基因治疗中的腺相关病毒载体

基因治疗是一种新型疾病治疗手段，它通过载体把正常基因或有治疗作用的基因导人靶细胞，纠正先天基因缺陷或者合成具有治疗作用的蛋白，从而达到治疗疾病的目的。腺相关病毒载体（adeno—associated virus，AAV）具有无神经毒性和低免疫原性等独特生物学优势，在基因治疗的基础研究和临床应用领域倍受重视．被认为是当前基因治疗中最有潜力的病毒载体。     

重组腺相关病毒载体在心血管疾病基因治疗中的应用

腺相关病毒体是一种有DNA缺陷的非致病性细小病毒,重组腺相关病毒载体(rAAV)源于非致病的野生型腺相关病毒,具有安全性好、宿主范围广等优点.rAAV已成为基因治疗研究的热点,特别是在心血管疾病机制探讨和治疗研究中应用广泛.在过去几十年里,rAAV在高血压、心力衰竭、动脉硬化和心肌梗死等心血管疾病基因治疗中成果显著.     

2型腺伴随病毒基因治疗载体的构建

目的：构建一种适用于中枢神经系统疾病的基因治疗载体。方法：以野生型2型腺伴随病毒（AAV-2）质粒pssv9int-及逆转录病毒载体质粒plxsn为基本元件，利用重组DNA技术，构建了一种通用型AAV载体质粒pssHG-Neo。结果：该质粒除含有必备的原核细胞复制子及Amp^r筛选基因外，还含有真核细胞筛选基因——Neo^r及供插入目的基因的多克隆位点（MCS），在MCS的上游为逆转录病毒的长末端重复序列（5’LTR），具有启动子的功能，启动定向插入到MCS的外源目的基因。质粒中的AAV反向末端重复序列（ITR）具有定点整合于人基因组19号染色体S1位点的特点。结论：AAV载体是具有广阔前景的基因治疗载体。     

小鼠Th1细胞特异性转录因子T-bet基因腺相关病毒载体的构建

目的：构建小鼠Th1细胞特异性转录因子T-bet基因的腺相关病毒载体。方法：利用RT-PCR方法，从Balb／C小鼠脾细胞的mRNA中扩增T-bet基因全长cDNA，经测序证实后插入Pzac2．1质粒。用磷酸钙沉淀法．与pAddeltaF6及p5E18质粒共转染293细胞，包装成重组的病毒颗粒。并通过抽提病毒DNA进行PCR扩增鉴定重组病毒的形成．设立eGFP基因为对照。结果：1592bp的小鼠T-bet基因被成功克隆。分析表明．与Genbank中发表的序列相比具有99．8％的同源性。重组质粒Pzac2．1-T-bet的PCR及酶切鉴定表明T-bet基因被定向插入，与pAddehaF6及p5E18质粒共转染293细胞包装成病毒后，经荧光显微镜和病毒DNA的PCR检测，证实已完成对重组病毒的包装。结论：成功构建了小鼠T-bet基因的腺相关病毒载体rAAV-T-bet，为免疫紊乱性疾病的T-bet基因干预治疗奠定了基础．     

DREAM基因小分子干扰RNA重组腺相关病毒载体的构建与鉴定

目的构建表达DREAM基因的小分子干扰RNA(siRNA)重组腺相关病毒(rAAV)载体,并观察感染PC12细胞后DREAM蛋白表达受抑制情况。方法设计并合成shRNA对应的2条互补的寡核苷酸链,pDC316-EGFP-U6质粒经BamHⅠ和HindⅢ双酶切与退火后的寡核苷酸连接,构建pDC316-EGFP-DREAMshRNA-U6质粒,以其为模板设计引物并引入EcoRⅠ和SalⅠ位点,PCR产物酶切后与pSANV2.0连接构建重组质粒pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP,酶切测序证实后,重组腺相关病毒介导将pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP感染PC12细胞,Western blot检测DREAM蛋白表达水平。结果经PCR、酶切及测序证实,重组腺相关病毒载体质粒pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP构建成功,包装成病毒感染PC12细胞48 h后,Western blot结果显示与对照组细胞相比,DREAM蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。结论成功构建和筛选出介导特异性shRNA-DREAM的重组腺相关病毒载体。     

腺相关病毒与人α1干扰素基因重组体的构建

目的 构建腺相关病毒载体(pWP8A)与人α1干扰素(hIFNα1)基因重组体。方法 用多聚酶链反应(PCR)方法扩增获得hIFNα1基因；以T-A克隆方法将PCR扩增hIFNα1基因亚克隆到PCR2，1质粒中，产生PCR2．1—hIFNα1；用EcoRI酶切PCR2．1—hIFNα1，后回收hIFNα1基因片断，将此片断连接到pWP8A的EcoRI位点上，构建重组体pWP8A—hIFNα1；pWP8A—hIFNα1转化JM109大肠杆菌扩增，hIFNα1基因经测序鉴定符合Genebank中hIFNα1序列，并用BanH I酶和Xbal I酶双酶切鉴定hIFNα1基因插入方向。结果 经MR扩增获得567bp hIFNα1基因；构建重组体pWP8A—hIFNα1，经测序证实pWP8A—hIFNα1中的hIFNα1与Genebank中hIFNα1序列相同，用BamH I酶和Xbal I酶双酶切鉴定hIFNα1基因插入方向正确的重组体pWP8A—hIFNα1。结论 成功构建腺相关病毒载体(pWP8A)与人α1干扰素(hIFNα1)基因的重组体。     

携带抑癌基因的重组腺相关病毒载体的构建及病毒包装滴定方法探讨

目的　构建携带多肿瘤抑制基因p16 (mts 1)及抑癌基因p2 1WAF1的腺相关病毒 (AAV)载体 ,通过病毒包装、纯化及滴定 ,获得高纯度高感染性的病毒液 ,为进行肝癌基因治疗的实验研究奠定基础。方法　以p16cDNA及p2 1cDNA全长为目的基因 ,构建AAV载体prAAV AFP p16 ,prAAV AFP p2 1,prAAV CMV p16及prAAV CMV p2 1。其中前两种载体能在人肝癌细胞中特异表达目的基因。应用脂质体将重组载体与辅助质粒PspRC72、腺病毒粘粒共转染包装细胞 ,2d后感染野生型腺病毒 ,至细胞裂解病变明显时收获。纯化后用聚合酶链反应法扩增倍比稀释后病毒液内的甲胎球蛋白或巨细胞病毒启动子DNA ,进行病毒DNA颗粒滴度测定。然后用重组腺相关病毒与腺病毒 (MOI均为 10 )共感染C12细胞 ,至细胞裂解病变明显时再收获。结果　重组载体经酶切鉴定测序证实。 2 93细胞、C12细胞包装病毒效果良好 ,病毒颗粒滴度介于 10 13 ～ 10 14 个 /ml之间。携带GFP的感染性AAV滴度为 5× 10 10 个 /ml。电镜下病毒呈小圆形空斑状 ,直径 2 5～ 30nm。MOI值 10 0时 ,rAAV AFP GFP病毒感染肝癌细胞的阳性率达 70 % ,为携带目的基因的AAV病毒用于肝癌细胞的促凋亡研究提供了定量指标。结论　成功构建了AAV载体 ,探讨了病毒包装方法 ,即第一次转染成功后 ,     

重组腺相关病毒载体介导的绿色荧光蛋白在急性髓性白血病患者骨髓间充质干细胞中的表达

目的探讨重组腺相关病毒载体(rAAV-2-eGFP)是否可高效转导入骨髓间充质干细胞(BMSCs).方法从初发的急性髓性白血病(AML)患者骨髓中分离培养出BMSCs,在不同的感染复数(MOI=10^2,10^3,10^4,10^5,10^6,10^7)下用包含增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的rAAV-2-eGFP感染BMSCs,寻找最佳的感染条件,并在转染后的不同时间点用倒置荧光显微镜以及流式细胞仪观察其表达情况.结果转染后10～14 d,eGFP在BMSCs中表达,转染效率为0.3%～2%,增加MOI亦不能明显增加转染效率.在MOI=105的条件下转染后观察了61 d,eGFP保持低水平长期稳定表达,在转染后的12～33 d,eGFP阳性的BMSCs从起始时的1.16%下降到(0.5～0.6)%,33～61 d一直维持在这一水平.结论rAAV-2-eGFP和BMSCs可用于体外基因治疗,但极低的转染效率可能是其进一步应用的障碍.     

突破腺相关病毒载体包装容量限制的策略

腺相关病毒(Adeno—Associated Virus)为非致病性单链DNA微小病毒，野生型病毒仅仅在腺病毒等辅助病毒存在的情况下才会感染人体，对人体组织，特别是肝、脾等有很强的亲嗜性，可感染分裂和非分裂细胞，并定点整合到19号染色体。重组腺相关病毒(rAAV)载体虽然丧失了定点整合的特性，但是腺相关病毒转导的以附着体     

重组腺相关病毒载体介导血管抑素基因治疗大鼠脑胶质瘤的实验研究

目的制备大鼠脑胶质瘤模型,注射腺相关病毒血管抑素基因重组载体(AAV-AS),观察对脑胶质瘤的治疗效果。方法皮下接种C6脑胶质瘤细胞制备大鼠胶质瘤模型,皮下注射AAV-AS,24天后取材,观察瘤重、肿瘤坏死率和血管计数,RTP-CR法检测AS转录。结果AAVAS治疗组肿瘤体积明显缩小,坏死明显,血管计数减少,RT-PCR法检测到AS转录。结论AAV-AS在大鼠体内可以表达,通过抑制血管生成而抑制肿瘤生长,促进肿瘤坏死。     

炎症增强报告基因在角膜内皮的表达

目的 研究脂多糖(LPS)诱发的眼内炎症反应能否增强腺相关病毒介导的报告基因在角膜内皮的表达。方法 20只SD大鼠前房注射rAAV-Lacz(10^10个病毒颗粒／ml)，28d后，取10只大鼠的玻璃体腔注射脂多糖溶液诱发眼内炎症，另10只玻璃体腔注射PBS作为对照，2d后，取角膜行5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)组织化学染色，评价报告基因的表达情况；Western blot检测核因子κB(NF-κB)蛋白的表达。结果 X-gal组织化学染色证实，报告基因可以在角膜内皮、角膜基质和虹膜细胞表达，玻璃体腔注射LPS 2d后，眼内炎症反应达高峰，此时角膜内皮细胞表现出明显的Lacz基因的表达；Western blot亦证实，角膜组织NF-κB蛋白表达与炎症反应成正比。结论 rAAV载体能有效携载目的基因到角膜内皮细胞，并且目的基因的表达在炎症情况下明显增强。     

重组腺相关病毒Ⅰ型/大鼠肿瘤坏死因子受体:Fc(rAAVⅠ/ratTNFR:Fc)的构建和在大鼠体内表达的初步研究

目的构建携带大鼠肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区和大鼠免疫球蛋白IgG1 Fc段融合基因的重组Ⅰ型腺相关病毒(rAAVⅠ/ratTNFR:Fc),并对该病毒在Lewis大鼠体内的表达和生物学活性进行初步研究,探讨以该重组腺相关病毒载体应用于类风湿关节炎基因治疗的可行性.方法首先以RT-PCR分别从大鼠脾细胞和大鼠淋巴细胞总RNA中扩增出大鼠肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区和大鼠免疫球蛋白IgG1 Fc段基因,并以重叠延伸PCR的方法将二者融合后克隆入pSNAVⅠ载体质粒进行重组病毒生产.在获得重组病毒后于Lewis大鼠肌肉注射,于不同时间ELISA测定血清ratTNFR:Fc表达,并以TNF-α细胞毒中和实验测定重组病毒表达产物的生物学活性.结果所构建的重组病毒rAAVⅠ/ratTNFR:Fc基因结构与预期一致;病毒于Lewis大鼠肌肉注射后可表达ratTNFR:Fc蛋白,含有ratTNFR:Fc蛋白的血清可以有效中和大鼠TNF-α对L929细胞的杀伤作用.结论本研究所构建的携带大鼠肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区和大鼠免疫球蛋白IgG1 Fc段融合基因的重组Ⅰ型腺相关病毒(rAAVⅠ/ratTNFR:Fc)可以用来作为阻断TNF-α的手段于大鼠类风湿关节炎模型上进行基因治疗研究.     

重组腺相关病毒介导的nm23H1载体的构建及鉴定

目的对载有肿瘤转移抑制基因nm23H1的重组腺相关病毒(AAV)载体进行构建及鉴定。方法用基因重组的方法构建含全长nm23H1的重组腺相关病毒骨架质粒，利用磷酸钙沉淀法将腺相关病毒载体系统共转染入病毒包装细胞293细胞中，分别合成AAV-nm23H1和AAV—Laz，经PCR，DNA测序，酶切鉴定，用斑点杂交法测定重组病毒的滴度。并用重组病毒感染卵巢癌细胞测定其转染效率。结果成功构建并鉴定nm23H1，梯度均为10^10病毒分子／ml，转染效率为70％。结论构建AAV—nm23H1为临床治疗肿瘤转移提供了新的手段。     

携反义mrp和mdr1双耐药基因的重组腺相关病毒载体的构建与鉴定

目的构建携带反义多药耐药相关蛋白基因(m rp)和反义多药耐药基因(m dr1)双耐药基因的重组腺相关病毒载体,以用于逆转肝细胞癌(HCC)多药耐药(M DR)的研究。方法将m rp基因cDNA 5′端500 bp的基因片段与m dr1基因cDNA 5′端600 bp的基因片段,用基因片段重叠法连接成为新的基因片段(m rp m dr1),并反向克隆到重组腺相关病毒载体系统(AAV H e lper-F ree System)表达质粒pAAV-IRES-hrGFP的多克隆位点,构建出重组表达质粒pAAV-IRES-hrGFP-(m rp m dr1)AS;再将pAAV-IRES-hrGFP-(m rp m dr1)AS与AAV H e lper-F ree System中的控制质粒pAAV-RC和辅助质粒pH e lper用脂质体转染法共转染293细胞,生成新型重组腺相关病毒载体rAAV 2-(m rp m dr1)AS。结果成功构建并包装出新型重组腺相关病毒载体rAAV 2-(m rp m dr1)AS,病毒滴度达2.5×108efu/m l。结论构建的rAAV 2-(m rp m dr1)AS可望能将反义m rp和m dr1基因片段导入HCC耐药细胞株。     

人血管生成素1和VEGF基因腺相关病毒共表达系统的构建

目的 :建立一个可同时表达人血管生成素 1(Angiopoietin 1)和血管内皮生长因子 16 5 (VEGF16 5 )的重组腺相关病毒 (AAV)载体基因转移系统 ,为下一步的研究做准备工作。方法 :利用PCR技术 ,获取目的基因Angiopoietin1和VEGF16 5 ,Angiopoietin 1的上游含有HindⅢ位点 ,下游含有BamHⅠ位点 ,VEGF16 5的上游含有BglⅡ位点 ,下游含有BamHⅠ位点。通过重组DNA技术 ,利用过渡质粒pZero 中含有的BamHⅠ、BglⅡ、HindⅢ、NotⅠ、XhoⅠ、XbaⅠ、SalⅠ、BspHⅠ、KspⅠ酶切位点以及pAAV MCS中含有的相应粘端互补的酶切位点 ,将Angiopoietin 1和VEGF16 5亚克隆进入pAAV MCS。结果 :测序证实Angiopoietin 1和VEGF16 5与GeneBank提供的原始序列完全一致。酶切鉴定与PCR筛选证实重组质粒和预期结果完全一致。在新的重组质粒中 ,Angiopoietin 1和VEGF16 5各有一套CMV启动子和PolyA终止子系统。结论 :Angiopoietin 1和VEGF基因AAV共表达系统的构建成功 ,为严重缺血性疾病基因治疗的研究奠定了基础。     

携带全长人极低密度脂蛋白受体基因的重组腺相关病毒的构建

目的构建携带全长人极低密度脂蛋白受体(very low-density lipoprotein receptor,VLDLR)基因的重组腺相关病毒。方法通过设计含有特定酶切位点的引物,从人的骨骼肌中提取RNA,合成cDNA,扩增人VLDLR全长基因5′端约1 000 bp的DNA,并以含人VLDLR基因片段的质粒为模板,合成人VLDLR全长基因近3′端约1 600 bp的DNA,通过粘端连接将2片段连接成全长VLDLR后,再将其连接到重组腺相关病毒包装系统的特定载体raav-UF1上,用293细胞作为包装细胞,配合重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)相关质粒:辅助质粒(phelp-er)和包装质粒(Pxx2),包装大量携带人VLDLR基因的重组腺相关病毒(raav-VLDLR-UF1),以含绿色荧光蛋白(greenfluorescence protein,GFP)基因的重组腺相关病毒(raav-GFP-UF1)为对照,测定raav-VLDLR-UF1及raav-GFP-UF1的滴度。结果raav-GFP-UF1和raav-VLDLR-UF1的滴度均为4×1011pfu/ml,达到实验要求。结论成功构建携带全长人VLDLR基因的重组腺相关病毒,有望为2型糖尿病高脂血症的基因治疗提供一种新的方法。     

基因治疗病毒载体的研究及应用

基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或发挥治疗作用,因此它可用来治疗一些后天性和遗传性疾病,其成功与否的关键是载体。目前应用的载体主要有包括病毒和非病毒载体,但在基因治疗中应用最为广泛的载体是病毒载体。本文就近年来病毒载体系统在基因治疗中的应用及其改进等方面的研究进行综述。     

Adeno-associated virus-mediated Bcl-xL prevents aminoglycoside- induced hearing loss in mice

Background Recent studies showed that aminoglycosides destroyed the cochlear cells and induced ototoxicity by producing reactive oxygen species, including free radicals in the mitochondria, damaging the membrane of mitochondria and resulting in apoptotic cell death. Bcl-XL is a well characterized anti-apoptotic member of the Bcl-2 family. The aim of this study was to determine the potential cochlear protective effect of Bcl-XL as a therapeutic agent in the murine model of aminoglycoside ototoxicity. Methods Serotype 2 of adeno-associated virus （AAV2） as a vector encoding the mouse Bcl-XL gene was injected into mice cochleae prior to injection of kanamycin. Bcl-XL expression in vitro and in vivo was examined with Western blotting and immunohistochemistry separately. Cochlear dissection and auditory steady state responses were checked to evaluate the cochlear structure and function. Results The animals in the AAV2-Bcl-XL/kanamycin group displayed better auditory steady state responses hearing thresholds and cochlear structure than those in the artificial perilymph/kanamycin or AAV2-enhanced humanized green fluorescent protein/kanamycin control group at all tested frequencies. The auditory steady state responses hearing thresholds and cochlear structure in the inoculated side were better than that in the contralateral side. Conclusions AAV2-Bcl-XL afforded significant preservation of the cochlear hair cells against ototoxic insults and protected the cochlear function. AAV2-mediated BCI-XL might be an approach with respect to potential therapeutic application in the cochlear degeneration.     

Packaging and Functional Identification of Recombinant Adeno-associated Virus Encoding cdc2-siRNA

Cyclin dependent kinases （cdks） play an important role in the pathogenesis of multiple neurodegenerative diseases. To explore the possibility of cdks-related gene therapy for neurodegen-erative diseases, we packed recombinant adeno-associated virus （rAAV） encoding cdc2-siRNA. The expressing plasmid pAAV-MCS-EGFP-U6-cdc2-siRNA was constructed by using molecular biological techniques. The rAAV encoding cdc2-siRNA （rAAV-EGFP-U6-cdc2-siRNA） was packed by calcium phosphate mediated co-transfection of the plasmid pAAV-MCS-EGFP-U6-cdc2-siRNA, p-RC and p-Helper into AAV-293 cells. DNA sequencing proved the successful construction of U6-cdc2-siRNA in pAAV-MCS-EGFP. Seventy-two h after packaging, the expression of EGFP could be detected in AAV-293 cells. Western blotting revealed that cdc2 gene expression in AAV-293 cells was down-regulated markedly after transfection with rAAV-EGFP-U6-cdc2-siRNA, which evidenced the satisfactory silencing effect of this virus. It was concluded that the packaging of rAAV encoding cdc2-siRNA was successful. rAAV encoding cdc2-siRNA could silence cdc2 gene effectively, which might offer a novel means for the treatment of neurodegenerative diseases.