钙库操纵的钙内流在转化生长因子-β1促进气道平滑肌细胞增殖中的作用

目的:探讨钙库操纵的钙内流(SOCE)在转化生长因子-β1(TGF-β1)促进气道平滑肌细胞(ASMCs)增殖中的作用.方法:体外培养大鼠ASMCs,以Fluo-3/AM为细胞内钙离子浓度示踪剂,观察ASMCs在TGF-β1作用后,细胞内基础钙离子浓度、钙释放和SOCE的变化;四甲基偶氮唑蓝(MTT)微量比色法测定TG...     

沙丁胺醇对大鼠支气管平滑肌细胞容量性钙内流的影响

目的:观察沙丁胺醇对正常和IL-13刺激的大鼠支气管平滑肌细胞(rBSMC)胞质Ca2+信号的影响,探讨沙丁胺醇治疗哮喘的作用机制。方法:体外培养大鼠支气管平滑肌细胞,利用共聚焦显微镜测定胞质Ca2+水平,观察沙丁胺醇作用后正常和IL-13刺激后的rBSMC的钙池Ca2+释放和容量性Ca2+内流(CCE)的变化。结果:IL-13 10μg/L处理24 h后,rASMC的Ca2+释放和Ca2+内流均高于正常对照组;10μmol/L沙丁胺醇不影响正常rASMC的Ca2+释放,但是显著抑制CCE;10μmol/L沙丁胺醇对IL-13刺激后的Ca2+释放和CCE的上升均有抑制作用。结论:沙丁胺醇可以抑制Th2细胞因子刺激后的气道平滑肌细胞的容量性Ca2+内流,从而降低胞质Ca2+水平。提示容量性CCE在气道高反应性的发生以及beta 2受体激动剂的治疗效应中具有重要作用。     

滨蒿内酯对ryanodine介导哮喘豚鼠气道平滑肌细胞内钙释放的抑制作用

目的该实验就滨蒿内酯(Scoparone,Sco)降低气道平滑肌细胞(airway smooth muscle Cells,ASMC)细胞内钙浓度(cytoplasmic Ca2+concentration,[Ca2+]i)的途径及平喘作用的机理进行初步的探讨。方法建立卵蛋白诱导的哮喘豚鼠模型,通过离体豚鼠气管环的舒缩实验和测定培养的ASMCs[Ca2+]i浓度的方法,分析Sco对哮喘豚鼠ryanodine受体介导的内钙释放的影响。结果显示在细胞外含钙或无钙时,预先给予Scoparone可抑制5μmol/L ryanodine引起的正常、哮喘组豚鼠离体气管环收缩反应;Scoparone可明显降低对照组及哮喘组豚鼠原代培养ASMCs[Ca2+]i水平且哮喘组更为明显(P<0.01);Scoparone明显降低原代培养的ASMCs[Ca2+]i对5μmol/L ryanodine的反应性(P<0.01)。结论 Sco明显降低正常和哮喘豚鼠原代培养的ASMCs[Ca2+]i,对后者的作用明显大于前者;Sco对ASMCs的[Ca2+]i降低作用主要是通过抑制细胞内钙释放途径实现的,明显抑制哮喘豚鼠ASMCs ryanodine受体介导的内钙释放。     

反义ClC-3寡核苷酸对thapsigargin触发 的Ca2+ 运动的影响

 【目的】 研究反义ClC-3寡核苷酸对Thapsigargin (TG)触发的Ca2+ 运动的影响。【方法】 在PC12 细胞中转染反义ClC-3寡核苷酸,利用生物荧光影像分析系统测定胞浆Ca2+ 技术探讨ClC-3寡核苷酸对TG触发的Ca2+ 运动的影响。【结果】 与对照组相比,反义寡核苷酸转染对TG触发的PC12细胞静息[Ca2+]i的Ratio值和Ca2+ 释放量的Ratio值无显著影响(P>0.05)?但使Ca2+ 内流量明显升高(P<0.05)?Ca2+ 池操纵性Ca2+ 通道(store-operated Ca2+ channels, SOCC)阻断剂SK&;F96365可以浓度依赖的抑制TG触发的PC12细胞Ca2+ 内流,但与随义?正义寡核苷酸转染组相比, SK&;F96365对反义转染组细胞Ca2+ 内流的抑制作用明显增强(P<0.05)。【结论】 ClC-3蛋白参与TG触发的Ca2+ 池操纵的Ca2+ 内流(store-operated Ca2+ entry,SOCE),但对细胞静息钙水平及钙释放过程没有影响。     

1800 MHz射频电磁场通过瞬时受体电位C通道影响原代大鼠皮层神经元突起生长

目的 研究1 800 MHz射频电磁场(radio frequency electromagnetic field,RF-EMF)对原代培养皮层神经元突起生长的影响,并通过瞬时受体电位C通道介导的钙内流,探讨RF-EMF对突起生长影响的机制.方法 将原代培养皮层神经元(primarily cultured cortical neurons,PCCNs)用随机数表法分为4组:假暴露(Sham)、Sham+SKF-96365、辐照组(RF)和RF+SKF-96365组.使用sXc-1800辐照系统,1 800 MHz频率talk模式,5 min开10 min关,比吸收率为4 W/kg,辐照组辐照时间分别为12、24 h和48 h.SKF-96365干预处理是在维持培养基中加入SKF-96365(5μmol/L)后与假暴露组、RF组进行相同的处理.辐照结束后即刻进行以下指标检测:①细胞活力(CCK-8法)和LDH释放;②TRPC1、TRPC3蛋白表达(Western blot);③钙库操纵性钙内流变化(store-operated calcium entry,SOCE)(激光共聚焦显微镜);④神经元突起总长度、初级突起数和分支数(Tuj-1免疫荧光染色).结果 RF组细胞活力和LDH释放与相应Sham组相比差异均无统计学意义(P＞0.05).与Sham组比较,RF组辐照24 h后,TRPC1和TRPC3蛋白表达分别降低24％和23％,SOCE下降54％,辐照48 h引起PCCNs突起总长度、初级突起数和分支数分别下降20％、12％、31％,以上变化均有统计学意义(P＜0.05).Sham+SKF-96365组SOCE下降24％,突起总长度、初级突起数、分支数分别下降10％、12％、24％,与Sham组比较均有统计学意义(P＜0.05),而RF+ SKF-96365组SOCE和突起总长度、突起数、分支数的变化与RF组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 RF-EMF可引起原代皮层神经元突起长度、初级突起数和分支数减少,该效应可能与TRPC1和TRPC3通道蛋白表达降低和TRPC通道介导的钙信号减弱有关.     

硝苯地平和SK&F 96365对cyclopiazonic acid触发的大鼠主动脉血管环收缩效应的影响

目的探讨介导Ca2+池操纵性Ca2+内流的Ca2+通道特性.方法取大鼠胸主动脉环,每个动脉环长约2.5 mm,用张力换能器记录主动脉环收缩反应.结果 (1)cyclopiazonic acid(CPA,1～100 μmol.L-1)以浓度依赖性触发大鼠主动脉环的双相收缩反应(收缩峰和平台),10 μmol.L-1为最大效应浓度.(2)SK&F 96365(1～60 μmol.L-1)以浓度依赖性抑制CPA触发血管环收缩平台.(3)硝苯地平1 μmol.L-1阻断电压依赖性Ca2+通道后,SK&F 96365 30 μmol.L-1仍能抑制CPA触发血管环收缩平台.结论电压依赖性Ca2+通道和Ca2+池操纵性Ca2+通道介导了CPA触发的大鼠主动脉环平滑肌的收缩反应.     

阿奇霉素通过TRAF6/NF-κB/VEGF信号通路抑制哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖

目的 探讨阿奇霉素(AZM)抑制哮喘大鼠气道平滑肌细胞(ASMCs)增殖的作用机制.方法 30只SD大鼠分为对照组、哮喘模型组、AZM组.以卵蛋白(OVA)致敏、激发制备哮喘模型,用医学图像分析系统测定各组大鼠肺组织气道相关参数;组织贴块法分离培养原代ASMCs,并向AZM组ASMCs中分别转染血管内皮生长因子(VEGF)过表达载体或肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)过表达载体.蛋白质印迹法测定VEGF、核因子κB(NF-κB)p65和TRAF6蛋白表达水平;CCK-8试剂盒检测ASMCs的增殖情况.结果 AZM明显抑制哮喘大鼠总管壁厚度、内壁厚度、平滑肌厚度的增加(P<0.05),也明显抑制哮喘模型组ASMCs的增殖(P<0.05).AZM明显抑制哮喘诱导的NF-κB p65和VEGF蛋白表达的增加(P<0.05);过表达VEGF明显减弱AZM对ASMCs增殖的抑制效应(P<0.05).AZM明显抑制哮喘诱导的TRAF6的高表达(P<0.05);过表达TRAF6明显减弱AZM对NF-κB p65和VEGF蛋白表达及ASMCs增殖的抑制作用(P<0.05).结论 AZM能够抑制哮喘大鼠ASMCs的增殖,其部分机制可能是通过抑制TRAF6/NF-κB/VEGF信号通路而实现的.     

IL-19对哮喘模型大鼠气道平滑肌细胞增殖的影响

目的探讨IL-19对哮喘大鼠气道平滑肌细胞(ASMCs)增殖的作用。方法通过对大鼠进行雾化卵清蛋白,制备哮喘模型大鼠。提取哮喘大鼠ASMCs进行培养,分别以1μg/L、10μg/L、100μg/L IL-19干预ASMCs生长。采用流式细胞仪、MTT法检测ASMCs增殖情况,观察不同浓度IL-19对ASMCs增殖的影响。结果与正常鼠相比,慢性哮喘大鼠ASMCs增殖明显,处于S期的细胞比例明显增高。经10μg/L、100μg/L IL-19干预后,慢性哮喘大鼠ASMCs处于S期的细胞比例减少,增殖亦减弱。且两组间比较有明显差异。而经1μg/L IL-19干预后,慢性哮喘大鼠ASMCs处于S期的细胞比例及增殖均无明显变化。结论一定浓度的IL-19可能抑制慢性哮喘大鼠ASMCs的增殖。     

硝苯地平和SK&F96365对环匹阿尼酸引起的平滑肌细胞质游离Ca2+ 浓度升高作用的影响

目的探讨介导Ca2+池操纵性Ca2+内流的Ca2+通道特性. 方法以Fura-2荧光探针测定细胞质游离Ca2+浓度([Ca2+]i). 结果 (1)10 μmol/L环匹阿尼酸(CPA)可触发大鼠主动脉平滑肌细胞[Ca2+]i的双相升高(峰值和持续相).(2)SK&F96365(5～40 μmol/L)以浓度依赖性抑制CPA触发的[Ca2+]i升高持续相.(3)1 μmol/L硝苯地平阻断电压依赖性Ca2+通道后,20 μmol/L SK&F96365仍能抑制CPA触发的[Ca2+]i升高持续相;而在20 μmol/L SK&F96365抑制CPA触发[Ca2+]i升高持续相后,1 μmol/L硝苯地平不能产生进一步的抑制作用. 结论电压依赖性Ca2+通道和Ca2+池操纵性Ca2+通道介导了Ca2+池操纵性Ca2+内流.     

TRPC6介导血管紧张素Ⅱ诱导血管平滑肌细胞的增殖

目的 探讨瞬时受体电位阳离子通道6(TRPC6)在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导大鼠的血管平滑肌细胞(VSMC)增殖中的作用.方法 应用组织贴块法培养大鼠主动脉VSMC,用AngⅡ刺激VSMC建立细胞增殖模型,应用Western blot技术检测平滑肌细胞的TRPC6表达水平,采用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT法)检测不同浓度的SKF96365(TRPC通道阻断剂)和不同浓度的flufenamic acid(TRPC6激动剂)对VSMC增殖的影响.结果 Western blot显示在VSMC中TRPC6通道蛋白表达水平很高.用SKF96365(10、50、100 μmol/L)阻断TRPC6通道后.经过72h的作用抑制AngⅡ诱导的VSMC的增殖,且呈剂量依赖性.用flufenamic acid(10、20、40 μmol/L)激动TRPC6通道,经过24 h的作用促进了VSMC的增殖.结论 在AngⅡ诱导大鼠的血管平滑肌细胞增殖中,TRPC6通道起着很重要的作用.     

SKF96365和氯化镍对环匹阿尼酸诱导的大鼠PASMC［Ca2＋］i升高的影响

目的：研究SKF96365和氯化镍（NiCl2）对环匹阿尼酸（CPA）诱导的大鼠远端肺动脉平滑肌细胞（PASMC）内游离钙离子浓度（[Ca2＋]i）变化的影响。方法培养大鼠PASMC,运用荧光显微镜和InCyte细胞内钙浓度检测系统观测CPA、SKF96365和NiCl2对PASMC[Ca2＋]i的影响。结果含5μmol／L硝苯地平的无钙Krebs溶液孵育PASMC,10μmol／LCPA使PASMC[Ca2＋]i短暂小幅升高,恢复细胞外Ca2＋至2．5mmol／L后,10μmol／LCPA使PASMC[Ca2＋]i迅速显著升高;50μmol／LSKF96365和500μmol／LNiCl2均能明显抑制10μmol／LCPA引起的PASMC[Ca2＋]i升高,但对高钾（60mmol／LKCl）溶液引起的PASMC[Ca2＋]i升高无影响。结论CPA可致大鼠PASMC[Ca2＋]i升高,且能被SKF96365和NiCl2阻断,提示CPA可能诱发细胞外Ca2＋经钙池操纵性钙通道（SOCC）内流,SKF96365和NiCl2能选择性抑制SOCC活性使经SOCC的Ca2＋内流减少。     

心钠素对高血压大鼠动脉平滑肌细胞离子泵活性和基因表达的影响

目的 探讨心钠素(ANP)对自发性高血压大鼠(SHR)动脉平滑肌细胞膜(ASMC)Na+,K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性及Na+,K+-ATP酶α,亚单位、Ca+-ATP)酶亚型1(PMCA1)mRNA表达的影响.方法 对SHR大鼠,予不同浓度ANP和血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)干预,通过放射免疫、生化酶学和逆转录-聚合酶链反应等方法,检测ASMC的ANP、AngⅡ含量,ATP酶活性及其mRNA表达变化并设WKY大鼠为对照.结果 SHR大鼠ANP含量比WKY大鼠下降[(7.3±2.4)pg·10-6比(19.3±3.3) Pg·10-6,P＜0.01],Ang Ⅱ含量增加[(57±4)pg·10-6比(44±4) pg·10-6,P＜0.01],Na+,K+-ATP酶、Ca2+-A11)酶活性及Na+,K+-ATP酶α1亚单位、PMCA1 mRNA表达均显著降低[Na+,K+-ATP:(4.3±0.8) μmol·h-1·mg-1比(5.3±1.0) μmol·h-1·mg-1,Ca2+-ATP酶:(3.2±0.7)μmol·h-1·mg-1比(4.5±0.7) μmol·h-1·mg-1,α1亚单位:0.524±0.025比0.704±0.116,PMCA1:0.193±0.030比0.547±0.045](P＜0.05～P＜0.01).ANP可增加SHR大鼠Na+,K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性及Na+,K+-ATP酶α1,亚单位及PMCA1 mRNA表达(均P＜0.01),Ang Ⅱ则抑制Ca2+-ATP酶活性和PMCA1 mRNA表达(P＜0.05～P＜0.01),仅1×10-7 mol/L AngⅡ抑制Na+,K+-ATP酶活性及α1亚单位mRNA表达,ANP能拮抗AngⅡ对两种ATP酶活性及其mRNA表达的效应.ANP也能拮抗AngⅡ对WKY大鼠Ca2+-ATP酶活性及PMCA1mRNA表达的效应,对Na+,K+-ATP酶活性及α1亚单位mRNA表达无影响(P＞0.05).结论 高血压大鼠ASMC两种ATP酶活性和基因表达下降与局部ANP和AngⅡ分泌异常有关,ANP能拮抗AngⅡ对两种ATP酶活性和基因表达的效应.     

caveolin-1和P21在罗红霉素抑制哮喘离体气道平滑肌细胞增殖中的作用

目的：探讨caveolae/caveolin-1和P21在罗红霉素抑制离体哮喘大鼠气道平滑肌细胞（ASMCs）增殖中的作用。方法：复苏冻存的哮喘ASMCs,CCK-8法检测不同浓度罗红霉素[A组（无罗红霉素）、R10组（罗红霉素10 µg/mL）、R25组（罗红霉素25 µg/mL）、R50组（罗红霉素50 µg/mL）、R100组（罗红霉素100 µg/mL)]干预哮喘ASMCs后细胞的增殖情况,透射电镜观察各组caveolae的表达,Western Blot法检测各组caveolin-1、P21的蛋白表达。结果：罗红霉素抑制哮喘ASMCs的增殖作用具有浓度依赖性,随罗红霉素浓度增加,caveolae的表达逐渐增加,caveolin-1、P21的蛋白表达亦逐渐增加,且R50组或R100组与A组、R10组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。相关分析示哮喘ASMCs增殖活性与caveolin-1、P21蛋白表达呈负相关（r= -0.881、r=-0.951,P＜0.05）,caveolin-1蛋白表达与P21蛋白表达呈正相关（r=0.957,P＜0.01）。结论：罗红霉素可能通过上调caveolae/caveolin-1的表达,引起P21蛋白表达增加,从而抑制离体哮喘ASMCs的增殖。     

薄荷醇增强白介素-13诱导的人支气管上皮细胞粘液蛋白5AC的合成与分泌

目的 研究白细胞介素-13（IL-13）联合薄荷醇对人支气管上皮细胞（16HBE）黏液蛋白（MUC）5AC合成及分泌的影响,并探索瞬时受体电位通道（TRP）melastatin 8（TRPM8）和抗凋亡因子B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）在此环节中所起的作用。方法 将16HBE细胞分为：对照组、IL-13组（培养基加入终浓度10 ng/mL的IL-13连续刺激）、薄荷醇组（于第6天加入1 mmol/L薄荷醇刺激）、IL-13+薄荷醇组（IL-13连续刺激6 d后加入1 mmol/L薄荷醇刺激）,观察各组MUC5AC表达量、胞内Ca2+浓度和Bcl-2表达;予以Bcl-2抑制剂ABT-263、TRPM8离子通道特异性抑制剂BCTC干预,观察两者对各组MUC5AC的影响及BCTC对胞内Ca2+浓度、Bcl-2表达的影响。CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术检测各组细胞内Ca2+荧光强度,实时荧光定量PCR检测MUC5AC及Bcl-2mRNA水平,酶联免疫吸附法检测培养液中MUC5AC含量。结果 IL-13组、薄荷醇组、IL-13+薄荷醇组MUC5AC mRNA和蛋白的表达均明显高于对照组（P<0.05）,且IL-13+薄荷醇组最高并于24 h达到最高峰（P<0.01）;薄荷醇组、IL-13组、IL-13+薄荷醇组胞内Ca2+荧光强度、Bcl-2mRNA表达均明显高于对照组（P<0.05）,且IL-13+薄荷醇组最高（P<0.01）;予以BCTC干预后,薄荷醇组、IL-13+薄荷醇组胞内Ca2+荧光强度、Bcl-2mRNA、MUC5AC mRNA和蛋白表达水平均显著低于相应的未干预组（P<0.05）,而IL-13组未发生明显变化（P>0.05）;予以ABT-263干预后,各ABT-263干预组MUC5ACmRNA和蛋白表达水平均显著低于相应的未干预组（P<0.05）。结论 IL-13联合薄荷醇对于16HBE细胞MUC5AC的合成及分泌产生协同效应,其机制可能与TRPM8受体诱导的Bcl-2协同性增强有关。     

辛伐他汀对多柔比星损伤心肌细胞钙稳态作用的研究

目的:探讨辛伐他汀(simvastatin,SIM)对多柔比星(doxorubicin,DOX)损伤心肌细胞的保护作用。方法:将培养72 h的新生SD大鼠心肌细胞随机分为对照组、DOX损伤组、1μmol/L SIM干预组、10μmol/L SIM干预组、20μmol/L SIM干预组,继续培养24 h后,四甲基偶氮唑盐(MTT)检测心肌细胞存活率;荧光染料Fluo-3/AM检测心肌细胞内钙离子荧光强度;蛋白质印迹法检测肌浆网Ca2+-ATP酶(SERCA2a)的表达。结果:与对照组相比,DOX损伤组心肌细胞存活率明显下降(P<0.01);钙离子荧光强度明显增强(P<0.01);SERCA2a蛋白表达显著下降(P<0.01)。给予SIM处理后,心肌细胞存活率显著上升(P<0.01),钙离子荧光强度显著下降(P<0.01),SERCA2a表达明显改善(P<0.01)。结论:辛伐他汀对多柔比星损伤的心肌细胞的保护作用可能与部分改善SERCA2a的表达、抑制钙超载有关。     

脂联素对气道平滑肌细胞增殖作用及一磷酸腺苷活化蛋白激酶活性的影响

目的探讨脂联素对气道平滑肌细胞(AMSCs)增殖的影响及相关机制的研究。方法体外培养大鼠气道平滑肌细胞株;RT-PCR法检测ASMCs脂联素受体的表达;不同浓度的脂联素(5、10、20、40及80μg/mL)作用于体外培养的大鼠ASMCs,孵育不同时间,MTT法检测吸光值,计算细胞抑制率;不同浓度脂联素(5、10、20及40μg/mL)作用于气道平滑肌细胞48h后提取蛋白,Western blot法检测一磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)及磷酸化一磷酸腺苷活化蛋白激酶(pho-AMPK)的表达。结果 5～80μg/mL脂联素在不同时间(1、12、24、48及72h)明显抑制ASMCs增殖,并存在浓度依赖性(r=0.324,P0.01)和时间依赖性(r=0.607,P0.01);Western blot法检测显示空白对照组无pho-AMPK表达,干预组随着脂联素浓度的升高AMPK的活性增强(r=0.907,P0.01),pho-AMPK/AMPK比值分别为(27.66±1.03)%、(31.91±0.86)%、(75.52±2.67)%和(84.50±1.05)%,差异有统计学意义(P0.05)。结论脂联素可能通过激活AMPK来抑制体外培养的ASMC增殖。