酸环境对大鼠髓核细胞自噬及功能的影响

目的:观察酸环境下髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)中卵巢癌G蛋白偶联受体1(ovarian cancer G-protein-coupled receptor 1,OGR1)和自噬相关蛋白LC3的表达水平,探讨自噬激活机制,初步分析其对细胞功能的影响。方法:取SD大鼠正常髓核组织,分离培养NPCs,甲苯胺蓝、阿利新染色和Ⅱ型胶原免疫荧光检测鉴定NPCs。扩增培养NPCs,取第2代NPCs,在pH值为6.2、6.4、6.8、7.0、7.2和7.4的培养基中培养24h,免疫荧光观察NPCs中OGR1的表达情况,Western blotting检查细胞中OGR1和LC3-Ⅱ蛋白表达水平;在pH值为6.4的培养基中培养0、3h、6h、12h、24h、48h后,采用Western blotting检测NPCs中LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白表达水平。构建3个不同靶点的OGR1干扰序列,检测最合适滴度慢病毒,用最适滴度慢病毒转染NPCs,使用Western blotting和Real-time PCR检测不同干扰序列的沉默效果,选取最适干扰系列构建OGR1-shRNA慢病毒载体。取第2代NPCs,分为4组:正常组(DMEM培养基)、pH值6.4培养基组(空白组)、pH值6.4培养基空载体组(空载体组)、pH值6.4培养基OGR1-shRNA慢病毒转染组(转染组),培养24h后用Western blotting检测LC3-Ⅱ和p62蛋白表达水平;Alcian染色观察NPCs中蛋白多糖的表达情况。结果:(1)分离培养的细胞高表达蛋白多糖和Ⅱ型胶原,符合NPCs表型。(2)OGR1蛋白表达水平与培养基pH值相关,pH值7.0时,OGR1和LC3-Ⅱ蛋白表达水平显著性升高(P0.05),pH值6.4时表达量最高。(3)在pH值6.4的培养基中培养时,细胞中LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的表达量与培养时间有关,24h时达高峰,48h仍较高。(4)3个干扰序列对OGR1均有沉默作用,与对照组比较有显著性差异(P0.05),OGR1-shRNA1沉默效果最佳。(5)转染组细胞在pH值6.4的培养基中培养24h后,LC3-Ⅱ表达水平显著性低于空载体组(P0.05);p62表达水平显著性高于空载体组(P0.05);蛋白多糖的表达低于空载体组(P0.05)。结论:酸环境可促进大鼠NPCs中OGR1蛋白表达和自噬水平升高,OGR1介导了细胞自噬的激活,并影响NPCs的生物学功能。     

miR-21调节缺血缺氧诱导的大鼠肝卵圆细胞自噬的研究

目的探讨miR-21在缺血缺氧诱导的大鼠肝卵圆细胞自噬中的作用。方法体外培养肝卵圆细胞,慢病毒转染肝卵圆细胞构建稳定的细胞株,分别提取各组细胞RNA逆转录后行SYBR Green实时荧光定量PCR,检测各组miR-21的表达,以转染好的稳定的细胞建立缺血缺氧模型,共分为3组:miR-21空载体慢病毒转染HOC自噬组,miR-21增强慢病毒载体转染HOC自噬组,miR-21-inhibition慢病毒载体转染HOC自噬组。Hoechst 33258染色观察细胞凋亡;应用丹(磺)酰戊二胺(Monodansylcadaverine,MDC)染色荧光定位法、观察各组细胞的自噬;免疫印迹法(Western blotting)检测各组细胞LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达情况。结果与空载体组比,增强组miR-21基因水平表达增强,而MDC染色减弱(自噬减少),蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值减少;而抑制组miR-21基因水平表达减少,MDC染色增强(自噬增强),蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值增多。结论抑制miR-21过表达可以增强缺血缺氧引起的肝卵圆细胞的自噬,有利于肝卵圆细胞在缺血缺氧微环境中稳定细胞内环境,维持细胞的存活。     

线粒体自噬对脂多糖诱导髓核细胞NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3炎症小体活化的实验研究

目的探讨线粒体自噬对脂多糖(LPS)诱导的髓核(NP)细胞NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎症小体活化的影响。方法以大鼠椎间盘NP细胞为研究对象, 首先以LPS(200 μg/ml)分别干预髓核细胞0、24、48 h, 通过蛋白质印迹法(Western blot)检测LPS对NLRP3炎症小体活化和线粒体自噬的影响;通过免疫荧光观察LPS对线粒体自噬水平的影响;组间比较采用单因素方差分析。进一步利用线粒体自噬抑制剂Mdivi-1阻断线粒体自噬, 实验分组为对照组(con)、LPS(24 h)+Mdivi-1、LPS(24 h)。通过Western blot检测Mdivi-1对LPS诱导的NLRP3炎症小体活化的影响;通过免疫荧光评估各实验组Mito Tracker Red探针标记的线粒体与LC3B及NLRP3的细胞内共定位;通过免疫荧光评估各实验组Mito Tracker Red探针标记的线粒体与LC3B的细胞内共定位;通过免疫荧光检测分析Mdivi-1对LPS诱导的NP细胞线粒体膜电位(ΔΨm)及线粒体ROS的影响;组间比较采用t检验。结果与对照组比较, 随着LPS干...     

转染可溶性CD40基因的树突状细胞在体外对T淋巴细胞功能的抑制作用

目的探讨转染可溶性CD40(sCD40)基因的树突状细胞(DC)在体外对T淋巴细胞增殖和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的细胞毒活性的影响。方法采用脂质体转染法,将携带鼠CD40胞外区和绿色荧光蛋白的融合基因的质粒pEGFP-N1/sCD40转染小鼠DC细胞株(DC 2.4)。以Balb/c小鼠淋巴细胞为反应细胞,分别以转染组DC、空载体转染组(空载体组)DC和未行转染处理的DC(空白DC)作为刺激细胞,进行单向混合淋巴细胞培养,四唑氮化合物比色法检测细胞增殖情况。用乳酸脱氢酶释放试验和流式细胞术检测转染组DC及其培养上清液对CTL细胞毒活性及其凋亡的影响。结果转染组DC及其培养上清液对同种细胞刺激的淋巴细胞增殖反应有显著的抑制作用(P<0.05),并对特异性CTL的细胞毒活性具有明显的抑制作用(P<0.05);转染组DC可诱导CTL凋亡(P<0.05)。结论稳定表达sCD40-EGFP融合蛋白的DC,在体外对T淋巴细胞的增殖和CTL的细胞毒活性具有明显的抑制作用,并可诱导CTL凋亡。     

抑制Rac1表达对高糖诱发神经元损伤后线粒体自噬的影响

目的评价抑制Ras相关的C3肉毒素底物1(ras-related C3 botulinum toxin substrate 1, Rac1)表达对高糖诱发神经元损伤的影响。方法对数生长期PC12细胞接种于6孔板, 采用随机数字表法将细胞分为4组(每组3孔):正常浓度葡萄糖组(C组)、高浓度葡萄糖组(HG组)、高浓度葡萄糖+慢病毒抑制Rac1组(HG+shRac1组)、高浓度葡萄糖+慢病毒阴性对照组(HG+NC组)。C组以葡萄糖浓度为4.5 g/L的DMEM完全培养基培养PC12细胞24 h, HG组以葡萄糖浓度为45 g/L的DMEM完全培养基培养PC12细胞24 h, HG+shRac1组以葡萄糖浓度为45 g/L的DMEM完全培养基培养用Rac1 shRNA慢病毒载体转染的PC12细胞24 h, HG+NC组以葡萄糖浓度为45 g/L的DMEM完全培养基培养用阴性慢病毒载体转染的PC12细胞24 h。Western blot法检测微管相关蛋白1轻链3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3)Ⅰ、LC3Ⅱ、Bcl-2/...     

HIF-1α介导缺氧环境下肝癌Bel-7402细胞自噬的激活

目的:探讨缺氧环境肝癌细胞自噬的激活与H IF-1α的关系。方法:将肝癌B el-7402细胞分为常氧组、缺氧+C on sh R N A组和缺氧+H IF-1αsh R N A组,将慢病毒介导的H IF-1αsh R N A转染细胞,继续培养36 h,W estern blot检测H IF-1α蛋白表达;吖啶橙(A O)荧光染色检测自噬溶酶体的形成,丹酰尸胺(M D C)荧光染色检测自噬小体的形成,并应用流式细胞技术定量自噬溶酶体或者自噬小体的荧光强度;W estern blot检测自噬激活的标志蛋白LC 3-Ⅱ表达。结果:慢病毒介导的H IF-1αsh R N A降低了缺氧诱导的肝癌细胞中H IF-1α蛋白的生成(缺氧+H IF-1αsh R N A组vs缺氧+C on sh R N A组,P0.01),H IF-1α降低后,细胞中自噬小体及自噬溶酶体明显减少(缺氧+H IF-1αsh R N A组vs缺氧+C on sh R N A组,P0.01),自噬激活标志蛋白LC 3-Ⅱ明显减少(缺氧+H IF-1αsh R N A组vs C on sh R N A组,P0.01)。结论:缺氧环境下H IF-1α介导了肝癌细胞自噬的激活。     

乙型肝炎病毒X蛋白通过调控活性氧/NLRP3信号通路介导乙肝相关性肾小球肾炎足细胞焦亡

目的探讨乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein, HBx)是否通过调控活性氧(reactive oxygen species, ROS)/核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3, NLRP3)信号通路引起足细胞焦亡。方法采用小鼠肾足细胞过表达HBx基因来模拟乙型肝炎相关性肾炎的发病机制。将足细胞分为以下5组:空白对照组(不予特殊处理)、阴性对照组(转染对照慢病毒)、HBx过表达组(转染HBx过表达慢病毒)、HBx过表达+NLRP3 siRNA组(共转染HBx过表达慢病毒和NLRP3 siRNA)、HBx过表达+ROS抑制剂组(转染HBx过表达慢病毒和添加ROS抑制剂)。电镜下观察足细胞的形态学改变;二氯二氢荧光素二乙酸酯(dichlorodihydrofluorescein diacetate assay, DCFH-DA)法检测ROS的生成;Hoechst 33342染色观察足细胞细胞核的形态和数量变化;酶联免疫吸附测定试...     

乳杆菌源性外囊泡对LPS诱导小胶质细胞活化的影响及蛋白质组学分析

目的评价乳杆菌源性细胞外囊泡(Lac-EVs)对脂多糖(LPS)诱导小胶质细胞活化的影响及蛋白质组学分析。方法取生长状态较好的小鼠BV2小胶质细胞, 采用随机数字表法分为3组(n=12):对照组(C组)、LPS组(L组)和LPS+Lac-EVs组(L+E组)。C组正常培养;L组LPS(终浓度1 μg/ml)孵育24 h;L+E组于LPS处理后24 h加入Lac-EVs(终浓度2.5 μg/ml)孵育24 h。随后采用免疫荧光染色法检测CD86和CD206的表达。取L组和L+E组细胞沉淀, 采用蛋白质组学方法筛选两组差异表达蛋白。对鉴定得到的差异表达蛋白进行生物信息学分析并采用RT-qPCR和Western blot法对载脂蛋白1(Apoa1)和G蛋白偶联受体激酶相互作用蛋白2(Git2)两个差异表达蛋白进行验证。结果与C组相比, L组CD86表达上调, CD206表达下调(P<0.05);与L组相比, L+E组CD86表达下调, CD206表达上调(P<0.05)。采用蛋白质组学法筛选出125个差异表达蛋白(FC=2.0, P<0.05), 其中66个蛋白表达上调, ...     

PKD1基因对主动脉平滑肌细胞自噬的影响

目的阐明多囊肾病基因1(PKD1)对小鼠主动脉平滑肌细胞自噬的影响。方法构建PKD1基因的shRNA慢病毒干扰及PKD1基因促进剂ETS-1慢病毒过表达载体,转染小鼠主动脉平滑肌细胞,采用实时荧光定量核酸扩增(qPCR)检验干扰及过表达效率。同时通过qPCR及Western blotting检测对照组、shPKD1组及ETS-1组小鼠主动脉平滑肌细胞自噬标志分子Atg5、Beclin1和LC3的表达水平。结果与正常对照组相比,shPKD1组PKD1 mRNA表达量下降(P<0.05),而ETS-1组ETS-1 mRNA及PKD1 mRNA表达量明显升高(P<0.05)。与对照组相比,shPKD1组自噬标志物Atg5和Beclin1 mRNA表达水平明显降低(P<0.05),ETS-1组Atg5和Beclin1 mRNA表达水平明显升高(P<0.001)。与对照组相比,shPKD1组Atg5、Beclin1和LC3蛋白表达水平明显降低(P<0.05),ETS-1组Atg5、Beclin1和LC3蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。结论PKD1基因的表达能够影响小鼠主动脉平滑肌细胞自噬,即PKD1基因表达下调可抑制主动脉平滑肌细胞自噬,而PKD1基因过表达能够促进小鼠主动脉平滑肌细胞自噬。     

过表达膜联蛋白A1的人脂肪间充质干细胞治疗急性呼吸窘迫综合征小鼠的效果及其机制

目的探索过表达膜联蛋白A1(ANXA1)的人脂肪间充质干细胞(AMSC)治疗急性呼吸窘迫综合征(ARDS)小鼠的效果及其机制。方法采用实验研究方法。采用流式细胞术鉴定成人AMSC后, 取第3代细胞进行后续实验。采用随机数字表法(分组方法下同), 将细胞分为转染含ANXA1基因RNA序列的质粒的过表达ANXA1组、转染对应空载质粒的空载对照组, 另取细胞分为转染含ANXA1基因小干扰RNA序列的质粒的敲减ANXA1组、转染对应空载质粒的空载对照组, 转染后72 h, 于荧光显微镜成像系统下观察荧光表达情况, 分别采用蛋白质印迹法和实时荧光定量反转录PCR法检测ANXA1的蛋白和mRNA表达(样本数均为3)。取50只6～8周龄雄性C57BL/6J小鼠, 分为假伤组、单纯ARDS组、正常细胞组、过表达ANXA1组、敲减ANXA1组, 每组10只。将后4组小鼠均用内毒素/脂多糖制成ARDS肺损伤模型, 假伤组小鼠模拟致假伤。伤后即刻, 假伤组、单纯ARDS组小鼠均经尾静脉注射生理盐水, 正常细胞组、过表达ANXA1组、敲减ANXA1组小鼠对应注射正常AMSC、过表达ANXA1的AMSC、敲减A...     

阿魏酸钠对大鼠脊髓损伤中NLRP3炎性小体的影响及机制

目的:探究阿魏酸钠(SF)对大鼠脊髓损伤(SCI)模型中NLRP3炎性小体的影响及机制。方法:体内研究采用压迫法建立大鼠脊髓损伤模型,雌性SD大鼠随机分成3组(n=12),Sham组不损伤脊髓,SCI+SF组按100mg/kg/d的剂量连续腹腔注射SF给药7d,SCI组给予等量的生理盐水溶液,术后第3天提取脊髓组织蛋白进行Western blot检测NLRP3和激活效应蛋白pro-caspase-1、P20、IL-1β以及自噬蛋白P62、LC3Ⅱ的表达,并对脊髓样本进行免疫荧光染色观察NLRP3变化,术后第7天对脊髓样本进行Nissl染色检测神经元存活情况。体外实验中对大鼠小胶质细胞(正常培养为对照组)采用LPS诱导NLRP3表达(LPS组),加入自噬阻断剂氯喹(CQ)(CQ组及LPS+CQ组)检测NLRP3激活效应以及溶酶体组织蛋白酶B(Cathepsin B,CTSB)活性,验证自噬与溶酶体功能对NLRP3激活的影响,再通过SF干预(LPS+CQ+SF组)带来的分子水平变化探讨其中的机制。结果:与Sham组相比,SCI组NLRP3表达升高并被激活,pro-caspase-1降解减少,活性产物P20、IL-1β增多,且自噬蛋白p62、LC3Ⅱ均在较高水平(P0.05);与SCI组比较,SCI+SF组NLRP3数量减少,激活减弱,P62、LC3Ⅱ水平下降(P0.05),Nissl染色显示前角神经元存活情况改善(P0.05)。与之相似,体外实验中,相比对照组,LPS组细胞NLRP3的表达上升(P0.05),但激活不显著,而LPS+CQ组NLRP3的水平更高,激活明显,pro-caspase-1降解,活性产物P20、IL-1β增多,此外,P62、LC3Ⅱ的水平异常升高,CTSB活性下降(P0.05),而相比LPS+CQ组,LPS+CQ+SF组中P62、LC3Ⅱ的水平出现同步下降,CTSB活性增强(P0.05),自噬流恢复。结论:阿魏酸钠通过保护自噬和溶酶体的功能,能够抑制NLRP3炎性小体的产生和激活,从而减轻SCI大鼠神经细胞损伤。     

缺氧条件下大鼠髓核细胞中缺氧诱导因子1α与自噬相关分子的表达及相关性分析

目的探讨缺氧条件下大鼠髓核细胞中缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)与自噬相关分子Beclin1、LC3B的表达及其相关性。方法取健康成年SD大鼠髓核组织,分离培养髓核细胞并传代。取第3代髓核细胞行HE染色和Ⅱ型胶原酶免疫荧光染色鉴定后,随机分为4组。A组细胞于常氧条件下(37℃、5%CO2、20%O2)培养,B组细胞于缺氧条件下(37℃、5%CO2、1%O2)培养,C组细胞转染HIF-1α-小干扰RNA后于缺氧条件下培养,D组细胞加入自噬抑制剂3-MA后于缺氧条件下培养。各组细胞培养8 h后,采用Western blot和实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)检测HIF-1α与自噬相关分子Beclin1、LC3B的表达情况。结果经分离纯化的第3代大鼠髓核细胞HE染色后细胞质呈淡粉色,细胞核呈蓝黑色;Ⅱ型胶原酶免疫荧光染色为阳性。Western blot和qRT-PCR检测示,B组HIF-1α、Beclin1和LC3B蛋白及mRNA相对表达量均显著高于A组(P<0.05),C组均显著低于B组,差异均有统计学意义(P<0.05)。D组HIF-1α蛋白和mRNA相对表达量与B组比较差异无统计学意义(P>0.05),Beclin1和LC3B蛋白和mRNA相对表达量均较B组显著降低(P<0.05)。结论缺氧条件能诱导大鼠髓核细胞中HIF-1α和自噬相关分子Beclin1、LC3B的表达,且HIF-1α与自噬相关分子的表达具有相关性,即HIF-1α下调能降低自噬相关分子的表达,而缺氧条件下自噬水平下调对HIF-1α的表达无明显影响。     

糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子配体调控炎症反应的机制

目的 探讨库普弗细胞中糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子配体(GITRL)调控炎症反应的机制.方法 分离小鼠库普弗细胞和T细胞,转染库普弗细胞并与T细胞共培养,将共培养细胞分为6组:空白对照组,共培养细胞只加DMEM培养基;大肠埃希杆菌脂多糖(LPS)组,共培养细胞培养基中加入1 mg/L的LPS;沉默组、沉默对照组、质粒转染组、空载体质粒组,各组的库普弗细胞分别转染GITRLsiRNA、control siRNA、pEGFP-N1 GITRL、pEGFP-N1 control后与T细胞共培养后再加入LPS(1 mg/L),置孵箱培养24 h后处理.细胞免疫荧光法和Western blot法分别检测库普弗细胞的GITRL和程序性死亡配体(PDL1)的表达,MTT法和Annexin V/FITC染色流式分析仪分别检测T细胞增殖和凋亡,ELISA法检测上清液TNFα的含量.数据分析采用独立样本t检验和单因素方差分析(N-K检验).结果 转染24 h后荧光显微镜观察转染细胞荧光强度初步判断转染GITRL siRNA和转染pEGFP-N1 GITRL的库普弗细胞转入效率分别为90％和85％.转染GITRL siRNA的库普弗细胞GITRL蛋白表达较正常库普弗细胞显著下降,而转染pEGFP-N1 GITRL的库普弗细胞GITRL蛋白表达较正常库普弗细胞显著升高(=41.72,13.10,P＜0.05);各转染对照库普弗细胞的GITRL蛋白表达与正常库普弗细胞比较,差异无统计学意义(F=2.27,P＞0.05).LPS组GITRL荧光强度明显高于空白对照组(t=49.29,P＜0.05);与LPS组比较,沉默组GITRL的表达明显下降(t =9.84,P＜0.05);质粒转染组中GITRL的表达明显增加(=5.78,P＜0.05);各转染对照组(沉默对照组、空载体质粒组)中GITRL的表达与LPS组比较,差异无统计学意义(F=0.86,P＞0.05).LPS组PDL1蛋白的表达与空白对照组比较明显下降(t=18.83,P＜0.05);与LPS组比较,质粒转染组中PDL1蛋白的表达下降更明显(t=11.79,P＜0.05);沉默组PDL1蛋白的表达则介于LPS组和质粒转染组之间(t=19.08,P＜0.05);各转染对照组(沉默对照组、空载体质粒组)与LPS组比较,差异无统计学意义(F=2.22,P＞0.05).LPS组与空白对照组比较,T细胞增殖明显增加,凋亡显著减少(t=49.43,40.11,P＜0.05);与LPS组比较,质粒转染组T细胞增殖和凋亡表现为更明显的相同趋势(t=5.77,12.64,P＜0.05);而沉默组T细胞的增殖减少而凋亡明显增加(t=17.00,49.90,P＜0.05);各转染对照组(沉默对照组、空载体质粒组)与LPS组比较,差异无统计学意义(F=1.87,1.35,P＞0.05).LPS组与空白对照组比较,TNF-α的表达明显增加(t=125.68,P＜0.05);与LPS组比较,沉默组TNF-α显著下降(t=119.65,P＜0.05);质粒转染组TNF-α则显著增加(t=147.70,P＜0.05);各转染对照组(沉默对照组和空载体质粒组)与LPS组比较,差异无统计学意义(F=0.14,P＞0.05).结论 库普弗细胞通过上调GITRL的表达抑制PDL1,激活T细胞增殖,促进炎症反应;干扰GITRL的表达可恢复免疫平衡,抑制炎症反应.     

不均一性核糖核蛋白A2/B1在脂多糖诱导的血管内皮细胞通透性增加中的作用

目的 探讨不均一性核糖核蛋白A2/B1(heterogeneous ribonucleoprotein A2/B1,hnRNP A2/B1)在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)通透性中的作用.方法以HUVECs为研究对象,筛选出具有hnRNP A2/B1基因沉默作用的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),按不同处理方法实验分为转染阴性对照siRNA组(NC siRNA组)、 转染hnRNP A2/B1 siRNA组(hnRNP A2/B1 siRNA组)、 转染阴性对照siRNA组并进行LPS干预组(NC siRNA组-LPS组)、转染hnRNP A2/B1siRNA组并进行LPS干预组(hnRNP A2/B1 siRNA组-LPS组),分别给予或不给予LPS(1 mg/L)刺激,检测不同时间点(0、6、12、24 h)各组细胞跨膜电阻抗(transendothelial electrical resistance,TEER)值,检测LPS刺激12 h后细胞表面血管内皮钙黏蛋白(vascular endothelial cadherin,VE-cadherin)及细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)蛋白表达变化.结果在相同剂量LPS诱导下,hnRNP A2/B1 siRNA-LPS组HUVECs的TEER在12 h低于NC siRNA-LPS组(P<0.05);在LPS刺激12 h后,hnRNP A2/B1 siRNA-LPS组HUVECs表面VE-cadherin表达明显低于NC siRNA-LPS组,ICAM-1表达明显高于NC siRNA-LPS组(P<0.05).结论hnRNP A2/B1可能通过调节VE-cadherin及ICAM-1蛋白表达影响血管内皮细胞的通透性,发挥血管内皮屏障保护功能.     

锌指蛋白A20抑制脂多糖诱导大鼠腹膜间皮细胞NF-κB活化、CD40表达及TNF-α的分泌

目的：探讨锌指蛋白A20（zinc finger protein A20）对脂多糖（LPS）诱导的大鼠腹膜间皮细胞（RPMCs）炎症反应的影响.方法：分离及培养RPMCs,将细胞随机分成对照组、LPS组、转染A20组、空载体组.脂质体转染A20质粒（pGEM-T easy-A20）至RPMCs 24 h后分别在LPS刺激不同时间点收获细胞提取蛋白及细胞上清液.用Western blotting 检测细胞A20和IκBα（inhibitor of nuclear factor-κB-α）蛋白的表达;RT-PCR检测CD40和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）mRNA的表达;用ELISA法检测培养上清液TNF-α蛋白水平.结果：与LPS组及空载体组相比,转染A20组RPMCs IκBα蛋白无明显降解（P＆lt;0.05）;CD40、TNF-α mRNA表达及细胞培养上清液TNF-α蛋白水平均明显降低（P＆lt;0.05）;与对照组相比,差异无统计学意义（P＆gt;0.05）.结论：A20可抑制LPS诱导的RPMCs核转录因子-κB（NF-κB）活化及炎症反应.     

镧对内毒素/脂多糖诱导的巨噬细胞核因子KB活化的抑制作用

目的了解稀土元素镧对内毒素/脂多糖(LPS)诱导的小鼠腹腔巨噬细胞(Mφ)核因子κB(NF-κB)活化的影响,并探讨其机制。方法分离培养小鼠腹腔 Mφ,分为:空白对照组,无刺激因素;LPS 组,用1μg/ml LPS 刺激30 min;镧离子(La~(3 ))组,用2.5 μmol/L La~(3 )刺激30 min;La~(3 ) LPS 组,先后用2.5μmol/L La~(3 )、1μg/mI LPS 各刺激30 min;La~(3 )/LPS 组,2.5μmol/L La~(3 )刺激30 min 后,洗涤细胞,再加入1μg/ml LPS 刺激30 min。采用细胞免疫荧光染色法观察 NF-κB在各组细胞中的分布与表达;酶联免疫吸附测定(ELISA)法捡测胞核中 NF-κB/p65蛋白活性;蛋白质印迹法检测细胞核内 NF-κB/p65蛋白及胞质中核因子抑制蛋白α(IκBα)的表达量。ELISA 法测定各组细胞培养上清液中肿瘤坏死冈子α(TNF-α)的含量。结果 (1)免疫荧光染色显示,空白对照组、La~(3 )组、La~(3 ) LPS 组和 La~(3 )/LPS 组 Mφ绿色荧光多分布于胞质,胞核荧光强度分别为42±7、73±30、48±11和67±19;LPS 组绿色荧光集中于胞核,荧光强度为116±14,明显高于其余4组(P<0.01)。(2)胞核 NF-κB/p65蛋白活性:LPS 组吸光度值为0.435±0.066.与空白对照组(0.048±0.027)、La~(3 )组(0.062±0.049)、La~(3 ) LPS 组(0.066±0.031)、La~(3 )/LPS 组(0.108±0.017)比较,明显偏高(P<0.01)。(3)LPS 组 Mφ胞核 NF-κB/p65蛋白表达水平明显高于其余4组,胞质 IκBα蛋白表达水平明显低于其余4组。(4)TNF-α含量:La~(3 )组培养上清液中 TNF-α含量低于试剂盒检测下限(25 pg/ml)及空白对照组(P<0.05),La~(3 ) LPS 组和 La~(3 )/LPS 组低于 LPS 组(P<0.01),但高于空白对照组。结论 LPS 可激活小鼠腹腔 MφNF-κB/p65核移位,并使胞核中 NF-κB/p65的表达量和活性升高、胞质 IκBα蛋白表达下调,导致 TNF-α分泌增多。镧可抑制上述效应。     

褪黑素调控足细胞昼夜节律介导的自噬在糖尿病肾病中的作用

目的探讨体外高糖环境和糖尿病肾病小鼠模型足细胞昼夜节律的变化, 以及褪黑素改善糖尿病肾病足细胞损伤的作用机制。方法体外培养原代足细胞并将其分为对照组、高糖(30 mmol/L)组和高糖(30 mmol/L)+褪黑素(0.1 mmol/L或0.5 mmol/L)组。地塞米松(100 nmol/L)作用足细胞2 h, 记为授时因子时间0点, 每4 h收获细胞, 持续24 h。6～8周龄体重20 g左右雄性C57BL/6J小鼠被随机(区组随机分组)分为对照组、糖尿病肾病(高脂饮食+尾静脉注射120 mg/kg链脲菌素)组和糖尿病肾病(高脂饮食+尾静脉注射120 mg/kg链脲菌素)+褪黑素(20 mg/kg灌胃)治疗组(褪黑素组)。采用实时荧光定量PCR法检测足细胞生物钟基因的mRNA表达量。Western印迹法检测生物钟基因蛋白Clock、Bmal1, 足细胞标志蛋白Nephrin、Synaptopodin、WT1、Desmin, 以及自噬相关蛋白Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ、P62蛋白的表达量;免疫荧光染色法检测小鼠肾组织WT1蛋白表达;免疫组化法检测小鼠肾组织P62和Cleaved-c...     

丹酚酸B对脓毒症小鼠血管平滑肌细胞炎症反应的影响：circACTA2在其中的作用

目的评价丹酚酸B(Sal B)对脓毒症小鼠血管平滑肌细胞(VSMC)炎症反应的影响及circACTA2在其中的作用。方法在体实验:健康雄性C57BL/6小鼠81只, 6～8周龄, 采用随机数字表法分为3组(n=27):假手术组、脓毒症组和Sal B组。采用盲肠结扎穿孔法制作脓毒症模型。模型制备成功后, Sal B组腹腔注射Sal B 7 mg/kg, 1次/d, 连续2 d。每组随机取20只小鼠用于造模后7 d内测定SBP、DBP、MAP、全血乳酸(Lac)浓度, 记录生存情况。造模后48 h时每组随机取7只小鼠, 取动脉血管组织, 采用免疫荧光染色法测定IL-1β表达, 分别采用Western blot法和qRT-PCR法测定IL-1β、TNF-α、IL-6及其mRNA的表达, 采用qRT-PCR法测定circACTA2的表达。细胞实验:小鼠动脉VSMC培养后, 采用随机数字表法分为6组(n=3):对照组(C组)、LPS组、Sal B组、si-circACTA2+C组、si-circACTA2+LPS组和si-circACTA2+Sal B组。LPS组采用LPS(终浓度1 μg/ml...     

脊神经结扎术后脊髓背角小胶质细胞中miR-195的表达及其对自噬水平的影响

目的 :探讨大鼠脊神经结扎术后脊髓背角小胶质细胞中微核糖核酸-195(micro RNA-195,miR-195)的表达及其对自噬水平的影响与调节机制。方法:32只成年雄性SD大鼠随机分为脊神经结扎组(SNL组)和假手术组(S组),每组16只,SNL组结扎L5段神经制备脊神经结扎模型,造模后1d、3d、5d、10d两组各处死4只大鼠,分离脊髓腰膨大,采用Percoll梯度离心法分离脊髓背角小胶质细胞,Real-time PCR检测两组各时间点脊髓背角小胶质细胞的miR-195表达水平。取12只成年雄性SD大鼠,处死后取脊髓腰膨大,分离脊髓背角小胶质细胞,分为两组,一组采用脂质体法转染miR-195模拟物,另一组加入转染试剂,检测两组小胶质细胞自噬体膜标记蛋白轻链3(light chain 3,LC3)的表达水平;再取小胶质细胞分为三组,分别将含有野生型及突变型自噬相关基因14(ATG14)3′非编码区(3′UTR)的报告基因质粒、p RL-TK质粒miR-195模拟物和对照转入HEK 293细胞培养48h,荧光显微镜下观察miR-195的直接作用靶点,并检测三组ATG14蛋白的表达。取24只健康SD大鼠脊髓腰膨大,分离脊髓背角小胶质细胞,分为三组分别转染miR-195模拟物、抑制物和转染试剂,培养48h,采用免疫蛋白印记(Western blot)法检测三组ATG14蛋白的表达水平;再取小胶质细胞分为三组,分别转染pEGFP-LC3、pEGFP-LC3+miR-195模拟物及pEGFP-LC3+miR-195模拟物+pCMV-ATG14培养48h,染色后荧光显微下观察自噬斑点数量。结果 :SNL组各时间点大鼠脊髓背角小胶质细胞中miR-195表达均明显上调,与同时间点S组比较均有显著性差异(P0.05)。转染miR-195模拟物后,LC3的表达水平(0.61±0.07)较对照组(1.21±0.08)显著性降低(P0.05)。转入野生型ATG14 3′UTR的报告基因质粒的HEK 293细胞的荧光强度较对照显著性减弱(0.65±0.04 vs 1.01±0.01,P0.05),突变型与对照无显著性变化(0.99±0.03 vs1.00±0.02,P0.05)。转染miR-195模拟物后小胶质细胞中ATG14的表达显著性降低(P0.05);转染miR-195抑制物后ATG14的表达显著性升高(P0.05)。转染pEGFP-LC3与pEGFP-LC3+miR-195模拟物较转染pEGFP-LC3+miR-195模拟物+pCMV-ATG14时自噬数量降低(P0.05)。结论 :miR-195在大鼠脊神经结扎模型脊髓背角小胶质细胞中高表达,降低自噬蛋白LC3表达;ATG14蛋白受miR-195负调控,miR-195可能通过降低ATG14的表达抑制小胶质细胞自噬。     

细胞自噬在七氟醚致老年小鼠海马区神经元细胞凋亡中的保护作用

目的探讨细胞自噬在七氟醚致老年小鼠海马区神经元细胞凋亡中的作用机制。方法 18月龄BL/C57小鼠16只, 按随机数字表法分为两组(每组8只):七氟醚组和对照组。七氟醚组吸入47.5%空气+2.5%七氟醚+50%氧气3 h, 对照组吸入50%空气+50%氧气3 h。建模后24 h进行新物体识别实验, 随后断头取海马组织, 尼氏染色检测海马神经元细胞凋亡情况, Western blot法检测海马神经元细胞自噬相关蛋白[微管关联蛋白(microtubule-associated protein, LC)3Ⅱ/LC3Ⅰ、Becline-1、p62蛋白]水平。另取18月龄BL/C57小鼠18只, 按随机数字表法分为3组(每组6只):七氟醚+3-甲基腺嘌呤组(M组, 吸入麻醉前2 h经腹腔注射3-甲基腺嘌呤)、七氟醚+雷帕霉素组(R组, 吸入麻醉前24 h和2 h经腹腔注射雷帕霉素)、七氟醚+生理盐水组(N组, 吸入麻醉前2 h经腹腔注射生理盐水100 μl)。经腹腔注药及七氟醚处理后, 尼氏染色检测海马神经元细胞凋亡情况, Western blot法检测海马神经元细胞自噬相关蛋白(LC3Ⅱ/L...