游离缘指甲DNA检测异基因造血干细胞移植后供受者嵌合状态的变化

目的 探讨异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)后用患者指甲游离缘标本进行短片段重复序列(short tandem repeat,STR)基因分型和供受者嵌合率检测的适用性,并观察移植后患者指甲中供受者嵌合状态变化.方法 选取2009年7月至2011年9月在北京市道培医院行allo-HSCT的25例患者及25名供者.采集患者及其供者外周血、骨髓、指甲游离缘和口腔黏膜标本.提取标本中基因组DNA,进行15个STR位点的基因分型和嵌合状态分析.将患者分为2组:第1组包括12例患者,在接受allo-HSCT后1个月内分别同时采集患者的指甲游离缘标本和口腔黏膜标本,并做嵌合状态的比较;第2组包括13例患者,观察患者行allo-HSCT后3个月指甲标本中的嵌合状态,并对其中3例患者进行多次指甲标本采集和嵌合状态检测.结果 在第1组12例患者中,指甲标本均检测为患者自身的STR基因型;在4份口腔黏膜标本中检测到供受者混合嵌合状态,供者STR基因型所占比例分别为16.7％、32.1％、35.8％和60.7％.在第2组13例患者中,5例患者存在供受者细胞的混合嵌合状态,即受者指甲中出现供者的STR基因型,嵌合率在6.7％至82.6％之间.3例行allo-HSCT后多次检测指甲嵌合率的患者中,1例始终未检测到供者基因型的嵌合,另2例患者中检测到持续存在的供者基因型的嵌合.结论 移植后1个月内采集的指甲游离缘标本可用于患者STR基因型鉴定和供受者嵌合率分析,优于口腔黏膜标本.供者的移植物中具有可以分化成为皮肤组织的细胞,部分患者移植后皮肤中可长期存在供者来源细胞的嵌合状态.     

STR-PCR分析嵌合体在同种异基因造血干细胞移植中的应用

利用荧光标记的多重PCR扩增短串联重复序列（STR-PCR）结合毛细管电泳检测供者细胞嵌合率（DC）,以探讨该方法的连续检测对异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）后转归的预警作用,采集27例清髓性外周血干细胞移植患者移植前、移植后不同时段的外周血或骨髓,DNA样本用Profiler Plus和Cofiler Plus商品化试剂盒扩增后,用ABI310遗传分析仪进行毛细管电泳,确定基因位点及峰面积,根据基因型的差异选择嵌合率计算公式。结果表明：两种试剂盒测得的DC嵌合率一致;在27对中能区别出供受差别的STR位点,Profiler Plus为6.3（4-9）个,Cofiler Plus为4.9（2-6）个。26例患者均在移植后28天出现供者细胞,1例患者未出现供者细胞。14例患者DC100%,均获得持久植入,至今仍无白血病生存;另有9例患者出现不稳定混合嵌合（MC）状态（DC为0%-90.2%）,其中5例为血液学复发。27例病人中有6例死亡。上述5例复发患者均在出现临床症状前发生DC量下降;供者细胞完全嵌合组移植物抗宿主病（GVHD）的发生率高于MC组。结论：动态检测DC可用于移植动力学研究,对移植物早期植入或被排斥、疾病复发以及GVHD的发生均有预警作用,对早期实施临床干预治疗有重要的指导意义。     

异基因脐血干细胞移植后STR基因座位的表达分析

本研究分析杜氏型肌营养不良（DMD）病人异基因脐带血干细胞移植后STR基因座位的表达。利用PCR—SSO方法检测患者、供者HLA-A、B、DR位点，并利用STR—PCR方法检测术后各个器官的STR-基因位点的表达情况。结果表明：患者与供者在HLA中、低分辨情况下A、B、DR位点全相合，患者的胸骨骨髓显示为供者独立植入，脾、左上肺、前臂、肌舌、左肝、胃、右颞叶、膈肌、右支气管、左心室、右肾均为嵌合状态。结论：造血干细胞移植术后，供者的基因可在实体器官表达，形成嵌合状态.     

短串联重复序列检测在异基因造血干细胞移植植入状态中的应用

背景:移植后造血干细胞植活的判断主要依赖于体内各种遗传标记,其在敏感性和有效性方面各不相同,故亟待建立一种鉴别力强、敏感性高、不受性别限制的检测方法。目的:观察异基因造血干细胞移植供受者移植前及受者移植后不同时间段的血样DNA短串联重复序列遗传位点检测情况。设计:观察测量实验。单位:深圳市血液中心输血医学研究所免疫遗传重点实验室。对象:选择2004-02/2005-12在深圳市血液中心输血医学研究所免疫遗传实验室配型成功并进行造血干细胞移植的18对供受者血样,18例患者中,男10例,女8例,平均35岁。接受血缘关系供者移植6例,无关供者移植12例。所有受试对象均对检测项目知情同意。方法:采用荧光标记复合扩增短串联重复序列(STR)检测技术,对18例进行造血干细胞移植的血液病患者移植后的系列血样及移植前供、受者的血样进行15个STR位点和1个性别位点的检测,找出供受者间的差异基因,观察移植后供者的STR基因在受者体内的植入情况及变化过程,找出最早检测到供者STR基因的时间及完全嵌合体最早出现的时间。主要观察指标:①观察移植前供受者差异基因。②供者STR基因及完全嵌合体最早出现时间。结果:供受者18对均进入结果分析。①供受者中能区分出彼此差别的平均STR差异位点数为12.4(8～15)个。②患者移植后最早可检测到供者STR基因的平均时间为8(5～14)d,由受者型向完全供者型转化的平均时间为14(9～23)d。植入状态由供受者嵌合型转为完全供者嵌合型。结论:荧光标记复合扩增STR检测方法可精确地描述异基因造血干细胞移植植入状态及其演变过程,可为临床提供一个准确、可靠的实验依据。     

异基因造血干细胞移植后细胞嵌合状态动态监测的临床意义

目的 研究异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后各系细胞嵌合状态与移植物植入、急性移植物抗宿主病(aGVHD)、移植物被排斥和疾病复发的关系.方法 对65例患者进行allo-HSCT,在移植后定期采集所有患者的外周血和骨髓.用流式细胞术分选了65例患者的CD3+T淋巴细胞,52例分选了CD3-CD56+CD16+NK细胞,32例分选了CD15+粒细胞,20例分选了CD19+B淋巴细胞.进行PCR扩增短串联重复序列检测各系细胞嵌合状态.结果 移植后NK细胞早期植入比例(55.5%)最高,T细胞最晚(+21 d)达到完全供者嵌合状态.+7 d T淋巴细胞供者嵌合比例(DC)≥70%和+14 d T淋巴细胞DC≥95%属aGVHD发生的高危患者.除急性淋巴细胞白血病外,出现移植物被排斥的分子生物学征象者和疾病复发者,都以T淋巴细胞供者嵌合状态下降为主.在过继免疫治疗中,动态检测嵌合状态可以判断疗效和指导进一步的治疗.结论 allo-HSCT后T淋巴细胞嵌合状态动态检测可以早期预测发生aGVHD的高危患者、判断移植物植入、发现移植物被排斥和疾病复发并指导免疫调节治疗的时机和疗效.     

PCR-STR用于异基因造血干细胞移植后的骨髓和外周血嵌合状态的监测及作用

目的用PCR-STR检测观察比较异基因造血干细胞移植术后,骨髓和外周血嵌合状态和植入状态。方法提取17例异基因造血干细胞移植术中的供者外周血及受者移植前后各阶段外周血和骨髓的DNA,PCR PCR-STR检测扩增15个基因位点,和1个性别位点AMEL。用遗传分析仪进行毛细管电泳,确定基因位点,根据基因型的差异选择嵌合率计算公式,分析植入情况和嵌合状态。结果12名患者完全植入,骨髓和外周血的PCR-STR结果一致;1名患者骨髓PCR-STR显示为持续未植入,外周血PCR-STR显示为短期混合植入;4名患者骨髓和外周血PCR-STR显示嵌合状态时间不一致,骨髓PCR-STR显示嵌合状态时间明显早于外周血(P<0.05)。结论PCR-STR是分析异基因造血干细胞移植后供体是否植入的灵敏、准确度高的方法,骨髓嵌合状态的变化的出现早于外周血,混合嵌合状态对白血病复发有预警作用,骨髓嵌合状态的早期变化对实施临床干预治疗尤为重要。     

造血干细胞移植植入存活检定技术的应用性研究

目的 探讨荧光标记短串联重复(STR)复合扩增技术在造血干细胞移植(SCT)存活检定中的应用价值。方法 用荧光标记引物对15个STR位点和1个性别位点牙釉质蛋白基因(amelogenin)进行聚合酶链反应(PCR)复合扩增，再用DNA自动测序仪对PCR产物进行分离及分型，并对30例移植后病人做存活鉴定检测。结果 有20例移植后病人的15个STR位点的分型完全表现供者源性，与受者移植前不同；3例表现为供／受体干细胞混合嵌合状态，7例未表现出供者源性细胞在受者体内的植入。结论 荧光标记STR复合扩增体系特异性强，个体识别力高，检测灵敏、快速、简便，可作为SCT存活的可靠指标。     

混合脐血成人移植定量监测植入状态的实验研究

为了定量监测和研究双份异基因脐血用于成人白血病患者移植后两份脐血的植入状态、嵌合体类型、供者细胞相对数量的动态变化及演变规律 ,采用荧光标记复合扩增短串联重复 (STR)位点嵌合体定量检测技术 ,对 1例急性髓细胞白血病成人患者移植两份 (脐血 1有核细胞数为 2 .5× 10 7/kg ,脐血 2有核细胞数为 1.5 3× 10 7/kg)HLA各 1个位点不相合的异基因脐血前后的序列血样进行 9个STR位点的检测 ;利用供、受者之间的差异位点定性判断脐血是否植入以及嵌合体类型 ;而后根据 377XLDNA测序仪上荧光扫描后两供者差异基因检出峰的峰面积计算脐血植入后患者体内两份脐血的细胞相对数量 ,定量分析供体细胞植入程度及演变规律 ;并与采用HLA差异基因对植入状态的分析结果进行对比。结果表明 :移植后 15天两份脐血同时植入 ,植入状态为完全双份供者嵌合体 ,患者体内脐血 1的相对细胞数量占 5 1.3% ,脐血 2占 4 8.7% ;30天时脐血 1嵌合体细胞上升为 70 .0 % ,脐血2嵌合体细胞下降为 30 .0 %。 5 2天时只检测到脐血 1的基因 ,植入状态转为完全单份供者嵌合体 ,有核细胞数少的一份脐血被排斥 ,有核细胞数多的一份长期植入。结论 :荧光标记复合扩增STR嵌合体定量检测可精确地描述两份脐血的植入程度及变化过程 ,为临床脐     

STR峰高与峰下面积在干细胞移植后状态判断的应用探讨

目的 探讨短串联重复序列（STR）信息位点的峰高与峰下面积在异基因造血干细胞移植后嵌合状态判断中的作用,寻找适合于异基因造血干细胞移植状态判断的指标.方法 分别采集两名无关供者及M2患者及其HLA全相合供者两组血标本,以白细胞含量为依据制备不同比例混合血样,提取DNA,使用STR试剂盒,建立PCR扩增体系,在ABI3100仪上检测扩增片段,筛选得到理想的信息位点,获取其峰高及峰面积进行移植嵌合率的计算.结果 各筛选位点以峰高或面积得出的模拟嵌合率间差异均无统计学意义,且各位点模拟嵌合率与制备的浓度梯度之间的相关系数均在0.9965以上.结论 峰高或峰下面积均可作为嵌合状态的定量监控指标.     

STR-PCR对造血干细胞移植后植入证据的检测

本研究采用STRPCR检测方法，观察比较15例异基因造血干细胞移植术后患者的植入情况。提取15例异基因造血干细胞移植术患者及其供者移植前的以及患者移植术后的不同时期的外周血或骨髓DNA，PCR扩增5个具有高度多态性的STR位点，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染，分析其植入情况。结果表明：15例患者均有不同程度植入，其中完全供者植入10例，供受者混合嵌合体5例。持续缓解10例，死亡4例，1例复发但仍存活。混合嵌合体中供者DNA比例的下降预示着早期排斥或复发。Ⅱ度以下急性移植物抗宿主病的发生与混合嵌合体有明显相关性。结论：STRPCR是分析异基因造血干细胞移植后供体是否植入的灵敏、准确度高的方法，混合嵌合状态对白血病复发有预警作用。嵌合状态的变化对疾病的治疗有指导作用。     

荧光标记短串联重复序列复合扩增监测嵌合体的应用研究

本研究采用荧光标记的多重PCR复合扩增短串联重复序列(STR)结合全自动毛细管电泳检测异基因造血干细胞移植后嵌合体水平,并探讨该方法动态监测对移植患者预后判断的作用。采集30例异基因造血干细胞移植患者及其供者移植前后骨髓或外周血的DNA,采用Profiler Plus试剂盒进行PCR扩增,产物经ABI310遗传分析仪进行毛细管电泳,通过供受者基因位点差异和峰面积进行嵌合体的定量检测。结果表明,29例患者在移植后28天形成完全供者嵌合体(complete chimerism,CC),1例形成混合嵌合体(mixed chimerism,MC)。在长期随访中,22例表现为持续完全供者嵌合体,8例混合嵌合体患者中7例原病复发,从完全供者嵌合体转为混合嵌合体。完全供者嵌合体组移植物抗宿主病(GVHD)的发生率明显高于混合嵌合体组。结论 :荧光标记多重复合扩增STR检测嵌合体具有快速、自动化高、可定量及灵敏度高等优点,动态定量监测嵌合体可用于移植动力学研究,对移植物早期植入或被排斥、疾病复发以及GVHD均有预警作用,对实施临床干预治疗有指导价值。     

非清髓异基因造血干细胞移植患者早期造血细胞嵌合体检测及其临床意义

目的　研究非清髓异基因造血干细胞移植 (NAST)早期造血细胞嵌合体变化规律 ,探讨分子植入 (ME)与造血恢复、移植排斥的关系。方法　应用短串联重复序列 (STR) PCR技术检测 6例血液病患者NAST后外周血及骨髓中造血细胞嵌合体。结果　NAST后 5例早期移植成功的病例其外周血造血细胞嵌合体变化特点为 :移植后 1天 ( 1天 )供者造血细胞嵌合比例为 13%～ 6 0 % , 7天嵌合比例均 >5 0 % , 14天达到完全供者造血嵌合 (FDC) , 2 1～ 2 8天嵌合比例稳定在 80 %～ 10 0 %。这 5例ME时间平均为 6天 ,较造血恢复时间提前 5d(P >0 .0 5 )。而 1例在 7天嵌合比例 <5 0 % , 14天为完全受者细胞 ,但其在 14天亦恢复自身造血。结论　NAST早期造血细胞嵌合体检测及确定ME对判断植入、预测移植排斥具有重要意义。NAST后如 7天供者造血细胞嵌合比例 <5 0 %、 14天仍未达到ME ,预示着发生移植排斥的可能性较大     

荧光标记引物复合扩增短串联重复序列技术用于异基因造血干细胞移植植活测定

目的　探讨荧光标记引物复合扩增短串联重复序列技术(fm PCR -STR)在分析异基因造血干细胞移植(allo- SCT)后植活状态中的作用。方法　用fm -PCR- STR技术对 15例allo SCT患者的 15个STR位点和 1个性别位点 (牙釉蛋白基因 )进行分析。结果　12例(5例接受HLA全相合allo- SCT和 7例接受HLA半相合allo SCT)的受者移植后均持续表达完全供者型。1例HLA全相合allo -SCT和 1例HLA半相合allo -SCT在fm PCR -STR动态观察中早期均表现为完全供者型,分别于 82d和 381d转为嵌合型。1例HLA半相合首次移植 31d表达完全受者型(反映移植失败),再次移植 29d表达完全供者型。结论　fm -PCR- STR可敏感且精确地分析allo SCT后移植物植活状态,亦可作为白血病复发的监控手段。     

Profiler体系用于异基因造血干细胞移植植活测定

目的探讨应用Profiler体系进行短串联重复序列（STR）基因位点检查在异基因造血干细胞移植中的作用。方法采用荧光标记STR-PCR复合扩增、毛细管电泳基因分型技术，对11例异基因造血干细胞移植的供者和受者移植前、后STR基因进行检测，了解造血干细胞的植入情况。结果11例异基因造血干细胞移植受者移植后STR基因型与受者移植前STR基因型不同，与供者STR基因型完全相同，提示供者造血干细胞的植入。结论应用Profiler体系进行STR基因位点检查可用于判断异基因造血干细胞移植的植入情况。     

异基因造血干细胞移植后复发慢性髓系白血病患者嵌合体和融合基因的动态观察

本研究利用STR—PCR结合RT—PCR定量和定性检测异基因造血干细胞移植（allo—HSCT）后患者嵌合体和融合基因的表达，分析其植入和微小残留病变情况，评价其对复发的预测价值。采用STR—PCR结合毛细管电泳进行定量检测嵌合体供体细胞嵌合率，采用RT—PCR方法检测融合基因转录本bcr／abl mRNA。结果表明：4例患者在移植后28天均为100％供者型嵌合，融合基因bcr／abl mRNA均为阴性。但在以后的随访过程中发现4例患者在不同时间出现不稳定混合嵌合（MC）状态（DC为0％-80．4％），融合基因bcr／abl mRNA阳性；其中2例复发后一直处于混合嵌合状态，另外2例在临床干预治疗后又转变为完全嵌合状态，目前处于分子生物学缓解状态。上述4例复发患者均在出现临床症状前发生供体细胞嵌合率（DC）下降；融合基因表达阳性。结论：STR—PCR在敏感范围内，其结果与RT—PCR的结果符合率高，两种技术的结合是一种检测异基因造血干细胞移植后供体是否植入的有效手段，对判断疾病复发及GVHD均有预警作用，对实施临床干预治疗有重要指导价值。     

HLA-B位点不合两份脐血混合移植植入状态的动态观察

目的动态观察分析两份HLA不全相合异基因混合脐血移植后的植入状态.方法一例成人急性髓细胞白血病患者采用了两份HLA-B位点不全相合非血缘脐血移植(脐血1有核细胞数为2.5×107/kg,脐血2有核细胞数为1.53×107/kg),对其移植前、移植后15天、30天、52天和69天的外周血进行HLA及STR基因两种遗传学标记物的检测.采用PCR-SSP基因分型试剂盒对HLA-B位点进行差异分析,用"Profiler Plus"及"Cofiler"试剂盒检测15个STR位点,对移植前后的检测结果进行对比分析.结果 HLA及STR检测均显示移植后15天、30天基因型为完全两份脐血的嵌合型,移植后52天、69天只表达脐血1的基因型.结论两份脐血移植初期可同时植入,而后其中有核细胞数高的一份脐血可长期植入.HLA及STR基因作为植入证据为临床脐血混合应用及治疗提供了直接的实验依据.     

HLA-B位点不合两份脐血混合移植植入状态的动态观察

目的动态观察分析两份HLA不全相合异基因混合脐血移植后的植入状态。方法一例成人急性髓细胞白血病患者采用了两份HLA-B位点不全相合非血缘脐血移植(脐血1有核细胞数为2.5×107/kg,脐血2有核细胞数为1.53×107/kg),对其移植前、移植后15天、30天、52天和69天的外周血进行HLA及STR基因两种遗传学标记物的检测。采用PCR-SSP基因分型试剂盒对HLA-B位点进行差异分析,用“ProfilerPlus”及“Cofiler”试剂盒检测15个STR位点,对移植前后的检测结果进行对比分析。结果HLA及STR检测均显示移植后15天、30天基因型为完全两份脐血的嵌合型,移植后52天、69天只表达脐血1的基因型。结论两份脐血移植初期可同时植入,而后其中有核细胞数高的一份脐血可长期植入。HLA及STR基因作为植入证据为临床脐血混合应用及治疗提供了直接的实验依据。     

STR-PCR定量检测嵌合体供者嵌合率准确性探讨

目的探讨用荧光标记复合扩增短串联重复序列(STR-PCR)结合序列分析仪毛细管电泳法检测嵌合体供者细胞嵌合率的准确性。方法采集健康献血者外周血按白细胞比例两两混合制备不同供受者比例的体外嵌合体模型,对15个STR位点进行荧光标记复合扩增,扩增产物进行序列分析仪毛细管电泳,计算嵌合率。结果实验测得嵌合率与扩增前样本嵌合率呈显著直线相关,r=0.999 7,最小检出供者细胞嵌合率<1%。供者嵌合率≥5%的嵌合体模型嵌合率的检测值与理论值差别无统计学意义(P>0.05),<5%的模型嵌合率检测值与理论值差别有统计学意义(P<0.05)。结论荧光标记复合扩增STR基因结合序列分析仪毛细管电泳检测嵌合率方法个体识别力高、特异、敏感,当供者嵌合率≥5%时能准确反映异基因造血干细胞移植后患者的嵌合状态。     

单倍体相合骨髓移植白血病患者造血重建的临床研究

为研究未去除T细胞的单倍体骨髓移植后造血重建的特点 ,对 15例HLA 2 - 3个位点不匹配骨髓移植亲属供者使用G CSF 3- 4 μg/ (kg·d) ,连续 7天后采髓。预处理方案采用大剂量阿糖胞苷联合环磷酰胺和全身照射。应用环孢菌素A和氨甲喋呤、抗胸腺细胞球蛋白及霉酚酸酯 (MMF)预防移植物抗宿主病。移植后观察血像、骨髓像、行染色体分析及HLA位点鉴定。移植后分别于 3,6和 12个月及 2年追踪鉴定植入状态。结果发现 ,15例患者全部移植物植入 ,移植后中性粒细胞 >0 .5× 10 9/L和血小板 >2 0× 10 9/L的时间分别为 18(13- 2 3)天及 2 2 (16- 32 )天。骨髓像显示各系造血均恢复。 7例应用染色体检查 ,8例应用HLA位点 ,4例应用血型 ,1例应用DNA指纹检测 ,植入鉴定结果除 1例复发患者于移植后 2个月骨髓复发植入鉴定为供、受者嵌合外 ,其他患者均呈持续全部稳定植入。移植后发生I度急性GVHD 8例 ,II-IV度GVHD 5例 ,可评价的慢性GVHD共 8例。结论 :供者应用G CSF后采髓 ,加大预处理剂量 ,联合应用作用机理不同的多种免疫抑制剂进行HLA单倍体的骨髓移植 ,可跨越人类HLA多样性屏障。     

适合移植后嵌合物定量分析的信息STR位点谱的建立及其应用

本研究选取8个STR位点作为嵌合物定量分析的信息STR位点谱,评估其作为异基因造血干细胞移植（HSCT）后移植物嵌合状态的定量监控指标的作用。采集15对移植供受者血样,提取DNA,分别合成标记D3S3045、D4S2366、D4S2639、D5S818、D13S317、D18S1002、D20S481、D22S689的引物,建立PCR扩增体系,在ABI3100仪上检测这些位点的扩增片段．筛选得到理想的信息位点;制备梯度供者／受者DNA混合品和移植后不同日期采集的标本,进行信息位点的检测;获取峰高或峰面积进行移植嵌舍率的计算。结果显示,根据梯度混合DNA的结果获得标准曲线,计算得到的嵌合率和配制浓度中的嵌合比例基本一致;用峰高和峰面积同时计算,两者基本一致;成功获得了15例移植后病人的嵌舍状态变化数据,并帮助诊断了1例复发病人。结论：本研究建立的信息STR位点谱及检测方法,可以较准确地定量监控嵌合状态,成功用于临床干细胞移植工作,与商品化试剂相比,更便宜,在使用上更灵活。