反义寡核苷酸处理伊马替尼耐药慢粒细胞后Bcl-x剪接异构体的变化

目的探讨反义寡核苷酸Vivo-Morpholinos(vMO)处理对伊马替尼(Imatinib,IM)耐药慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)细胞中Bcl-x基因选择性剪接的影响。方法将IM(1μM)组、荧光标记的vMO、IM联合vMO组(IM+vMO)、空白对照组分别与IM耐药CML细胞株K562/G01细胞进行共培养48h,通过RT-PCR和Western Blot分别检测K562/G01细胞胞内Bcl-x剪接异构体Bcl-xL/Bcl-xS mRNA和蛋白比值变化。结果分别与IM组和vMO组处理K562/G01细胞相比,IM+vMO组的Bcl-xL mRNA和蛋白表达量显著降低,同时Bcl-xS mRNA和蛋白表达量明显升高,而对照组中Bcl-x剪接异构体变化不明显。结论 K562/G01细胞在vMO处理后Bcl-xL/Bcl-xS mRNA和蛋白比值显著下调。     

泛素化修饰对K562/G01细胞BCL6蛋白表达水平的调节及对细胞增殖、凋亡的影响

目的:探讨泛素蛋白酶系统(UPS)对伊马替尼(IM)耐药细胞株K562/G01中BCL6蛋白水平及耐药细胞增殖和凋亡的影响。方法:应用Western blot技术检测蛋白酶抑制剂MG-132处理CML细胞前后BCL6蛋白水平差异;用RT-PCR及Western blot方法分别检测ML364(泛素特异性蛋白酶USP2抑制剂)处理前后K562/G01细胞株中BCL6及USP2 mRNA和蛋白的表达水平;应用CCK-8法及流式细胞术分别检测ML364和IM单用及联用对K562/G01细胞增殖及凋亡的影响。结果:蛋白酶抑制剂M G132处理后,K562/G01的BCL6蛋白水平显著上升(P0. 05); K562/G01细胞株的去泛素化酶USP2 mRNA和蛋白表达水平均高于K562细胞株(P 0. 05); M L364处理K562/G01后,USP2和BCL6蛋白表达水平同步下调(P 0. 05);与IM单药组相比,ML364与IM联合用药组K562/G01细胞增殖抑制率及细胞凋亡率均明显升高(P 0. 05)。结论:M L364通过抑制USP2介导的BCL6蛋白去泛素化水平降低K562/G01细胞株BCL6蛋白稳定性,使K562/G01细胞株中BCL6蛋白表达下调,从而增加耐药细胞对IM的敏感性。     

伊马替尼耐药K562/G的microRNA表达谱分析及与FOXO3/Bcl-6信号通路关系的研究

目的:探讨CML耐药细胞株K562/G耐药相关的FOXO3/Bcl-6信号通路及相关microRNA(miRNA)机制。方法:采用MTT法检测伊马替尼对K562/G的耐药性;采用Western blot法检测耐药株和敏感株细胞中FOXO3和Bcl-6蛋白的表达情况,实时荧光定量PCR检测FOXO3及Bcl-6 mRNA的表达。运用miRNA芯片技术筛查K562与K562/G细胞之间差异表达的miRNA,进一步筛选FOXO3/Bcl-6信号通路的靶向miRNA。结果:K562/G较K562细胞株的FOXO3及Bcl-6蛋白表达均明显升高(P<0.01);Bcl-6 mRNA的表达水平无明显差异,而K562/G细胞中FOXO3 mRNA表达明显升高(P<0.05)。miRNA芯片结果显示,K562/G与K562细胞之间有109条miRNA存在显著的差异,其中上调miRNA为81个,下调miRNA有28个。经生物信息学反向预测,其中miR-6718-5p、miR-5195-5p、miR-4711-3p、miR-4763-5p、miR-4664-5p和miR-3176与该信号通路相关。结论:伊马替尼耐药与FOXO3/Bcl-6信号通路相关,并且K562/G与K562细胞存在miRNA表达显著差异。     

高三尖杉酯碱联合伊马替尼对K562/G01细胞的作用及机制研究

目的:探索高三尖杉酯碱(Homoharringtonine,HHT)联合伊马替尼(Imatinib,IM)对K562/G01细胞增殖、凋亡的影响及其可能的作用机制。方法:应用CCK-8法检测HHT联合IM对K562/G01细胞增殖的影响,流式细胞术检测细胞的凋亡率及磷酸化酪氨酸水平,Western blot检测P210及PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达水平。结果:HHT联合IM与单药相比,对K562/G01细胞的增殖活性具有明显抑制作用(P0.05),细胞的凋亡率显著增加(P0.05);HHT与IM联合可显著抑制K562/G01细胞内的p-Tyr及p-Crkl的表达水平,并能使p210蛋白及其下游通路蛋白P13K和p-Akt的表达水平明显降低。结论:HHT联合IM可协同抑制K562/G01细胞增殖并诱导其凋亡,其机制可能与抑制p210蛋白表达及其激酶活性有关。     

冬凌草甲素对白血病细胞增殖抑制及机制的研究

目的:探讨伊马替尼耐药的K562细胞(K562-R)的可能耐药机制及冬凌草甲素(oridonin,OR)对伊马替尼敏感的K562细胞(K562-S)和K562-R细胞的生长抑制作用及其可能机制。方法:Western blot法检测K562-S和K562-R细胞内p-Lyn的表达;采用改良的四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测OR对K562-S和K562-R细胞的增殖抑制作用,光学显微镜观察OR作用24 h后K562-S和K562-R细胞的形态变化,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot法检测OR对K562-S和K562-R细胞内BCL-2的表达和蛋白激酶p-Lyn、Akt/mTOR信号通路的变化。结果:在K562-R细胞中,p-Lyn表达增高。OR对K562-S和K562-R细胞的生长具有抑制作用,且呈时间和浓度依赖性,OR作用72 h的半抑制浓度(IC50)值分别为4.23±1.30和4.97±2.23μmol/L。OR作用24 h后,K562-S和K562-R细胞破坏明显,部分细胞裂解成碎片。流式细胞仪检测发现,OR使K562-S和K562-R凋亡细胞明显增多。Western blot结果提示,OR使细胞内蛋白激酶p-Lyn表达下降,Akt/mTOR信号通路关键点蛋白磷酸化水平明显减低,凋亡抑制蛋白BCL-2表达下调。结论:p-Lyn高表达可能参与K562-R细胞的耐药。OR通过下调p-Lyn,抑制Akt/mTOR信号通路和下调BCL-2表达,促进细胞凋亡,抑制白血病细胞株K562-S和K562-R的生长。     

5-溴汉防己甲素和柔红霉素对K562/A02细胞凋亡和survivin基因表达的影响

本研究探讨5-溴汉防己甲素(BrTet)联合柔红霉素(DNR)治疗耐药慢性髓系白血病的潜在可能性及其相关机制。采用流式细胞术检测DNR,BrTet或DNR和BrTet联合作用K562/A02细胞48小时后凋亡率情况;采用RT-PCR法检测对照组K562细胞、耐药K562/A02细胞及DNR或(和)BrTet作用于K562/A02细胞48小时后存活蛋白(survivin)mRNA表达水平;采用Western blot法检测各组细胞survivin蛋白表达水平。结果表明:BrTet与DNR联合作用对K562/A02细胞的诱导凋亡率较其余各组显著升高,同时联合用药组K562/A02细胞survivin mRNA和蛋白的表达较空白对照组和单药组下调,K562/A02细胞survivin表达较K562细胞升高。结论:BrTet联合DNR能有效逆转耐药,促进K562/A02细胞凋亡,其机制可能与survivin表达下调有关。     

高三尖杉酯碱通过mTOR通路诱导慢性髓系白血病K562细胞凋亡

目的:观察高三尖杉酯碱(Homoharringtonine,HHT)对人CML细胞株K562的增殖及凋亡的影响,并从mTOR通路探索HHT抗CM L效应的作用机制。方法:采用不同浓度HHT或联合mTOR抑制剂雷帕霉素(RAPA)处理K562细胞,用CCK-8法检测细胞增殖抑制活力,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot检测BCL-6、Caspase-3及mTOR通路相关蛋白的表达水平,RT-PCR法检测BCL-6 mRNA表达水平。结果:HHT可抑制K562细胞的增殖并促进其凋亡,且呈浓度依赖性(r=0.970)。随着HHT作用浓度的增加,mTOR通路相关蛋白表达水平升高(r=0.908),而BCL-6 mRNA及蛋白的表达水平下降(r_(mRNA)=-0.961,r_(protein)=-0.981)。与HHT单用组相比,联用RAPA可显著下调mTOR及Caspase-3的表达,并上调BCL-6表达。结论:HHT可通过激活mTOR通路抑制抗凋亡BCL-6蛋白的表达,进而诱导CML细胞凋亡。     

急变期慢性髓系白血病骨髓间充质干细胞下调白血病细胞凋亡

本研究旨在观察慢性髓系白血病（CML）骨髓间充质干细胞（BMMSC）对K562细胞和原代急变期CML白血病细胞增殖和凋亡的影响及其可能的机制及意义.K562细胞和原代急变期CML白血病细胞分别与不同组别的BMMSC共培养,应用MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡及细胞线粒体膜电位,Western blot检测凋亡相关蛋白caspase-8、caspase-9、激活的caspase-3的表达.结果表明：CML急变期BMMSC不能抑制原代CML急变期白血病细胞的增殖,对K562仅有轻度的抑制作用;CML急变期BMMSC提高阿霉素处理后的K562细胞的存活率,并保护K562及原代CML-Bp骨髓单个核细胞,抑制阿霉素诱导的细胞凋亡（P＜0.05）;与CML慢性期及正常组BMMSC相比较,CML急变期BMMSC对白血病细胞的保护作用最强,其细胞共培养组的细胞线粒体膜电位下降最少（P＜0.05）;检测CML急变期BMMSC共培养组的K562显示,活性Caspase-3表达均较单独K562＋ ADM组明显下调,caspase-9表达显著增加（P＜0.05）.结论：CML急变期BMMSC下调阿霉素诱导的白血病细胞的凋亡,其机制可能与抑制细胞线粒体膜电位的下降,稳定caspase-9蛋白非活性的表达和下调caspase-3蛋白的激活有关.     

整合膜蛋白2A与慢性粒细胞白血病耐药的相关性研究

目的:探索整合膜蛋白2A(ITM2A)在慢性粒细胞白血病(CML)耐药患者中的表达模式及临床意义。方法:采用qRT-PCR、Western blot、免疫细胞化学检测ITM2A在CML中的表达情况。为了解ITM2A可能介导的生物学效应，过表达ITM2A后流式细胞术检测CML细胞凋亡、细胞周期、髓系分化抗原表达变化。并初步探索其发挥生物学效应的潜在分子机制。结果:ITM2A在CML耐药患者骨髓中的表达明显低于敏感患者及健康供者(P<0.05);体外细胞实验成功构建CML耐药细胞株K562R,耐药株中ITM2A的表达明显低于敏感株(P<0.05);过表达K562R细胞中的ITM2A能够使K562R细胞对伊马替尼的敏感性增加(P<0.05),且阻滞细胞周期在G₂期，但不影响髓系分化。上调ITM2A能够使ERK信号通路的磷酸化水平降低(P<0.05)。结论:ITM2A在CML耐药患者中呈低表达，低表达ITM2A可能是CML对伊马替尼耐药的关键因子。     

ZD6474对伊马替尼耐药的K562细胞增殖的影响

目的 探讨酪氨酸激酶抑制剂ZD6474(Vandetanib)对K562细胞及其衍生的伊马替尼耐药的K562/G细胞的增殖抑制作用及其分子机制.方法 通过逐渐增加药物浓度的方法诱导伊马替尼耐药的K562/G细胞株,采用Western blot方法检测耐药细胞株中明显变化的分子.WST方法检测伊马替尼和ZD6474对细胞增殖的影响,流式细胞术检测药物对细胞周期的影响.采用RT-PCR、Western blot和体外Src激酶卣接测定的方法研究ZD6474作用的分子机制.结果 伊马替尼对K562细胞的IC50值为(0.28 4-0.04)μmol/L,而对K562/G细胞的IC50值为(15.80±0.93)μmol/L,K562/G细胞的耐药倍数为56倍,Western blot结果提示其耐药机制与磷酸化Src激酶(p-Src)的表达增强,Bcl-2和磷酸化STAT3(p-STAT3)的表达升高有关.ZD6474呈剂量依赖的方式抑制K562和K562/G细胞增殖,48 h的IC50值分别为1.61 μmol/L和3.18 μmol/L.ZD6474作用24 h,可以显著诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡.分子机制研究显示,ZD6474显著抑制Src激酶活性,上调Bax/Bcl-2的比例,以及下调p-STAT3表达.结论 ZD6474可以有效抑制伊马替尼耐药的K562/G和亲本K562细胞增殖,诱导凋亡.其机制与ZD6474显著抑制Src激酶活性有关.     

利用慢病毒载体构建过表达人TCRP1基因的慢性髓系白血病K562细胞系及其生物学功能检测

目的 利用慢病毒载体构建过表达人舌癌耐药相关基因（TCRP1）的慢性髓系白血病（CML K562细胞系并检测其生物学功能。方法 将TCRP1的重组质粒与包装质粒共转染293T细胞，收集病毒液测定滴度后感染K562细胞，使用嘌呤霉素筛选TCRP1过表达的细胞株K562/TCRP1，荧光定量PCR和Western blot方法检测TCRP1的表达，采用连续细胞计数法和CCK-8法分别对K562/TCRP1及其对照细胞株的增殖情况进行检测，并分析2个细胞株对不同浓度的伊马替尼（IM）的药物敏感性。结果 TCRP1慢病毒表达载体成功转染进入K562细胞，荧光定量PCR和Western blot结果显示K562/TCRP1细胞株的TCRP1表达在mRNA水平和蛋白水平均显著高于对照组，连续细胞计数法和CCK-8法结果表明K562/TCRP1细胞的增殖能力和细胞活力增强，IM处理K562/TCRP1细胞的IC50值显著高于其对照细胞（P <0.05）。结论 利用慢病毒载体成功构建了TCRP1过表达的K562细胞株，并且发现TCRP1的过表达可能增强K562细胞的增殖能力和IM耐药能力，为进一...     

三氧化二砷对慢性髓系白血病细胞Hedgehog通路的影响

目的:探讨三氧化二砷对慢性髓系白血病(CML)细胞Hedgehog信号通路的影响。方法:采用MTT法及流式细胞术测定细胞的凋亡,Western blot检测Hedgehog通路中PTCH及SMO蛋白表达,real-time PCR检测PTCH及SMO基因mRNA的表达。结果:三氧化二砷可诱导K562细胞凋亡,最佳浓度为2μmol/L,最佳作用时间为24 h。在该浓度及时间点作用下Hedgehog通路中PTCH及SMO蛋白和mRNA表达下调。结论:三氧化二砷可降低Hedgehog通路中PTCH及SMO基因表达。     

高三尖杉酯碱联合伊马替尼对K562细胞诱导凋亡及BCL6表达的影响

目的:探讨高三尖杉酯碱(homoharringtonine,HHT)联合伊马替尼(Imatinib,IM)对K562细胞增殖、凋亡及BCL6蛋白和mRNA表达的影响。方法:应用CCK-8法检测HHT和IM单用及联用对K562细胞增殖抑制作用,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot分析BCL6蛋白表达水平,RT-PCR检测BCL6 mRNA表达水平。结果:单用HHT对K562细胞增殖具有抑制作用,且呈浓度依赖性(r=0.820),诱导K562细胞凋亡;联合用药组细胞增殖抑制率及细胞凋亡率均明显升高(P0.05);单用HHT作用后BCL6蛋白表达下调,IM作用后BCL6蛋白表达明显上调,联合用药与IM单药相比,BCL6蛋白表达出现下调,差异均有统计学意义(P0.05);与对照组相比,HHT和IM单药处理后BCL6 mRNA表达均出现下调,联合用药组较单用组下调更显著(P0.05)。结论:HHT可抑制K562细胞增殖,促进细胞凋亡,且与IM有协同作用。HHT可能通过抑制BCL6表达增强K562细胞对IM的敏感性。     

新型酪氨酸激酶抑制剂HHGV678对Bcr-Abl野生型细胞株和伊马替尼耐药细胞株抑制作用的体外研究

本研究比较新型的酪氨酸激酶抑制剂HHGV678与伊马替尼(imatinib,IM)在体外对Bcr-Abl野生型和IM耐药细胞株的抑制作用,探索HHGV678替代IM治疗CML及IM耐药CML患者的可能性。以Bcr-Abl野生型细胞株(K562和32Dp210)及16种IM耐药细胞株(K562R和15种Bcr-Abl点突变细胞株)为研究对象,用MTT法检测HHGV678和IM对上述细胞的生长抑制作用;以DNA梯形条带法和Annexin-V/PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡;应用Western blot检测HHGV678对上述细胞BCR-ABL融合蛋白及酪氨酸激酶磷酸化表达的影响。结果表明:HHGV678呈剂量依赖性显著抑制Bcr-Abl野生型细胞株和除T315I点突变细胞株以外的IM耐药细胞株生长。比较IC50发现,HHGV678在低剂量下(0.01-0.3μmol/L)抑制K562和32Dp210细胞生长的作用比IM分别强15.5和28倍;而对除T315I点突变细胞株以外的15种IM耐药细胞株细胞的生长抑制作用比IM强1.4-124.3倍。HHGV678抑制上述细胞酪氨酸激酶磷酸化的能力均强于IM。更重要的是HHGV678在10.0μmol/L剂量下诱导IM强耐药细胞株K562R和T315I点突变细胞株的凋亡率分别达到40.06%和33.32%,显著高于IM的19.77%和10.68%。结论:新型酪氨酸激酶抑制剂HHGV678对Bcr-Abl野生型细胞株和IM耐药细胞株,尤其是对IM强耐药细胞株的生长抑制作用明显强于IM,但HHGV678能否成为治疗CML和IM耐药CML患者新的靶向药物,仍有待进一步的研究。     

大黄素可能通过Akt-Caspase 3信号通路诱导K562/Adr细胞凋亡

目的:观察大黄素(emodin)对多药耐药白血病细胞株K562/Adr凋亡的影响及Akt-Caspase 3信号通路在其中的作用。方法:采用Annexin V/PI双染的流式细胞术和DNA倍体分析法检测细胞凋亡;Western blot法检测大黄素作用后不同时间段caspase-3前体蛋白、PARA、Akt、p-Akt表达水平的变化。结果:大黄素能够诱导K562/Adr细胞凋亡,并呈量效关系。大黄素作用K562/Adr细胞后caspase-3前体蛋白、Akt、p-Akt、PARA 116 KD表达水平下调,PARP 85 KD表达水平增加,并呈时效关系。结论:Akt-Caspase 3信号通路可能参与大黄素诱导K562/Adr细胞凋亡的过程。     

槲皮素对慢性髓系白血病伊马替尼耐药细胞株的作用及机制研究

目的:探讨槲皮素对慢性髓系白血病伊马替尼耐药细胞株的生长抑制作用及其机制。方法:台盼蓝染色法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期,Western blot检测相关蛋白的表达水平。结果:25μmol/L槲皮素对伊马替尼耐药的K562细胞株K562R和K562G具有与伊马替尼敏感细胞株K562相似的生长抑制和诱导凋亡作用,且不改变BCR-ABL的表达水平。25μmol/L槲皮素处理24 h后,K562、K562R和K562G细胞的G_2/M期百分比明显增加。槲皮素能使γ-H2AX水平明显增高,且上调JNK的磷酸化水平。结论:槲皮素单药对伊马替尼耐药细胞株具有生长抑制和诱导凋亡作用,使细胞停滞于G_2/M期,其机制可能与上调JNK磷酸化水平导致DNA双链损伤相关。     

含扶正解毒汤药血清对白血病K562/A02耐药细胞的抑制作用及初步机制

目的:探讨含扶正解毒汤药血清对白血病耐药细胞株K562/A02的抑制效果及可能的机制。方法:采用M TT法检测含扶正解毒汤药血清对K562/A02耐药细胞的生长抑制率,流式细胞技术测定含扶正解毒汤药血清处理各组K562/A02细胞后的凋亡情况,QPCR法检测BCL-2 mRNA的表达,Western blot方法检测BCL-2蛋白的表达,流式细胞技术测定细胞膜P-gp蛋白的表达。结果:MTT细胞毒实验结果表明含扶正解毒汤药血清具有抑制k562/A02细胞生长的效果,且抑制率呈药物浓度相关性;流式细胞检测结果表明含扶正解毒汤药血清可以诱导k562/A02耐药细胞的凋亡,凋亡率呈药物浓度相关性;Q-PCR结果显示,含扶正解毒汤药血清可以下调K562/A02细胞BCL-2蛋白的表达;流式细胞检测结果表明,含扶正解毒汤药血清可下调K562/A02细胞膜P-gp蛋白的表达。结论:含扶正解毒汤药血清可以促进K562/A02耐药细胞的凋亡,其诱导细胞凋亡的机制可能与抑制BCL-2蛋白和P-gp蛋白的表达有关。     

DLL4/Notch1配体过表达抑制K562细胞生长机制研究

本研究旨在探讨Notch1信号通路的配体delta-like ligand4（DLL4）基因过表达对K562细胞增殖的影响及其可能的作用机制.采用脂质体介导将含配体DLL4基因的质粒pBudCE4.1-DLL4转染K562细胞,通过RT-PCR和Western blot检测转染48 h后DLL4基因的mRNA及蛋白表达,同样检测转染后Notch1受体胞内区（NICD）、下游靶基因Hesl的mRNA及蛋白表达;通过Western blot检测与Notch信号通路相关的细胞转录因子YY1、原癌基因C-MYC及抑癌基因Rb蛋白的表达水平;用CCK-8法检测转染后细胞的增殖情况;用流式细胞术检测转染质粒48 h后各组细胞的凋亡情况.结果表明,DLL4基因转染后的K562细胞中DLL4、NICD及下游靶基因Hesl的mRNA及蛋白表达量比对照组明显增多（P＜0.05）,说明DLL4的过表达激活了Notch1信号通路;Western blot方法检测显示,DLL4的转染增加了细胞转录因子YY1、原癌基因C-MYC及抑癌基因Rb蛋白的表达,从而抑制了K562细胞的生长,诱导细胞周期停滞于G1期及细胞凋亡的增加.结论：外源性DLL4基因过表达可有效活化K562细胞内Notch1信号通路,可能通过YY1、C-MYC及Rb等Notch信号通路相关基因的高表达诱导K562细胞的生长减慢及细胞凋亡.     

线粒体途径在慢性髓系白血病信号转导中的作用

本研究旨在探讨线粒体途径在慢性髓系白血病（CML）信号转导中的作用。用脂质体转染法将bcr3／abl2反义寡核苷酸（ASO）导入CML细胞系K562细胞中;用MTr法检测bcr3／abl2 ASO对K562细胞活力的影响;流式细胞术（FCM）分析测定细胞凋亡率;荧光染料罗丹明123染色分析细胞线粒体跨膜电位（△ψm）的变化;Western blot检测线粒体凋亡信号转导通路相关蛋白细胞色素C（CytC）的表达。结果表明,2μmol／Lbcr3／abl2 ASO与K562细胞作用24小时后,可明显抑制K562细胞活力,其抑制率为65．7％;可诱导细胞凋亡,凋亡率为16．9％;可下调K562细胞线粒体△ψm,有38．33％的细胞出现线粒体△ψm下降;可增强CytC的表达,激光光度扫描仪测得其表达光密度值由2．33±0．3升高到4．78±0．1。结论：线粒体途径通过介导凋亡信号而在CML信号转导中发挥重要作用。