SN50 定向诱导小鼠小胶质细胞分化促进缺氧损伤神经元修复的实验研究

目的探讨 SN50 定向诱导小鼠小胶质细胞分化对缺氧损伤神经元的修复作用及其机制。方法取新生 BALB/c 小鼠脑组织，采用差速贴壁结合震荡方法分离神经元和小胶质细胞。小胶质细胞首先采用免疫荧光染色鉴定特异性表达蛋白诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthetase，iNOS）和电离钙离子结合调节因子 1（ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba1）表达情况，实时荧光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）检测特异性表达基因 iNOS、CD32 和 IL-10；然后采用 SN50 处理后，Western blot 检测 SN50 对小胶质细胞 NF-κB 的调控，qRT-PCR 检测小胶质细胞相关分化基因（iNOS、CD11b、IL-10、CD206）表达，流式细胞术检测 SN50 对小胶质细胞凋亡的影响，以上检测均以蒸馏水处理的小胶质细胞作为对照。神经元首先行缺氧损伤处理，分别于缺氧处理 0、2、6、12、24、48 h 后 MTT 检测神经元活力，另取缺氧处理 12 h 神经元经 Western blot 检测凋亡相关蛋白 Bcl-2 和半胱氨酸蛋白酶 3（Caspase-3）的表达、流式细胞术检测神经元凋亡情况。最后，将缺氧损伤 12 h 神经元分别与无菌蒸馏水（对照组）和 SN50（实验组）处理的小胶质细胞共培养 24 h，MTT 检测细胞活力、Western blot 检测细胞凋亡相关蛋白（Bcl-2、Caspase-3）表达、流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果免疫荧光染色和 qRT-PCR 鉴定震荡分离的细胞表达小胶质细胞特异性蛋白和基因。与正常小胶质细胞相比，SN50 处理小胶质细胞后 NF-κB 蛋白及指示向 M1 型分化特异性基因 iNOS、CD11b 相对表达量降低（P<0.05），向 M2 型分化特异性基因 IL-10 和 CD206 相对表达量提高（P<0.05），但细胞凋亡率无明显改变（P>0.05）。与正常神经元相比，神经元缺氧处理后活力显著下降，Bcl-2、Caspase-3 蛋白相对表达量降低，而 cleaved-Caspase-3 蛋白相对表达量提高，神经元凋亡率明显升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。小胶质细胞与神经元共培养后，与对照组相比，实验组细胞活力及 Bcl-2、Caspase-3 蛋白相对表达量明显升高，cleaved-Caspase-3 蛋白相对表达量以及细胞凋亡率降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。 结论SN50 可以通过 NF-κB 信号通路诱导小胶质细胞向 M2 型分化，使小胶质细胞对缺氧受损神经元发挥修复作用。     

妊娠大鼠来源脂肪干细胞在急性肝损伤中的修复作用

目的评估妊娠大鼠来源脂肪干细胞（adipose-derived stem cells, ADSCs）在急性肝损伤中的修复作用。方法取 18 周龄妊娠 SD 大鼠分离培养 ADSCs 并鉴定。另取 SD 大鼠 20 只随机分为 A、B、C、D 4 组（n=5），A 组大鼠不作处理，作为正常对照；B～D 组大鼠腹腔注射 CCl₄ 制备急性肝损伤模型。造模后 2 h，A 组于大鼠脾脏注射 DPBS，B 组不注射任何试剂，C、D 组分别于大鼠脾脏注射 0.1 mL 正常大鼠来源和妊娠大鼠来源 ADSCs（2×10⁶ 个/mL）。注射后 7 d 处死动物，取眼球血检测血清中总胆红素（total bilirubin，TBIL）、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartic acid transaminase，AST）、白蛋白（albumin，ALB）和肝功能总蛋白（total protein，TP）含量；取肝组织切片行 HE 染色检测损伤肝组织形态学变化；免疫组织化学染色检测肝组织中 Ki67、甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）和 ALB 的表达情况。 结果B 组血清中 TBIL、ALT、AST 含量显著高于 A、C、D 组，ALB、TP 含量显著低于 A、C、D 组，差异均有统计学意义（P<0.05）。C、D 组血清中 TBIL、ALT、AST 含量显著高于 A 组，C 组高于 D 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；A、C、D 组血清中 ALB 含量差异无统计学意义（P>0.05）；C、D 组血清中 TP 含量显著低于 A 组（P<0.05），C、D 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。HE 染色示：A 组大鼠肝组织结构清晰，细胞排列整齐，大小均匀；B 组大鼠肝细胞明显出现水肿，细胞排列紊乱，可见肝小叶内点状坏死，组织出现弥漫性炎性细胞浸润；C、D 组大鼠肝组织炎症和肝细胞坏死程度较 B 组明显减轻，同时由线粒体和粗面内质网扩张造成的空泡数量降低，其中 D 组肝损伤改善程度较 C 组更显著。免疫组织化学染色示：C、D 组 Ki67 阳性细胞率显著高于 A、B 组，B 组高于 A 组，D 组高于 C 组，差异均有统计学意义（P<0.05）。A、B 组 AFP 均无表达，而 C、D 组阳性表达，D 组 AFP 阳性细胞率显著高于 C 组（t=3.006，P=0.017）。C、D 组 ALB 表达均显著高于 A、B 组，D 组高于 C 组，差异均有统计学意义（P<0.05）。 结论与正常大鼠来源 ADSCs 移植比较，妊娠大鼠来源 ADSCs 移植后，肝损伤大鼠肝功能改善程度更显著。     

不同强度跑台训练对大鼠跟腱微损伤修复影响的实验研究

目的探讨不同强度跑台训练对胶原酶诱导的大鼠跟腱微损伤修复的影响。方法取 8 周龄雄性 SD 大鼠 72 只，体质量 200～250 g，经适应性跑台训练 1 周后，于双侧跟腱各注射 30 μL 浓度为 10 mg/mL 的Ⅰ型胶原酶溶液，制备胶原酶诱导的跟腱微损伤模型。饲养 1 周后随机分为对照组（n=24）、低强度组（n=24）、高强度组（n=24）；对照组大鼠可自由活动；低、高强度组采用计算机控制动物实验跑台对大鼠进行被动跑台训练，其中低强度组跑台强度为 13 m/min、20 min/d，高强度组跑台强度为 17 m/min、60 min/d。于训练开始即刻及 1、4 周，每组各取 8 只大鼠双侧跟腱，行大体观察、组织学观察并半定量评分以及生物力学测试。 结果训练开始即刻，各组跟腱标本大体观察、组织学观察及半定量评分以及生物力学测试比较，差异均无统计学意义（P>0.05），提示各组跟腱微损伤模型损伤程度相似，具有可比性。大体观察示，1 周时，各组腱旁结缔组织增生、肌腱组织缺乏光泽；4 周时，低强度组腱旁增生组织较对照组明显减少，而高强度组腱旁结缔组织较多，并且有大量新生血管形成。组织学观察示，1 周时各组间总分比较差异无统计学意义（P>0.05）；低、高强度组仅新生血管量评分与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。4 周时，高强度组总分明显高于对照组、低强度组，对照组显著高于低强度组（P<0.05）；低强度组纤维排列、细胞形态、细胞异常增多、新生血管量评分与对照组、高强度组比较，高强度组细胞异常增多评分与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。生物力学测试示，1 周时各组跟腱横截面积、最终应力、抗拉强度及弹性模量比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。4 周时，低强度组最终应力及抗拉强度较对照组明显升高（P<0.05），最终应力及弹性模量较高强度组明显升高（P<0.05）；其余各指标组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。 结论低强度跑台训练能够促进胶原酶诱导的大鼠跟腱微损伤的修复。     

壳聚糖多孔支架复合BMSCs移植修复大鼠创伤性脑损伤的实验研究

目的探讨壳聚糖多孔支架复合 BMSCs 移植修复大鼠创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）的可行性。方法取成年 SD 大鼠胫骨及股骨骨髓，采用全骨髓贴壁培养法分离培养 BMSCs，并传代。取第 3 代细胞行表面抗原 CD29、CD45 鉴定及 BrdU 标记。采用冷冻干燥法制备壳聚糖多孔支架，并与 BrdU 标记的第 3 代 BMSCs 进行体外共培养；扫描电镜观察细胞黏附情况，MTT 法检测支架内细胞生长情况。取 50 只成年 SD 大鼠，随机分为 A、B、C、D、E 组（n=10）。A～D 组大鼠采用 Feeney 自由落体打击致伤原理制备 TBI 模型，造模后 72 h 分别移植 BMSCs-壳聚糖多孔支架复合体、BMSCs、壳聚糖多孔支架和完全培养基；E 组为假手术组。于造模前及造模后 1、7、14、35 d，各组大鼠行改良神经功能缺损评分（modified neurological severity scores，mNSS）；造模后进行 Morris 水迷宫测验，包括定位航行测验（造模后 31～35 d 连续 5 d 检测潜伏期）及空间探索测验（造模后 35 d 检测穿越平台次数）；造模后 36 d 取标本行 HE 染色、BrdU 与高分子量神经丝蛋白免疫组织化学双重染色以及 BrdU 与神经胶质酸性蛋白免疫组织化学双重染色，观察大鼠脑损伤区 BMSCs 的迁移与分化情况。 结果流式细胞仪检测示第 3 代 BMSCs 的 CD29 阳性率为 98.49%，CD45 阳性率仅为 0.85%；扫描电镜示支架-细胞共培养 48 h 后，BMSCs 呈梭形并分泌细胞外基质黏附于支架上；MTT 法检测示壳聚糖多孔支架对 BMSCs 的增殖分化无不良影响。TBI 造模后 35 d，A 组大鼠 mNSS 评分、定位航行测验的潜伏期显著低于 B、C、D 组，空间探索测验的穿越平台次数显著高于 B、C、D 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；A、E 组间上述指标比较差异均无统计学意义（P>0.05）。HE 染色示 A 组壳聚糖多孔支架已部分降解，其与脑组织融合良好，修复程度优于 B、C、D 组。免疫组织化学双重染色结果示，A 组移植的 BMSCs 存活、分化为神经元和神经胶质细胞，并迁移至正常脑组织内，修复程度优于 B、C、D 组。 结论壳聚糖多孔支架介导的 BMSCs 移植能够明显改善大鼠 TBI 后的神经功能，亦能抑制大鼠脑损伤区胶质瘢痕形成，并可使 BMSCs 在脑损伤区存活、增殖和分化为神经细胞。     

术者利手侧别对初次人工全膝关节置换术中假体位置影响的研究

目的探讨术者利手侧别对初次人工全膝关节置换术（total knee arthroplasty，TKA）中假体放置位置的影响。方法将 2016 年 12 月—2018 年 12 月由同一右利手术者完成的 86 例（100 膝）初次 TKA 患者纳入研究，单膝 72 例、双膝 14 例。根据术者术中操作位置不同分为优势组（右侧）及非优势组（左侧），两组各 50 膝。两组患者性别、年龄、体质量指数、病程、临床诊断及术前美国特种外科医院（HSS）评分等一般资料比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。记录两组手术时间及并发症发生情况，采用 HSS 评分评价膝关节功能；于术前及术后 2 周下肢全长 X 线片测量髋-膝-踝角（hip-knee-ankle angle，HKA）、股骨远端外侧角（mechanical lateral distal femoral angle，mLDFA）、胫骨近端内侧角（mechanical medial proximal tibial angle，mMPTA），评价假体冠状位位置；于术后 3 个月膝关节侧位 X 线片测量股骨远端后方角（posterior distal femoral angle，PDFA）、胫骨近端后方角（posterior proximal tibial angle，PPTA），评价矢状位假体位置。 结果两组手术时间差异无统计学意义（t=−1.128，P=0.262）。优势组 1 例术后出现胫后动脉血栓形成，优势组和非优势组各 1 例出现切口愈合不良，其余患者无并发症发生。两组患者均获随访，随访时间 12～34 个月，平均 22.0 个月。末次随访时，优势组 HSS 评分为（87.2±4.3）分，非优势组为（86.8±5.0）分，组间比较差异无统计学意义（t=0.471，P=0.639）。X 线片复查示，两组随访期间均未发生假体周围感染、无菌性松动、假体周围骨折等并发症。手术前后两组 HKA、mLDFA、mMPTA 差异均无统计学意义（P>0.05）。术后 3 个月两组 PDFA 及矢状位股骨假体位置不良发生率比较，差异有统计学意义（P<0.05）；但 PPTA、股骨假体力线达中立位比例以及股骨假体过屈、股骨前方切迹发生率比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。 结论术者利手侧别是影响初次 TKA 时股骨假体矢状位位置因素之一，非优势侧手术时矢状位股骨假体位置不良发生率增高。     

Masquelet技术联合人工真皮对家兔骨与软组织缺损的治疗研究

目的探讨应用 Masquelet 技术联合人工真皮对家兔骨与软组织缺损的修复效果，观察诱导膜的微观结构及血管化情况，以期指导临床中对 Gustilo-AndersonⅢ型开放性骨折伴大段骨缺损及软组织缺损的治疗。方法雄性家兔 80 只，体质量 2.03～2.27 kg，平均 2.11 kg。取 64 只兔双侧大腿随机分为实验组及对照组，余 16 只兔双侧为假手术组。所有兔均制备股骨骨质缺损及软组织缺损模型。实验组以 Masquelet 技术第一阶段方法［将聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥填充于骨缺损区］联合人工真皮治疗；对照组单纯以 Masquelet 技术第一阶段方法治疗；假手术组不作处理，直接缝合伤口。术后 2、4、6、8 周各处死假手术组 4 只家兔，以及实验组/对照组 16 只家兔，于双侧股骨原手术部位取材，大体观察诱导膜及结合膜情况；对膜结构取材行常规 HE 染色观察其微观结构；行 CD34 免疫组织化学染色观察，并计数微血管密度（microvessel density，MVD）。结果大体观察示：术后 4 周，实验组人工真皮胶原蛋白海绵层完全消失，实验组及对照组均产生完整诱导膜结构；对照组膜结构呈半透明状，实验组膜结构较厚，呈淡红色不透明，伴小血管增生。术后 6～8 周，实验组和对照组膜结构均逐渐增厚。假手术组随时间变化仅观察到瘢痕组织增生。HE 染色示：术后 2 周，实验组及对照组均可见大量肌纤维，少量胶原纤维增生伴炎性细胞浸润；假手术组大多为肌纤维，伴少量肌纤维间血管。术后 4 周，实验组较对照组胶原纤维增多，部分血管形成，对照组胶原纤维细胞核呈类圆形，实验组呈扁圆形。术后 6、8 周实验组和对照组胶原纤维均较前增多，对照组胶原纤维细胞核仍呈类圆形，实验组呈梭形且细胞核较同期对照组深染；两组均可观察到增生血管，实验组增生血管数目较对照组增多。假手术组仍可见大量成纤维细胞出现，未表现随时间变化的血管显著增生。CD34 免疫组织化学染色示，术后随时间延长，各组 MVD 均呈逐渐增加趋势。术后 2 周假手术组 MVD 显著大于实验组和对照组，4、6、8 周显著小于实验组和对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。实验组术后 4、6 周 MVD 显著大于对照组（P<0.05），2、8 周两组 MVD 比较差异无统计学意义（P>0.05）。 结论Masquelet 技术结合人工真皮治疗兔股骨骨质缺损及软组织缺损，在术后 4～6 周明显促进了膜结构的血管化过程。这两种方法结合对临床 Gustilo-AndersonⅢ型开放性骨折伴骨及软组织缺损的治疗有指导意义。     

重组人促红细胞生成素联合铁剂纠正老年股骨转子间骨折患者围术期贫血的临床研究

目的探讨重组人促红细胞生成素（recombinant human erythropoietin，rHuEPO）联合铁剂纠正老年股骨转子间骨折患者围术期贫血的疗效。方法回顾分析 2016 年 4 月—2017 年 10 月符合选择标准的 71 例老年股骨转子间骨折患者临床资料，均行闭合复位股骨近端髓内钉固定治疗。其中 31 例术前应用 rHuEPO 联合铁剂纠正贫血（试验组），40 例未使用 rHuEPO 及铁剂（对照组）。两组患者性别、年龄、体质量指数、致伤原因、骨折侧别及分型、美国麻醉医师协会（ASA）分级、合并内科疾病、骨折至入院时间、术前住院时间以及手术时间比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。记录两组患者入院时及术后 1、3、7 d 血红蛋白水平，术后输血患者例数并计算输血率，术后输血量，术后并发症发生情况以及术后住院时间。 结果术后试验组 8 例（25.8%）、对照组 22 例（55.0%）输血，试验组输血量为（1.96±0.85）U，明显低于对照组的（3.19±1.61）U；两组输血率及输血量比较差异均有统计学意义（P<0.05）。两组术前血红蛋白水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）；术后试验组均高于对照组，其中术后 7 d 差异有统计学意义（P<0.05）。试验组术后住院时间为（6.16±3.97）d，较对照组的（9.25±4.47）d 明显缩短（P<0.05）。术后试验组 8 例（25.8%）、对照组 14 例（35.0%）发生肺部感染，试验组 6 例（19.4%）、对照组 8 例（20.0%）发生下肢深静脉血栓形成，并发症发生率差异均无统计学意义（P>0.05）。所有患者均正常出院，住院期间无死亡。 结论老年股骨转子间骨折患者术前应用 rHuEPO 联合铁剂能快速提高术后血红蛋白水平，缩短住院时间，而且不增加术后下肢深静脉血栓形成发生风险。     

载重组人 BMP-2 磷酸钙联合载抗生素磷酸钙人工骨治疗慢性骨髓炎伴骨缺损的临床研究

目的通过与单纯载抗生素磷酸钙人工骨（calcium phosphate cement，CPC）比较，探讨载重组人 BMP-2（recombinant human BMP-2，rhBMP-2）CPC 联合载抗生素 CPC 一期治疗慢性骨髓炎伴骨缺损的疗效。方法采用单盲、前瞻性临床随机对照试验，以 2018 年 4 月—2019 年 4 月收治且符合选择标准的 80 例慢性骨髓炎伴骨缺损患者为研究对象，按随机数字表法分为试验组（采用载 rhBMP-2 CPC 联合载抗生素 CPC）与对照组（采用载抗生素 CPC），每组 40 例。两组患者性别、年龄、病程、病变部位以及术前白细胞计数、血小板计数、红细胞沉降率及 C 反应蛋白等一般资料比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。术中病灶清除后，两组植入对应 CPC 修复骨缺损并外固定。比较两组术后白细胞计数、血小板计数、红细胞沉降率、C 反应蛋白，患者住院时间、取出外固定架时间、患肢完全负重时间，以及骨髓炎治愈率、修复骨容积。 结果两组患者均获随访，随访时间 12～24 个月，平均 18.4 个月。两组术后 4 周白细胞计数、血小板计数、红细胞沉降率及 C 反应蛋白比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；两组组内术前 1 周与术后 4 周白细胞计数、血小板计数及 C 反应蛋白比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；红细胞沉降率比较差异无统计学意义（P>0.05）。试验组 1 例胫骨骨髓炎切口出现无菌性渗液，经口服氯雷他定后愈合；两组其余患者切口均Ⅰ期愈合。两组各 1 例胫骨远端骨髓炎复发，对照组 1 例肱骨骨髓炎复发；试验组骨髓炎治愈率为 97.5%（39/40）、对照组为 95%（38/40），差异无统计学意义（χ²=0.000，P=1.000）。两组修复骨容积及住院时间比较，差异无统计学意义（P>0.05）；X 线片及 CT 复查示两组患者骨缺损均修复。试验组拆除外固定架时间及患肢完全负重时间均较对照组明显缩短（P<0.05）。 结论载 rhBMP-2 CPC 联合载抗生素 CPC 一期治疗慢性骨髓炎伴骨缺损有效，能加速诱导骨原位再生修复骨缺损，减少创伤，缩短疗程，恢复良好患肢功能。     

内皮祖细胞来源小细胞外囊泡促进小鼠脊髓损伤修复的实验研究

目的探讨内皮祖细胞来源小细胞外囊泡（endothelial progenitor cells derived small extracellular vesicles，EPCs-sEVs）对小鼠脊髓损伤的治疗效果。方法取 20 只 C57BL/6 雄性小鼠股骨及胫骨骨髓分离培养 EPCs，采用双荧光染色及流式细胞术鉴定；然后对 EPCs 进行传代，收集 P2～P4 代细胞上清，以超速离心法提取 EPCs-sEVs，采用透射电镜、纳米流式检测仪及 Western blot 进行鉴定。取 40 只 C57BL/6 雌性小鼠随机分为 4 组（n=10），其中假手术组仅切除 T₁₀ 椎板，模型组以及低、高浓度干预组制备 T₁₀ 脊髓损伤模型；模型制备后 30 min、3 d 及 7 d 低、高浓度干预组经尾静脉分别注射浓度为 1×10⁹、1×10¹⁰ 个/mL 的 EPCs-sEVs。术后行小鼠行为学检测（BMS 评分、斜板实验、Von Frey 实验），术后 4 周取材行大体、HE 染色及免疫组织化学染色观察脊髓组织结构变化。另取 3 只 C57BL/6 雌性小鼠制备 T₁₀ 脊髓损伤模型后，经尾静脉注入 DiR 标记的 EPCs-sEVs，30 min 后活体成像仪观察 EPCs-sEVs 是否达脊髓损伤部位。 结果经鉴定，成功获取小鼠骨髓来源的 EPCs 及 EPCs-sEVs；活体成像仪观察显示 EPCs-sEVs 在注射后 30 min 内募集至脊髓损伤区域。行为学检测示，术后 2 周内两干预组 BMS 评分及斜板实验最大角度与模型组比较差异均无统计学意义（P>0.05），2 周后均明显优于模型组（P<0.05）；术后 4 周两干预组 Von Frey 实验示机械痛阈值明显高于模型组、低于假手术组，差异均有统计学意义（P<0.05）；上述指标两干预组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。与模型组相比，两干预组损伤节段脊髓组织缺损较小，单个核细胞浸润较少，组织结构恢复明显，血管新生更多（P<0.05）；两干预组间无明显差异。 结论EPCs-sEVs 可促进小鼠脊髓损伤修复，为脊髓损伤的生物治疗提供了新的方案。     

人脂肪来源干细胞对小鼠压疮愈合影响的实验研究

目的探讨人脂肪来源干细胞（human adipose-derived stem cells，hADSCs）对小鼠压疮创面愈合的影响。方法取自愿捐赠的人脂肪组织，采用机械分离联合胶原酶消化法获取 hADSCs 并传代。取第 3 代细胞行成骨、成脂、成软骨分化以及流式细胞仪鉴定。取健康自愿者捐赠的外周血，采用离心法制备富血小板血浆（platelet rich plasma，PRP），并行血小板计数。取 45 只 C57BL/6 小鼠采用磁铁夹压法于背部制备压疮模型，随机分为 3 组（n=15）；hADSCs 组、PRP 组及对照组创面分别注射 100 μL 经携带绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）标记后的 hADSCs（1×10⁶个）、人 PRP、PBS。注射后观察压疮创面愈合情况，5、9、13 d 计算创面愈合率；5、11、21 d 取标本行 HE 染色、Masson 染色以及 CD31、S100 免疫组织化学染色，观察创面血管、神经再生情况。hADSCs 组于 11 d 时荧光示踪法观察细胞定植及成活情况。 结果经诱导分化及流式细胞仪鉴定分离培养细胞为 hADSCs。PRP 血小板计数显著高于正常外周血（t=5.781，P=0.029）。大体观察，注射后 hADSCs 组创面愈合优于 PRP 组及对照组，5、9、13 d，hADSCs 组创面愈合率明显高于 PRP 组及对照组（P<0.05）。组织学观察示，与 PRP 组及对照组相比，hADSCs 组炎性细胞浸润、炎性反应明显减轻，胶原沉积明显增多，且 21 d 时可见皮肤附属器再生；注射后各时间点，hADSCs 组胶原表达量均显著高于 PRP 组及对照组（P<0.05）。免疫组织化学染色示，各时间点 hADSCs 组新生血管数、S100 阳性细胞百分比均明显多于 PRP 组和对照组（P<0.05）。荧光示踪法显示注射 11 d 后 hADSCs 可定植于创面并成活。 结论局部移植的 hADSCs 通过促进血管新生和神经再生，进而促进小鼠压疮创面愈合、提高愈合质量。     

缺氧诱导因子 1α 对人羊膜间充质干细胞耐受缺氧能力影响的实验研究

目的通过瞬时转染缺氧诱导因子 1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）基因，观察缺氧处理后人羊膜间充质干细胞（human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs）成活及凋亡情况，探讨 HIF-1α 对 hAMSCs 耐受缺氧能力的影响。方法取健康剖宫产产妇自愿捐赠的羊膜组织分离、培养 hAMSCs，通过倒置相差显微镜观察细胞形态及免疫荧光法检测干细胞标志物 OCT-4、NANOG 表达，对培养细胞进行鉴定。取第 3 代 hAMSCs 进行缺氧处理（200 μmol/L CoCl₂）后，按以下分组瞬时转染对应质粒：A 组为 hAMSCs 空白组，B 组为 pcDNA3.1 阴性对照组，C 组为 shRNA 阴性对照组，D 组为 shRNA-HIF-1α 干扰组，E 组为 pcDNA3.1-HIF-1α 过表达组。缺氧处理后 12、24、48 h 采用细胞计数试剂盒 8（cell counting kit 8，CCK-8）检测各组细胞成活率；24 h 采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率，并采用 Western blot 检测 HIF-1α、VEGF、B 细胞淋巴瘤 2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）、Bax、活化型半胱天冬酶-3（cleaved Caspase-3，C-Caspase-3）蛋白表达。 结果CCK-8 法检测示，缺氧处理后各时间点与 A、C 组比较，D 组细胞成活率明显降低（P<0.05）；与 A、B 组比较，E 组细胞成活率明显升高，其中 24 h 组间比较差异有统计学意义（P<0.05）；E 组内 24 h 时细胞成活率明显高于 12、48 h 时（P<0.05）。流式细胞仪检测示，与 A、C 组比较，D 组细胞凋亡率明显升高（P<0.05）；与 A、B 组比较，E 组细胞凋亡率明显降低（P<0.05）。Western blot 检测示，与 A、C 组比较，D 组细胞中 HIF-1α、VEGF、Bcl-2 蛋白表达明显减少，Bax、C-Caspase-3 蛋白表达明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）；而 E 组结果相反，与 A、B 组比较，E 组细胞中 HIF-1α、VEGF、Bcl-2 蛋白表达明显增加，Bax、C-Caspase-3 蛋白表达明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）。 结论HIF-1α 基因过表达能够明显改善 hAMSCs 耐受缺氧能力，其机制可能与上调 VEGF 和 Bcl-2 表达及下调 Bax 和 C-Caspase-3 表达作用相关。     

可注射明胶原位水凝胶作为脱钙骨基质粉末输送载体可行性的初步研究

目的介绍一种可注射明胶原位水凝胶，探讨其作为脱钙骨基质（demineralized bone matrix，DBM）粉末输送载体的可行性。方法首先取明胶制备巯基化明胶，Ellman 法检测其巯基含量；然后将其与聚乙二醇双丙烯酸酯交联反应制备可注射明胶原位水凝胶，采用倒置法检测凝胶时间；最后将可注射明胶原位水凝胶与 DBM 粉末混合后制备复合物（以下简称 DBM-Gel）。将 C2C12 细胞包裹于 DBM-Gel 内，采用 live/dead 染色和 Alamar blue 法研究材料细胞毒性。将 C2C12 细胞黏附于 DBM 表面，制备包裹细胞的 DBM-Gel（DBM-Gel 组），培养 1、3、5、7 d 后检测细胞 ALP 活性；以单纯黏附细胞的 DBM 作为对照（DBM 组）。采用裸鼠肌肉异位成骨模型进行体内骨诱导性观察，于裸鼠腹部肌袋分别植入 DBM-Gel（DBM-Gel 组）以及 DBM、PBS 混合液（DBM 组），4 周后取材进行组织学观察以及 ALP 活性检测。结果Ellman 法检测制备的巯基化明胶其巯基含量为（0.51±0.03）mmol/g，可注射明胶原位水凝胶凝胶时间为（6±1）min。将 DBM 与巯基化明胶、PEGDA 溶液混合后，在凝胶时间内可以通过注射方式到达植入位点。随着培养时间延长，DBM-Gel 中细胞呈铺展形态，并且部分细胞之间有连接；培养 1、3、7 d 细胞成活率分别为 95.4%±1.9%、97.3%±1.3%、96.1%±1.6%；培养 1、3、5、7 d 细胞相对增殖率分别为 1.0±0.0、1.1±0.1、1.5±0.1、1.6±0.1。体外诱导培养 1、3、5、7 d DBM-Gel 组和 DBM 组细胞表现相似的 ALP 活性，组间比较差异无统计学意义（P>0.05）；随培养时间延长，两组 ALP 活性均逐渐增加，5、7 d 时 ALP 活性显著高于 1、3 d（P<0.05），1、3 d 间比较以及 5、7 d 间比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。体内植入 4 周后，DBM-Gel 组可见骨、软骨形成，未观察到骨髓形成；DBM 组可见骨髓、骨、软骨形成。DBM-Gel 组、DBM 组骨诱导性组织学评分分别为 4.0、4.5 分；ALP 活性分别为（119.4±22.7）、（146.7±13.0）μmol/mg protein/min，组间比较差异无统计学意义（t=–2.085，P=0.082）。 结论可注射明胶原位水凝胶作为 DBM 粉末输送载体可行。     

应用不同离心条件优化富白细胞富血小板血浆制作方案研究

目的优化富白细胞富血小板血浆（leukocytes-rich platelet-rich plasma，L-PRP）的离心方案，提高容错率及其制备方法的可推广性。方法取 76 例志愿者外周血样（45.0 mL/例），并与 5 mL 输血用枸橼酸钠注射液混匀，均采用两次离心法制备 L-PRP。根据两次离心法参数不同将所有血样分为 3 组：实验组 A（12 例，400×g、10 min，1 100×g、10 min）、实验组 B（27 例，800×g、10 min，1 100×g、10 min）及对照组（37 例，1 360×g、10 min，1 360×g、10 min）。计算并比较 3 组离心方案的 L-PRP 血小板富集系数及回收率和白细胞富集系数。 结果剔除异常血样（血小板回收率高于 100% 或出现白色血栓）后，剩余 55 例纳入统计分析，其中实验组 A 10 例，实验组 B 21 例，对照组 24 例。实验组 B 血小板富集系数和血小板回收率显著高于实验组 A 和对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；实验组 A 和对照组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。实验组 A、B 和对照组的白细胞富集系数差异无统计学意义（P>0.05）。 结论PRP 的制备质量受多种因素影响，包括离心力、离心时间、温度和操作过程等。两次离心法（800×g、10 min，1 100×g、10 min）是一种较为理想且可行的离心方案，可获得较为满意的血小板回收率和富集系数，且白膜层较厚，可降低对操作者的精细化操作要求，提高容错率及可推广性。     

自体注射型富血小板纤维蛋白联合 BMSCs 治疗大鼠坐骨神经损伤的实验研究

目的探讨自体注射型富血小板纤维蛋白（injectable platelet rich fibrin，i-PRF）联合 BMSCs 治疗大鼠坐骨神经损伤的疗效。方法取 10～15 日龄 SD 乳鼠胫骨骨髓分离培养 BMSCs 至第 4 代备用。取 24 只成年 SD 大鼠眶后静脉血采用改良低速离心法制备 i-PRF 后，采用改良挤压损伤法制作坐骨神经Ⅲ度损伤模型后随机分为 4 组，每组 6 只。A、B、C、D 组分别于损伤部位鞘膜内注射 BMSCs 悬液+自体 i-PRF、自体 i-PRF、BMSCs 悬液、生理盐水。术后 1～8 周每周采用 BBB 评分法评价大鼠患肢神经功能恢复情况；术后 2 个月处死各组大鼠取材，行 HE 染色观察坐骨神经组织结构变化，透射电镜观察神经纤维、髓鞘、细胞核等细微结构改变，Western blot 检测 N-cadherin、巢蛋白（Nestin）、胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）表达。结果术后大鼠均未发生免疫排斥反应及死亡。术后 1 周各组大鼠 BBB 评分比较差异无统计学意义（P>0.05）；术后 2～8 周，A 组 BBB 评分显著高于 B、C、D 组，B、C 组显著高于 D 组（P<0.05），B、C 组间差异无统计学意义（P>0.05）。HE 染色示，A 组神经纤维排列整齐，无缺损及脱髓鞘改变；B 组神经纤维结构欠清晰，轻度肿胀；C 组神经纤维部分结构紊乱，局部脱髓鞘改变；D 组神经纤维连续性欠佳，明显脱髓鞘改变，神经外膜部分缺损。透射电镜观察示，A 组神经纤维结构清晰，髓鞘完整，细胞核致密；B 组较 A 组稍次之；C 组神经纤维结构模糊，有脱髓鞘改变；D 组神经纤维结构紊乱，有脱髓鞘改变，神经外膜连续性中断。Western blot 检测示，各组 Nestin 蛋白相对表达量比较差异均无统计学意义（P>0.05）。B、C、D 组 N-cadherin 蛋白相对表达量显著低于 A 组，C、D 组低于 B 组，D 组低于 C 组，差异均有统计学意义（P<0.05）。B、C、D 组 GFAP 蛋白相对表达量显著低于 A 组，D 组显著低于 B、C 组，差异有统计学意义（P<0.05）；B、C 组间差异无统计学意义（P>0.05）。 结论自体 i-PRF 与 BMSCs 联合使用可有效治疗大鼠坐骨神经损伤。     

膝关节多发韧带损伤脱位伴腘动脉损伤三例

目的总结3例膝关节多发韧带损伤脱位伴腘动脉损伤的诊疗经验。方法2011年10月—2018年2月，收治3例膝关节多发韧带损伤脱位伴腘动脉损伤男性患者。患者年龄分别为27、70、31岁。损伤累及双侧1例、单侧2例。血管损伤时间10、4、3 h。采用一期修复血管、二期修复韧带治疗。结果患者住院时间分别为30、5、10 周，随访时间为9.5、3.5、3.0 年。 1例患者血管修复术后下肢皮肤、皮下组织部分坏死结痂，经再次植皮后愈合；其余患者切口均Ⅰ期愈合。所有肢体均成活，随访期间无感染、血管再损伤或新鲜血栓形成。末次随访时膝关节功能恢复良好，Tegner评分、Lysholm评分及美国特种外科医院（HSS）评分均较术前明显改善。1例合并双侧腘动脉损伤者并发双侧跟腱挛缩，1例术后膝关节不稳复发再次手术。结论膝关节多发韧带损伤脱位伴血管损伤临床较少见，多学科协作、及早发现和评估血管损伤、优先处理腘动脉损伤逆转肢体缺血及固定肢体是治疗此类损伤的有效方法，能够保存肢体并改善膝关节功能。     

粒细胞集落刺激因子动员 BMSCs 归巢治疗大鼠脊髓损伤的疗效观察

目的观察粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulating factor，G-CSF）动员 BMSCs 归巢对大鼠脊髓损伤的治疗效果，评估 G-CSF 动员 BMSCs 治疗脊髓损伤的可行性。方法将 24 只成年健康雌性 SD 大鼠术前 12 h 于鼠尾静脉注射绿色荧光蛋白（green fluorescence protein，GFP）标记的 BMSCs（GFP-BMSCs），并随机分为假手术组（A 组）、假手术+G-CSF 组（B 组）、脊髓损伤组（C 组）、脊髓损伤+G-CSF 组（D 组），每组 6 只。C、D 组采用 T₁₀ 水平脊髓半切法建立脊髓损伤模型，A、B 组仅行椎板切除，不损伤脊髓；术后 1 h B、D 组分别注射 G-CSF（10 μg/kg·d），连续注射 3 d；A、C 组注射等量生理盐水。术后 1、3、7、14、21、28 d 采用 BBB 评分行大鼠双后肢神经功能评估，并采用 ELISA 法检测血清 TNF-α 和基质细胞衍生因子 1（stromal cell-derived factor 1，SDF-1）表达。术后 28 d 处死大鼠取脊髓样品行免疫组织化学染色观察细胞因子 SDF-1、BDNF、VEGF 和 TNF-α 表达，免疫荧光染色观察 GFP-BMSCs 阳性细胞及双染荧光黄色的 GFP/神经元核抗原（neuronal nuclei，NeuN）阳性神经元细胞和 GFP/胶质原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）阳性神经胶质细胞数；并采用 TUNEL 法检测细胞凋亡。 结果术后各时间点 A、B 组 BBB 评分较术前无明显变化；术后 1 d，C、D 组 BBB 评分降至最低，后逐渐上升。除术后 1 d 外，其余各时间点 D 组 BBB 评分均显著高于 C 组（P<0.05）。术后 3、7、14、21、28 d，C、D 组 TNF-α 和 SDF-1 含量均明显高于 A、B 组（P<0.05）；但 D 组各时间点 TNF-α 含量显著低于 C 组，SDF-1 含量显著高于 C 组（P<0.05）。免疫组织化学染色示，术后各时间点 C、D 组 SDF-1、BDNF、VEGF 和 TNF-α 表达均显著高于 A、B 组（P<0.05）；D 组 SDF-1、BDNF、VEGF 表达显著高于 C 组，TNF-α 表达显著低于 C 组（P<0.05）。免疫荧光染色示，C、D 组 GFP-BMSCs、GFP/NeuN、GFP/GFAP 阳性细胞数均显著多于 A、B 组，D 组显著多于 C 组，差异均有统计学意义（P<0.05）。TUNEL 法检测示，C、D 组凋亡细胞数目显著低于 A、B 组，D 组显著低于 C 组，差异均有统计学意义（P<0.05）。 结论G-CSF 可以动员 BMSCs 归巢至大鼠脊髓损伤部位并参与修复，其作用可能与其下调 TNF-α 减少细胞凋亡，上调 SDF-1、BDNF、VEGF 促进 BMSCs 迁移有关。     

天然水蛭素对人微血管再生作用的初步研究

目的研究天然水蛭素对人微血管内皮细胞（human microvascular endothelial cells，HMVECs）增殖的影响及其诱导血管再生的机制。方法取 HMVECs 接种至 Matrigel 基质胶培养 24 h，体外建立三维培养模型，于倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。然后将细胞三维培养模型随机分为不同浓度天然水蛭素培养组（1、4、7 ATU/mL 组）以及单纯含 10%FBS 的 DMEM 培养基培养组（对照组）。各组细胞三维培养模型加入对应培养基后，培养 24、48、72 h 采用细胞计数试剂盒 8（cell counting kit 8，CCK-8）检测细胞增殖情况；培养 24 h 行成管实验并采用免疫荧光染色法测定细胞 VEGF 及 Notch1 表达水平。结果细胞三维培养观察示，HMVECs 于基质胶上贴附良好，24 h 时完全形成管腔样结构。CCK-8 检测示，各时间点 1、4 ATU/mL 组 A 值均高于对照组（P<0.05），其中 4 ATU/mL 组最高；而 7 ATU/mL 组A 值显著低于对照组以及 1、4 ATU/mL 组（P<0.05）。细胞成管实验示，1、4 ATU/mL 组成管数量较对照组及 7 ATU/mL 组明显增多，且 4 ATU/mL 组多于 1 ATU/mL 组，差异有统计学意义（P<0.05）；7 ATU/mL 组与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。免疫荧光染色示，与对照组比较，1、4 ATU/mL 组 Notch1 表达量增高，7 ATU/mL 组降低；其中 4、7 ATU/mL 组与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。1、4、7 ATU/mL 组 VEGF 表达量均较对照组增高，4 ATU/mL 组高于 1、7 ATU/mL 组，差异均有统计学意义（P<0.05）。 结论低、中浓度天然水蛭素可促进 HMVECs 增殖使血管再生，高浓度天然水蛭素则对 HMVECs 增殖及血管再生起抑制作用；其作用机制可能与 VEGF-Notch 信号通路有关。     

猪胶原膜异种皮下移植远期转归的实验研究

目的探讨猪胶原膜（商品名：无菌生物护创膜）植入大鼠体内后的远期转归。方法取 20 只 SD 大鼠随机分为两组，每组 10 只。实验组大鼠背部皮下植入猪胶原膜，对照组不植入猪胶原膜。实验组分别于术后 3、7、15 d 及 1、3、6、12 个月连续取材，行大体及组织学观察炎性反应、CD31 免疫组织化学染色观察新生血管情况、透射电镜观察胶原排列；对照组于术后 12 个月取大鼠背部相同部位皮肤组织进行观察并比较。结果实验组大鼠术后切口愈合良好，无明显红肿及炎性反应。大体观察示，随时间延长，猪胶原膜与周围组织接触紧密，无明显排斥反应，12 个月时猪胶原膜仍清晰可辨。组织学观察示，实验组术后 7 d 可见成纤维细胞、炎性细胞浸润；15 d 及 1 个月与宿主组织连接处可见明显增生微血管和成纤维细胞，炎性反应渐消退；3 个月时猪胶原膜周围血管及细胞丰富，内部可见血管及细胞；6、12 个月猪胶原膜内血管增生及成纤维细胞逐渐减少，新生胶原增多，边缘有融合。术后 15 d、1 个月实验组炎性细胞数明显多于术后 12 个月对照组（P<0.05）；12 个月时与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。CD31 免疫组织化学染色示，实验组术后 15 d 可见膜内血管新生，1 个月膜内、外血管新生明显，12 个月时血管新生较前明显减少。与对照组比较，实验组术后 15 d 及 12 个月 CD31 阳性表达量显著降低，术后 1 个月 CD31 阳性表达量显著升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。透射电镜观察示，实验组术后 12 个月移植物胶原排列与植入前无明显改变，内部可见周细胞和成纤维细胞。 结论猪胶原膜植入大鼠体内后远期结构稳定，具有良好免疫耐受特性。     

深低温冷冻对大鼠髌腱组织内肌腱干细胞生物学特性影响的研究

目的探讨深低温冷冻处理对大鼠髌腱组织中肌腱干细胞（tendon-derived stem cells，TDSCs）的成活、细胞活力、早期凋亡、迁移能力及肌腱相关基因表达的影响。方法取 12 只 4 月龄雄性 SD 大鼠双侧髌腱组织，其中 6 只大鼠 12 条髌腱组织（实验组）进行深低温冷冻处理；剩余髌腱组织（对照组）不作处理，作为正常对照。取两组髌腱组织用 0.3% Ⅰ 型胶原酶消化获得有核细胞，分别用锥虫蓝染色检测有核细胞成活率、结晶紫染色检测有核细胞克隆形成能力；取两组髌腱组织分离培养 TDSCs，并传至第 3 代，采用 Alamar Blue 法检测细胞体外增殖能力；Annexin V-FITC/PI 双染法检测细胞早期凋亡率；Transwell 法检测细胞迁移能力；实时荧光定量 PCR 检测细胞肌腱相关基因 Ⅰ 型胶原（collagen type Ⅰ，Col1α1）、scleraxis（Scx）和 tenomodulin（Tnmd） mRNA 表达。结果与对照组（91.00%±3.63%）比较，实验组原代有核细胞成活率为 61.65%±4.76%，差异有统计学意义（t=12.010，P=0.000）。两组有核细胞接种后，均呈克隆样生长；培养 12 d，实验组每 1 000 个有核细胞克隆集落形成数为（8.41±0.33）个，较对照组（15.19±0.47）个显著减少（t=28.910，P=0.000）。实验组 TDSCs 占活性有核细胞比例为 1.37%±0.09%，较对照组 1.67%±0.10% 显著减少（t=5.508，P=0.003）。第 3 代 TDSCs 培养 14 d 内两组细胞生长趋势一致；两组各时间点吸光度（A）值比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。实验组及对照组 TDSCs 早期凋亡率分别为 1.67%±0.06%、1.63%±0.06%，比较差异无统计学意义（t=0.707，P=0.519）。镜下见，两组均有 TDSCs 黏附于 Transwell 小室下室，实验组细胞数为（445.00±9.70）个，对照组为（451.50±12.66）个，比较差异无统计学意义（t=0.998，P=0.342）。实验组 Col1α1、Scx、Tnmd 的 mRNA 相对表达量分别为 3.498±0.065、0.062±0.002、（4.211±0.211）×10^–5，对照组分别为 3.499±0.113、0.062±0.001、（4.341±0.274）×10^–5，比较差异均无统计学意义（t=0.013，P=0.991；t=0.042，P=0.969；t=0.653，P=0.549）。 结论大鼠肌腱组织经深低温冷冻后其有核细胞成活率降低，但肌腱组织仍保留大量有活性 TDSCs，且细胞增殖能力、早期凋亡率、体外迁移能力及成肌腱分化能力未见明显异常。     

核定位信号肽偶联核激酶底物短肽修饰壳聚糖介导微小 RNA-140 对兔关节软骨细胞作用的研究

目的探讨核定位信号肽偶联核激酶底物短肽（nucleus localization signal linked nucleic kinase substrate short peptide，NNS）修饰壳聚糖（chitosan，CS）（^NNSCS），介导人微小 RNA-140（microRNA-140，miR-140）基因转染，对体外培养的兔关节软骨细胞的作用。 方法将重组质粒 GV268-miR-140 和空质粒 GV268 分别与 ^NNSCS 复合形成 ^NNSCS/pDNA 纳米复合物。取新生新西兰大耳白兔膝关节软骨，采用胰蛋白酶和胶原酶联合消化法分离培养原代软骨细胞。取第 2 代软骨细胞分为 3 组：正常细胞对照组（A 组）、^NNSCS/GV268 空质粒转染组（B 组）、^NNSCS/GV268-miR-140 转染组（C 组），B、C 组细胞分别以 ^NNSCS/GV268 及 ^NNSCS/GV268-miR-140 纳米复合物瞬时转染。转染后，实时荧光定量 PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，RT-qPCR）检测外源 miR-140 的表达；Annexin Ⅴ-FITC/PI 双染色法及 MTT 法分别检测外源 miR-140 对软骨细胞凋亡及增殖活力的影响；RT-qPCR 检测软骨细胞中 Sox9、聚集蛋白聚糖（Aggrecan）、组蛋白去乙酰化酶 4 （histone deacetylase 4，Hdac4）基因表达。 结果RT-qPCR 检测示，C 组外源 miR-140 表达水平较 A、B 组明显上调（P<0.05）。与 A、B 组比较，C 组软骨细胞凋亡率明显降低，细胞增殖活力明显增加，细胞内 Sox9、Aggrecan 基因相对表达量明显上调、Hdac4 基因相对表达量明显下调（P<0.05）；A、B 组间以上指标比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。 结论^NNSCS 可携带外源基因进入软骨细胞并高效表达，高表达的 miR-140 能提高体外培养软骨细胞的生物活性，为其用于治疗软骨损伤性疾病提供了实验依据。