湖北省大流行期和流行后期新甲型H1N1流感病毒基因特性分析

目的 了解湖北省大流行期和流行后期新甲型H1N1流感病毒在流行分布、基因进化、抗原表位和耐药位点等方面的差异情况。方法 对2009-2014年湖北省大流行期和流行后期新甲型H1N1流感病毒血凝素和神经氨酸酶的系统进化树、进化速率和氨基酸突变位点进行对比分析。结果 大流行期病毒核酸阳性率大于流行后期,但大流行期病毒血凝素和神经氨酸酶基因进化速率均小于流行后期,且神经氨酸酶进化速率在两个时期都大于血凝素。血凝素抗原表位突变位点K163Q、A186T、S185T和S203T在大流行期与流行后期病毒的分布数和位置存在不同偏嗜,流行期鲜有的H275Y耐药位点在流行后期的三株病毒中被发现。结论 流行后期的新甲型H1N1流感病毒进化速率不断提高,抗原表位和神经氨酸酶抑制剂耐药位点不断积累,防控工作愈加严峻,需进一步加强该病毒基因特性和耐药分析的监测。     

安徽省早期甲型H1N1流感病毒的血凝素基因序列分析

目的检测、分析安徽省甲型H1N1流感早期病例的病毒血凝素（HA）基因的序列特征。方法RT-PCR方法扩增我省早期流感样病例的病毒核酸并对其HA基因序列进行分析比对。结果我省早期甲型H1N1流感病例的病毒HA基因与2009年全球流行的甲型H1N1流感病毒高度同源,与古典型猪流感亲缘性较近,与欧洲和亚洲分离的A/H1N1猪流感和A/H1N1禽流感亲缘关系较远。结论我省早期流行的甲型H1N1流感毒株HA基因可能由古典型猪流感进化而来,与WHO选定的甲型H1N1疫苗候选株同源性较高,对于人季节性流感A/H1N1疫苗可能并不敏感。     

长沙市甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶基因序列分析

目的对长沙市甲型H1N1流感病毒A/changsha/78/2009的神经氨酸酶（neuraminidase,NA）基因进行测序分析,以期了解该病毒的来源及变异情况。方法利用国家流感中心（CNIC）和世界卫生组织（WHO）推荐的NA基因测序引物和CEQTM8000 Genetic Analysis System对2009年长沙市甲型H1N1流感患者阳性鼻咽拭子标本（A/changsha/78/2009）进行测序,测序结果提交至GenBank并利用Lasergene和Mega5软件对测序结果进行氨基酸比对和进化树分析。结果 A/changsha/78/2009 NA基因GenBank登录号为：GQ463958.1,与瑞典斯德哥尔摩甲型H1N1流感病毒分离株A/Stockholm/37/2009（H1N1）核苷酸同源性为100%;进化树分析显示A/changsha/78/2009 NA基因属于欧亚猪流感分支,包含A/changsha/78/2009在内的甲型H1N1流感病毒与A/swine/Spain/WVL6/1991（H1N1）亲缘关系近;A/chang-sha/78/2009与A/swine/Spain/WVL6/1991 NA基因均有7个潜在糖基化位点,A/changsha/78/2009 NA基因未发生H274Y位点突变。结论包含A/changsha/78/2009在内的甲型H1N1流感病毒NA基因可能来源于欧亚猪流感病毒,A/changsha/78/2009病毒对神经氨酸酶抑制剂类药物敏感。     

甲型H1N1流感的研究进展

甲型H1N1流感病毒是猪流感病毒（swine influenza virus，SIV）的一种新型变异株，它属正黏液病毒科甲型流感病毒属的单股RNA病毒，其与1918年引发人类浩劫的流感病毒对人类的免疫系统造成相似的反应。根据其外部糖蛋白血凝素（hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（neuraminidase，NA）的不同抗原特性可将甲型流感病毒分为多个亚型，     

甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶基因进化分析

目的 探讨2009年山东省甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(neuraminidase,NA)基因的进化及NA基因编码蛋白抗原性、酶活性位点、精基化位点变异情况.方法 对山东省分离的20株甲型H1N1流感病毒的NA基因序列,用MEGA 4.0软件进行基因进化分析和氨基酸序列分析.结果 山东省2009年9月-2010年1月分离的20株甲型H1N1流感病毒NA基因的同源性均>99.2%,其中有4株的同源性为100%;与疫苗株[A-California-07-2009(H1N1)]、国内推荐株[A-Sichuan-SWL1-2009(H1N1)]的同源性分别为99.1%～99.5%和99.1%～99.6%;有13个神经氨酸酶基因的氨基酸发生了替换,为21、23、25、42、43、60、76、94、106、122、248、307和351位;未发生神经氨酸酶蛋白275位H-Y的替换.结论 山东省分离的甲型H1N1流感病毒NA基因高度保守,潜在抗原位点氨基酸分布相同;所有毒株的酶活性中心位点以及糖基化位点均高度保守;所有测定样本均未发生对达菲类药物的耐药性突变.     

甲型流感病毒血凝素基因历史进化规律

目的探讨甲型流感病毒不同亚型血凝素（HA）基因的历史进化演变规律。方法从NCBI数据库中收集到140多个甲型不同亚型流感病毒株,涵盖人、猪、禽三个物种的不同历史时期及不同地区的病毒的HA基因序列。利用PHYLIP软件包对所选序列进行基因进化分析,构建NJ进化树;采用Clustal X软件对与2009年新型甲型H1N1流感病毒聚在同一进化分支的其他猪流感病毒的HA基因的氨基酸序列进行分析。结果人类三种主要亚型H1N1、H2N2和H3N2具有不同的时间分布特征,表现为1957年之前,主要流行株为H1N1亚型,1957-1968年为H2N2亚型,从1968年起主要流行株为H3N2亚型和H1N1亚型共同在人间传播;从20世纪80年代起流感病毒物种间隔离现象逐渐模糊,陆续出现了猪/禽/人病毒混合感染的病例,H5N1亚型流感病毒物种间隔离最弱;2009年新型甲型流感病毒与猪H1N1流感病毒聚在一支,提示2009年波及全球的新型甲型流感病毒为猪H1N1亚型病毒造成的;氨基酸序列分析显示：2009年新型甲型流感病毒HA基因中共有13个特有的氨基酸变异位点,提示这些位点可能参与了猪和人H1N1亚型病毒物种隔离屏障的限制,其功能尚需进一步确定。结论甲型流感病毒亚型间存在相互演化关系,不同物种间病毒混合感染的发生,病毒变异的机会增加。     

含甲型H1N1流感病毒HA基因序列病毒样颗粒的制备

[目的]构建耐RNase酶的内含甲型H1N1流感病毒HA基因序列的病毒样颗粒。[方法]构建中间载体pET32a-MS2,将甲型H1N1流感病毒的HA基因片段连接中间载体上,构建原核表达载体pET32a-MS2-HA,转化宿主菌,诱导表达制备病毒样颗粒,对病毒样颗粒进行荧光定量RT-PCR检测和稳定性实验。[结果]表达载体经PCR、酶切鉴定分析后证实构建成功,荧光定量RT-PCR实验表明该病毒颗粒含有HA基因片段并且颗粒稳定性良好。[结论]成功构建了含甲型H1N1流感病毒HA基因序列的病毒样颗粒且稳定性良好,有望作为甲型H1N1流感病毒RNA检测的标准品和质控品。     

焦磷酸测序技术在检测甲型H1N1血凝素基因裂解位点突变中的应用

目的基于焦磷酸测序技术建立甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)基因裂解位点突变的快速检测方法,探讨其临床应用价值。方法采用RT-PCR扩增甲型H1N1病毒血凝素基因中的HA片段,在生物信息学分析的基础上,针对甲型H1N1病毒血凝素基因含有裂解位点序列片段,分别设计一套生物素标记的PCR引物和测序引物,运用焦磷酸测序技术对含甲型H1N1病毒裂解位点基因片段进行序列测定,同时分析青岛地区甲型H1N1流感病毒流行株的裂解位点基因特征。结果建立了基于焦磷酸测序技术检测甲型H1N1流感病毒裂解位点突变方法,实现甲型H1N1流感病毒HA基因裂解位点的高通量检测,青岛地区甲型H1N1流感病毒裂解位点344氨基酸序列没有发生变异。结论本研究所建立的方法具有自动化程度高和结果准确等特点,适用于甲型H1N1流感病毒裂解位点进行快速高通量检测。     

广州市甲型H1N1流感病毒的持续进化变异监测

目的 通过对H1N1流感病毒进行基因进化变异监测,为H1N1流感的科学防控提供研究数据.方法 对广州市2017-2019年132株H1N1流感病毒进行血凝素(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)基因测序,分析不同流行年度病毒的分子变异特点.结果2017-2019年广州市H1...     

新甲型H1N1流感与中国甲型H1流感HA基因进化比较研究

目的比较新甲型H1N1流感与中国甲型H1亚型流感病毒HA基因的进化。方法用非度量多维尺度法分析下载自GenBank的中国人和猪甲型H1亚型流感HA序列及WHO北半球流感疫苗推荐株HA序列和新甲型H1N1流感HA序列,构建HA基因进化图谱。结果新甲型H1N1流感病毒HA基因与猪甲型H1亚型流感病毒的亲缘关系较近,而和中国人甲型H1亚型流感病毒及WHO近年推荐的疫苗株亲缘关系很远,并且新甲型H1N1流感病毒HA序列在进化上与中国猪甲型H1亚型流感病毒仍然存在一定距离。结论从基因层面上提示我国人群既往免疫和疫苗对新甲型H1N1流感可能不能提供有效保护,病毒有可能会在人群中流行。同时分析结果提示了尚无证据表明这次始于北美的新甲型H1N1流感来自中国。     

2009年山东省四起甲型H1N1流行性感冒样病例暴发疫情病原学分析

目的 通过对2009年山东省济宁市4起流行性感冒(简称流感)样病例暴发疫情进行病原学分离鉴定,以及对血凝素基因(HA)和神经氨酸酶基因(NA)特性分析,研究其基因变异情况.方法 采集4起流感样病例暴发疫情中发热患者的鼻咽拭子标本34份,采用逆转录实时PCR(realtime RT-PCR)方法进行核酸检测,对阳性标本开展病毒分离,并对分离的甲型H1N1流感病毒的HA、NA基因序列进行测序.利用DNAStar软件对序列进行同源性分析,利用Mega 4.0软件进行基因进化分析和氨基酸进化分析.与WHO推荐的疫苗株及国内代表株进行对比.结果 在34份鼻咽拭子标本中,17份甲型H1N1流感病毒阳性,11份标本分离培养出了甲型H1N1流感病毒.将其中的7株进行HA基因和NA基因测序,HA、NA基因的同源性分别为98.4%～99.6%、99.2%～100.0%.与WHO推荐的疫苗株及国内代表株相比,有11个HA基因的氨基酸发生替换,分别为38、40、56、90、100、145、172、173、220、303及338位,其中38、40和303位位于抗原决定簇C区,172和173位位于抗原决定簇D区,56位位于抗原决定簇E区,同时40位为糖基化位点;有7个NA基因的氨基酸发生了替换,为80、106、241、248、351、369和386位,386位为糖基化位点;未发生神经氨酸酶蛋白275位H-Y的替换.结论 山东省甲型H1N1流感暴发流行株HA基因和NA基因均具有高度同源性,HA蛋白和NA蛋白均存在不同程度的氨基酸替换,部分流行株抗原决定簇和糖基化位点发生改变.     

2014-2016年镇江地区甲型H1N1流感病毒分子进化特征研究

目的 了解镇江地区甲型H1N1流感病毒流行和变异特点。方法 收集2014-2016年镇江地区哨点医院流感样病例标本,进行核酸检测和病毒分离。在病毒流行期按月随机抽取13株甲型H1N1毒株,设计特异性的引物扩增血凝素（hemagglutinin,HA）、神经氨酸酶（neuraminidase,NA）基因,进行测序并分析其遗传进化特征。结果 13株分离株与疫苗株A/California/07/2009的HA基因核苷酸和氨基酸的同源性分别为97.3%~100.0%和96.6%~100.0%;NA基因核苷酸和氨基酸同源性分别为95.6%~97.5%和93.8%~96.6%。系统进化分析表明,13株病毒HA和NA基因分属于不同的进化谱系。分子特征表现为12株HA氨基酸序列均发生了抗原位点Sa区K173Q突变,1株同时发生了Sa区K181E突变;3株还发生了Ca1区V183I突变。受体结合位点和糖基化位点的氨基酸序列均未发生变异。结论 2014-2016年镇江地区甲型H1N1流感病毒与疫苗株相比,其HA、NA基因出现了一定程度的变异,但是抗原性并未发生改变,需进一步加强监测。     

郴州市2009年流感病原学监测及A(H1N1)NA基因特征研究

[目的]了解2009年郴州市流感病毒流行株的病原学特征,为流感防控提供科学依据。[方法]采集哨点医院ILI咽拭子标本,用MDCK细胞进行病毒分离,采用HA和HI试验对流感病毒进行分型鉴定;采集暴发疫情ILI咽拭子用PCR法检测流感病毒核酸;随机抽取4、10月份的季节性A(H1N1)流感毒株进行NA基因测序,测序结果与国内各省市流行株及WHO推荐的北半球疫苗株作同源性比对,绘制种系进化树。[结果]分离哨点医院监测标本2284份,阳性254份:其中季节性A(H1N1)109株、A(H3N2)97株、甲型H1N130株、B型18株;PCR检测3024份标本,甲型H1N1核酸阳性1002份,阳性率33.13%;BLAST比对结果显示,4、10月份的季节性A(H1N1)毒株与2009年WHO推荐的北半球疫苗毒株A/Brisbane/59/2007的核酸同源性分别为99%和98%;种系进化分析结果表明4月份分离株与疫苗株亲缘关系最近,而10月份分离株较4月份分离株已明显发生变异。[结论]2009年郴州市甲型流感病毒异常活跃,其中1～6月季节性A(H1N1)为优势毒株,7～9月A(H3N2)为优势毒株,10～12月甲型H1N1为优势毒株,且出现甲型H1N1流感大流行。季节性A(H1N1)病毒在流行过程中NA基因已经发生了一定的变异,有必要持续跟踪和监测其变异情况。     

2009—2010年珠海口岸入境人员中发热病例流感病毒分子流行病学研究

目的研究2009甲型H1N1流感疫情全球大流行期间珠海口岸入境发热旅客流感病毒的分子流行病学特征。方法选择2009年5月至2010年4月经珠海各口岸入境的976例发热旅客(体温≥37.5℃)为研究对象,采集咽拭子样本并提取病毒核酸,采用3个多重RT-PCR实验进行甲型、乙型和2009新甲型H1N1流感病毒的筛查以及甲型流感病毒的分子分型检测。此外,随机选择8株2009甲型H1N1流感病毒进行HA和NA基因全长RT-PCR扩增和序列分析。采用SPSS17.0软件对流行病学和实验数据进行统计学分析。结果976例发热旅客中检出流感病毒阳性病例331例,其中甲型流感占96.98%(321/331),乙型流感占3.02%(10/331);321例甲型流感病毒分子分型结果为新甲型H1N1流感92例,占28.66%,人季节性H1N1流感65例,占20.25%,人季节性H3N2流感164例,占51.09%。序列分析显示珠海口岸输入性新甲型H1N1流感病毒的HA和NA基因与甲型流感典型毒株A/California/04/2009(H1N1)的同源性分别达到99.86%和99.89%。结论本研究所阐明的珠海口岸流感病毒的分子流行病学特征对于指导国境口岸流感的防控具有重要参考价值。     

浙江省1998--2009年H3N2亚型流感流行株基因组全序列分析

目的 从基因组全序列分析探讨浙江省1998-2009年H3N2亚型流感病毒的基因变异与流感流行的关系.方法 选择浙江省1998-2009年流感流行期间分离到的H3N2亚型流感病毒流行代表株19株,采用RT-PCR方法扩增其8个基因片段后进行序列测定,并与近十余年间使用的疫苗株序列进行比较.结果 H3N2亚型流感流行株HA和NA基因的氨基酸变异率最高,分别为13.98%和10.00%;其他6个内部基因所表达的蛋白中,除NP、M2和NS1(氨基酸变异率分别为6.43%、6.19%和3.48%)外,其他蛋白的氨基酸变异均＜3.00%;在H3N2亚型流感存在较大范围流行的年份,除HA和NA基因外,流感病毒其他6个内部基因也会发生不同程度的变异.此外,在以往一些年份中,WHO推荐的H3N2流感病毒疫苗株与浙江省同期流行株之间,在许多基因上存在着滞后现象.结论 在加强对H3N2亚型流感毒株表面HA与NA基因监测的同时,也应注意到其他内部基因的变异,为新一轮流感流行株的出现提供重要的预警信息.     

2008—2009年南宁市人季节性H1N1流感病毒神经氨酸酶潜在的抗原位点和抑制剂耐药位点分析

目的了解2008—2009年南宁市人季节性H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)基因的遗传进化特征,探讨NA基因潜在的抗原位点和活性位点(抑制剂耐药性位点)变异规律。方法提取2008—2009年20株H1N1流感病毒RNA,采用RT-PCR扩增病毒NA基因后进行序列测定,通过CTLPred软件预测NA基因上潜在的抗原位点,并对NA分子进化和其重要功能位点的遗传变异进行分析。结果将20株H1N1流感病毒毒株与北半球疫苗推荐株A/Solomon/3/2006和A/Bris-bane/59/2007构建进化树,NA进化树共分成3个类群,10株2008年H1N1流感病毒毒株聚集成分支Ⅱ,10株2009年毒株与疫苗株A/Brisbane/59/2007聚集成分支Ⅰ,A/Solomon/3/2006则独立形成1个分支(Ⅲ)。2008年毒株抗原位点替换频率较高,相对于A/Solomon/3/2006氨基酸替换分布在不同的3个区域的3个位点,分别是N64H、Y100H、L367I;2009年度的毒株抗原决定簇位点相对保守。在已知NA的酶活性位点中,2009年所有毒株均在275位点发生了H>Y的突变,而这种变异在2008年的毒株中未有出现。结论 A/Solomon/3/2006落后于2008年毒株,A/Brisbane/59/2007对应的疫苗在2009年能起到较好的保护作用;大量H275Y耐药株的出现提示在流感病毒监测中应密切关注其耐药位点的变异。     

河南省甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶基因进化分析

目的分析河南省甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)基因的变异情况,了解其变异现状及特点。方法对35株甲型H1N1流感病毒毒株提取病毒总RNA,设计引物运用RT-PCR技术扩增编码NA蛋白的基因序列,测序分析核酸序列并用MEGA4.1软件构建进化树,用BLAST进行比对分析。结果分离株NA基因316位G/A和742位A/G(N端106位V/I和248位N/D)发生变异,2个突变位点同时存在;同时,通过BLAST分析,发现我国多个省份和亚洲其它多个地区病毒株NA基因存在945位A/G和1 338位T/C突变,进化树分析发现,这两个位点的突变可能来自于中国猪-人之间相互感染。结论甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)基因在中国内地传播期间个别核酸位点发生了突变,其氨基酸抗原区有一位点发生变异(106 V/I)。     

青海省流感病毒病原学监测及H3亚型血凝素基因变异研究

目的 监测青海省2007～2008年度季节性流感病毒型与亚型分布,了解2007～2008年度部分A/H3N2分离株血凝素(HA)基因变异情况.方法 采集监测哨点医院流感样病例的鼻咽双拭子标本,接种MDCK细胞,采用标准抗血清鉴定阳性分离株型与亚型,并对2007～2008年度部分H3亚型流感病毒进行HA基因测序,分析HA基因变异情况.结果 2007～2008年度在哨点医院送检标本中共分离到144株流感病毒,其中124株为A/H3N2,B型20株,型与亚型有明显分布强弱特征.H3亚型HA序列分析,青海省6株分离株与2008、2009年部分省份分离株及江西同期分离株接近,与WHO 2008～2009年度疫苗推荐株相近.结论 WHO推荐的2006～2007年度疫苗株A/Hiroshima/52/2005滞后于在我省流行的流感病毒毒株.     

浙江省1999--2010年乙型流感病毒血凝素 和神经氨酸酶基因变化特征分析

目的 分析1999-2010年浙江省乙型流感病毒主要抗原基因血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的分子变异特征.方法 采集浙江省流感暴发疫情和哨点监测医院的流感样患者呼吸道标本,荧光定量RT-PCR快速检测和病毒分离,选取乙型流感病毒分离代表株进行HA和NA基因测序,采用生物信息学软件分析变异和进化.结果 共分析浙江省乙型流感病毒分离株34株,其中Victoria系20株,Yamagata系14株;1999-2010年间Victoria系毒株的HA1基因变异率4.5%,Yamagata系毒株为3.4%;2004年后分离的Victoria系毒株均为基因重配株,HA属于Victoria 系,而NA属于Yamagata系;2010年新型甲型HINI流感流行高峰过后,浙江省仍以乙型流感病毒流行为主,分离株与2009-2010年流感疫苗株B/Brisbane/60/2008接近,与往年乙型流感毒株相比HA和NA发生多个氨基酸位点变异.结论 1999-2010年浙江省乙型流感病毒流行株发生明显变异,基因重配和抗原漂移是病毒发生变异的主要机制.

Abstract：

Objective To Characterize the genetic diversity of hemagglutinin(HA)and neuraminidase(NA)of influenza B viruses isolated in Zhejiang province during 1999-2010.Methods Respiratory specimens were collected from patients with flu-like syndrome during the influenza outbreaks or from the hospitals which carrying out influenza surveillance project in Zhejiang province.Samples were detected by real-time RT-PCR and isolated for influenza virus.HA1 and NA genes of influenza B virus isolates were amplified and sequenced.Phylogenetic comparison and genetic diversity analysis were performed using the bioinformation software.Results A total of 34 influenza B viruses were evolved in this study including Victoria-like and Yamagata-like strains according to the results of the HI test.The mutation rate of Victoria-like HA1 gene was 4.5% and Yamagata-like HA1 gene was 3.4%,respectively.The Victoria-like influenza B isolates had appeared to be all re-assortants having a Victoria lincage HA and Yamagata lineage NA since 2004.The predominant type of influenza virus isolates in 2010 was also influenza B virus after the H1N1 flu pandemic in Zhejiang province.The isolated strains were antigenicaily and genetically similar to B/Brisbane/60/2008--the vaccine strain proposed for 2009-2010.Many difierences of HA1 and NA amino acids existed in the current isolates when compared to previous influenza B strains.Conclusion Significant diversity was generated among influcnza B virus isolated from 1999 to 2010 in Zhejiang province.Genetic re-assortment and antigenic drift seemed the main evolutionary mechanism on influenza B virus.