迁移和促进凋亡(P<0.01),而TGF-α则促进细胞迁移和抑制凋亡(P<0.01),同时miR-499能抑制TGF-α的促癌效果。结论 miR-499抑制TGF-αmRNA蛋白水平从而抑制骨肉瘤细胞的生物学功能,提示miR-499可能具有抑制骨肉瘤发展的作用。     

阿托伐他汀对百草枯中毒大鼠肺纤维化的影响及机制研究

目的观察阿托伐他汀对急性百草枯(PQ)中毒大鼠肺间质成纤维细胞中基质金属蛋白酶及Smad3的表达影响,探讨其在PQ中毒致肺纤维化中的意义。方法 SD大鼠105只,随机分为对照组15只、百草枯组45只、阿托伐他汀组45只,后2组按时间点又随机分为3组。百草枯组、阿托伐他汀腹腔内注射百草枯35 mg/kg,对照组注射等体积无菌生理盐水,阿托伐他汀组给与阿托伐他汀1.5 mg/(kg.d)灌胃治疗。7、14、21 d后分离和提取肺间质成纤维细胞。采用RT-PCR检测肺组织MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA及Smad3 mRNA的表达。应用免疫细胞化学观察MMP-2、MMP-9、TGF-β1及用碱水解法检测HYP的表达量,观察肺病理学变化。结果与百草枯中毒比较,阿托伐他汀组MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA、Smad3 mRNA表达减少,MMP-2、MMP-9表达也减少,TGF-β1、HYP显著降低,具有统计学意义(P<0.05);病检发现:阿托伐他汀组炎细胞减少,可见成纤维细胞,周围较多正常肺组织,肺纤维化较白草枯中毒组明显减轻。结论阿托伐他汀具有抑制MMP-2 mRNA及MMP-9 mRNA的表达,进而减少MMP-2及MMP-9的表达,抑制Smad3 mRNA的表达,使TGF-β1及HYP生成减少,使肺间质纤维化明显减轻。     

miRNA-144抑制小鼠RAW264.7巨噬细胞ABCA1表达

目的构建miR-144真核表达载体,检测miR-144是否调控小鼠RAW264.7巨噬细胞三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)的表达。方法结合文献,通过预测软件分析,选取评分较高、可作用于ABCA1 mRNA 3'非编码区(ABCA1 mRNA3'UTR)的miR-144。通过分子克隆技术,利用PCR扩增miR-144和ABCA1 mRNA 3'UTR的DNA序列,酶切胶回收后,分别连接至真核表达载体pcDNA3.1(+)载体和pcDNA3.1(+)-luciferase载体上。测序后,运用双荧光素酶报告基因系统检测萤火虫荧光素酶的活性,观察miR-144是否对ABCA1 mRNA 3'UTR具有直接靶向作用。运用LipofectamineTM2000将pcDNA3.1(+)空载体、pcDNA3.1(+)-miR-144转染至小鼠RAW264.7巨噬细胞。通过实时定量PCR(qRT-PCR)检测转染后miR-144的表达含量。通过qRT-PCR和Western blot法检测过表达miR-144后ABCA1在mRNA和蛋白水平的变化。结果 miR-144 PCR产物连接至pcDNA3.1(+)载体上,ABCA1 mRNA 3'UTR连接至pcDNA3.1(+)-luciferase载体上,测序正确。运用双荧光素酶报告基因系统检测发现,和对照组[pcDNA3.1(+)空载体、pcDNA3.1(+)-luciferase-ABCA1 3'UTR和PRL-SV40联合转染]三者相比,实验组[pcDNA3.1(+)-miR144、pcDNA3.1(+)-luciferase-ABCA1 3'UTR和PRL-SV40联合转染]三者可以显著降低萤火虫荧光素酶的活性(P0.05),证明miR-144对ABCA1 mRNA3'UTR具有直接靶向作用。将pcDNA3.1(+)空载体、pcDNA3.1(+)-miR-144转染至小鼠RAW264.7细胞中,qRT-PCR结果显示,转染pcDNA3.1(+)空载体组miR-144表达无明显变化(P0.05);转染pcDNA3.1(+)-miR-144组中miR-144表达量显著增高(P0.01).qRT-PCR结果显示,转染pcDNA3.1(+)空载体和pcDNA3.1(+)-miR-144对ABCA1 mRNA表达水平无明显影响(P0.05),Western blot结果显示转染pcDNA3.1(+)-miR-144可以显著降低ABCA1蛋白水平的表达(P0.01)。结论 miR-144可以在转录后水平降低ABCA1蛋白的表达。     

p27和TGF-β在大鼠肾间质纤维化中的表达及关系

目的:研究单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠肾组织p27的表达, 同时观察TGF-βmRNA在各组的变化, 探讨UUO模型中 TGF-β与p27的关系.方法:60只SD大鼠随机分成假手术组(SOR)、 UUO模型组.于术后第7、 14、 21天分别处死各组大鼠10只.用HE染色动态观察肾脏病理变化, 免疫组织化学法测定p27的蛋白表达及动态变化, RT-PCR法测定p27mRNA和TGF-βmRNA的水平.结果:SOR组肾小管上皮细胞p27蛋白及肾皮质p27mRNA的表达均强, UUO组随着间质纤维化程度的加重, p27的表达逐渐减弱, 而TGF-βmRNA随着肾间质纤维化程度的加重, 其表达呈上升趋势;UUO组TGF-βmRNA与p27mRNA成负相关.结论:p27参与了UUO大鼠肾间质纤维化的发病过程;UUO大鼠肾间质纤维化模型中TGF-β促纤维化机制可能与p27的下调相关.     

pri-miR-21重组腺病毒载体构建及其对TLR4基因调控的研究

目的:构建能高效表达成熟miR-21小分子的腺病毒载体,探讨其对TLR4基因的靶向调控关系。方法:以正常小鼠基因组DNA为模板,PCR扩增pri-miR-21基因,克隆至穿梭载体pAdTrack-CMV中经PCR、酶切及基因测序分析正确无误后,与pAdEasy-1腺病毒骨架质粒进行同源重组,并利用293A细胞,包装成pri-miR-21重组腺病毒感染HeLa细胞,通过Western blot检测TLR4的蛋白表达水平,验证miR-21与TLR4靶向调控的关系。结果:经PCR、酶切、测序及GFP表达证实,成功构建携带pri-miR-21基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒。Western blot证实,miR-21可抑制TLR4蛋白的表达。结论:所制备的小鼠pri-miR-21重组腺病毒,可以高效表达成熟miR-21小分子,能够抑制靶基因TLR4的表达。     

以CⅡTA-pⅠ作为树突状细胞特异启动子构建腺病毒双表达载体

目的 构建CⅡTA-p Ⅰ启动子特异调控的鼠TGF-β1和PLP-Ig重组双表达载体，以期达到在树突状细胞中特异表达。方法 从鼠外周血单个核细胞克隆CⅡTA-p Ⅰ启动子，从ConA刺激的小鼠脾单个核细胞和WT-1杂交瘤细胞克隆TGF-β1基因和Ig重链Fc基因；体外经IRES序列连接后，通过穿梭载体与腺病毒载体骨架连接，鉴定后在HEK293包装。从小鼠骨髓造血细胞培养树突状细胞。流式细胞仪检测树突状细胞CD80、CD54和Ⅰ-A^d的表达，鉴定树突状细胞的成熟度和纯度。病毒转染后，采用ELISA方法鉴定该病毒在树突状细胞中TGF-β1基因的表达水平；Western blot鉴定PLP-Ig的表达。结果 该双表达重组腺病毒载体经测序、限制性内切酶分析、PCR等鉴定，与预期结果一致；病毒感染树突状细胞的培养上清液和细胞分别经ELIS和Western blot检测证实TGF-β1和PLP-Ig得到了独立表达，在HEK293细胞中则无表达，并随树突状细胞的成熟，表达量逐渐增高。结论 以CⅡTA-p Ⅰ作为树突状细胞特异启动子构建的重组腺病毒双表达载体，在树突状细胞中得到了特异、独立的表达，为靶向树突状细胞表达功能基因进行基因治疗奠定了基础。     

慢病毒载体CV072介导的Mfn2过表达抑制肝星状细胞活化

目的:构建携带线粒体融合蛋白2(Mfn2)基因的慢病毒载体,并探讨Mfn2过表达对大鼠肝星状细胞活化的抑制作用及其减少肝纤维化相关因子生成的机制。方法:构建含Mfn2的慢病毒过表达载体CV072-pCMV-Mfn2-EGFP,转染肝星状细胞;荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白的表达及转染效率;RT-qPCR和Western blot法检测转染后细胞中Mfn2的mRNA和蛋白表达水平;Western blot检测Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、α-SMA、TGF-β1、Smad2和Smad3的水平;ELISA检测Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型胶原蛋白水平。结果:与各对照组相比,慢病毒过表达载体CV072-pCMV-Mfn2-EGFP转染后,细胞促凋亡蛋白表达增多,TGF-β1/Smad通路蛋白TGF-β1、p-Smad和p-Smad3的蛋白水平均降低,纤维化相关蛋白α-SMA、I型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白和IV型胶原蛋白的水平降低(P0.01)。结论:转染慢病毒过表达载体CV072-pCMV-Mfn2-EGFP在体外可有效抑制肝星状细胞活化,并可能通过抑制TGF-β1/Smad通路减少肝纤维化相关因子的生成。