酵母双杂交系统筛选和验证与RARα-V相互作用的蛋白

目的 利用酵母双杂交技术筛选与RARα-V相互作用的蛋白,研究RARα-V的作用靶点及其生物学功能.方法 构建诱饵质粒pGBKT7-RARα-V,利用酵母双杂交技术从K562细胞cDNA文库中筛选与RARα-V相互作用蛋白的基因序列,并通过酵母回转试验与GST pull-down技术进行验证.结果 成功构建诱饵质粒,且没有毒性、渗漏和自激活现象;利用酵母双杂交技术筛选到16个能与RARα-V相互作用的蛋白质;经酵母回转试验得到8个阳性克隆;并经GST pull-down技术在体外验证了RARα-V与JTV-1蛋白的相互作用.结论 在细胞内RARα-V与多种蛋白有相互作用,白血病的发病机制可能与这些蛋白相互作用所致的生物学功能改变有关.     

酵母双杂交系统的应用研究进展

酵母双杂交系统的应用范围已扩展到蛋白质与蛋白质、蛋白质与DNA、蛋白质与RNA以及蛋白与其它小分子间相互作用的研究。基于传统酵母双杂交系统的衍生体系包括 :单杂交、三杂交和逆向双杂交等。本文拟对酵母双杂交系统的原理、应用发展以及存在的不足作一简要介绍     

酵母双杂交系统的应用研究进展

酵母双杂交系统的应用范围巳扩展到蛋白质与蛋白质、蛋白质与DNA、蛋白质与RNA以及蛋白与其它小分子间相互作用的研究。基于传统酵母双杂交系统的衍生体系包括：单杂交、三杂交和逆向双杂交等。本文拟对酵母双杂交系统的原理、应用发展以及存在的不足作一简要介绍。     

大鼠糖皮质激素受体结构域酵母双杂交系统的构建

目的构建大鼠糖皮质激素受体(GR)各个结构域的酵母双杂交系统,以研究不同结构域在糖皮质激素非基因组效应的作用。方法采用RT-PCR方法扩增GR各个结构域基因片段,酶切回收,将其连接至酵母双杂交系统诱饵蛋白质粒载体pGADT7,构建重组质粒pGADT7-GRAB,pGADT7-GRCD,pGADT7-GRC,pGADT7-GRD,pGADT7-GREF,并经鉴定,测序,体外转录,翻译等方法验证。结果RT-PCR扩增的各GR结构域基因片段电泳后,大小正确,酶切回收后,与质粒pGADT7过夜连接,转化大肠杆菌DH5α,挑选重组质粒,测序结果与Genebank中GR序列比对完全正确。重组质粒经体外转录、翻译试验方法证实重组质粒中的GR基因片段能够正确合成各个GR结构域蛋白。结论构建大鼠糖皮质激素受体结构域酵母双杂交系统重组质粒,为研究糖皮质激素受体在非基因组效应中的作用奠定了基础。     

人肝再生增强因子的酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活作用检测

目的 构建肝再生增强因子的酵母双杂交诱饵质粒，为进一步研究其相互作用蛋白奠定基础。方法 将人肝再生增强因子的编码序列重组入pGBKT载体中，经酶切及序列分析鉴定构建正确后，转化酵母AHl09菌株，转化子在SD／-His／-Trp选择培养基上培养；滤纸法β-半乳糖苷酶活性测定；Westem blot检测目的蛋白表达情况。结果 正确地构建了人肝再生增强因子的酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7-hALR，其酵母AHl09转化菌在SD／-Trp培养基上30℃培养65h，长出φlmm菌落，而在SD／-Trp-His培养基上不生长，β-半乳糖苷酶活性检测呈阴性。Westem blot结果显示目的蛋白以35KD的融合蛋白形式表达。结论 诱饵质粒pGBKT7-hALR对宿主菌AHl09没有毒性作用，能稳定表达目的蛋白，不能自身激活报告基因，可用于酵母双杂交的筛选工作。     

酵母双杂交系统及其应用研究进展

酵母双杂交系统(yeast two hybrid system)是Stanley Fields等提出并建立的一种直接于细胞内检测蛋白一蛋白之间相互作用的遗传学方法，其最突出的特点是能够在酵母这种繁殖迅速、遗传背景清楚且操作简便的体系中研究真核细胞的蛋白质之间的相互作用，并通过cDNA文库的筛选可以直接找到与未知蛋白质相互作用的DNA序列。酵母双杂交系统作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，广泛地应用于真核基因的表达与调控、细胞粘合因子间的相互作用、信号传导通路以及细胞周期与分化、反式因子的鉴定与分离等诸多领域的基础研究。随着这个方法的广泛应用，在原有酵母双杂交体系上发展了大量的衍生系统：单杂交系统、逆向双杂交系统、三杂交系统。本文就酵母双杂交系统的原理和组成及应用等方面作一综述。     

酵母双杂交系统在研究蛋白激酶CK2中的应用

酵母双杂交系统是研究蛋白质间相互作用的一种有效方法，蛋白激酶CK2是一种真核细胞中普遍存在的信使非依赖性丝／苏氮酸蛋白激酶，在细胞增殖和分化、信号的传导和加工等方面起重要作用。本文筒述了酵母双杂交系统在研究蛋白激酶CK2中的应用。     

利用酵母双杂交研究与Ca~(2 )CRAC通道Orail相互作用蛋白

目的:利用酵母双杂交等技术研究与CRAC通道蛋白Orail发生相互作用的蛋白质,从而揭示CRAC通道分子作用机制。方法:以Orail-C端为诱饵蛋白筛选大鼠海马和皮质cDNA文库,寻找能与之相互作用的蛋白质,运用营养缺陷型培养,X-β-Gal蓝斑筛选等实验去除假阳性克隆,并通过GST-Pulldown体外实验验证其相互作用。结果:以Orai1-C端为诱饵最终筛出了几个阳性克隆,经测序分析,发现了其中一个感兴趣的蛋白。结论:Orail可以和该蛋白发生相互作用,其相互作用可能与CRAC通道功能调节有关。     

金黄色葡萄球菌N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸2-异构酶基因的克隆与表达

目的对金黄色葡萄球菌N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸2-异构酶基因(APE)进行克隆、鉴定与表达,为新型抗菌药物的设计提供参考依据。方法采用聚合酶链反应(PCR)扩增APE基因,将扩增产物酶切后与原核表达载体pET-32a(+)连接,构建表达APE的重组质粒,将重组质粒先转化大肠杆菌TG1内并提取质粒,经PCR、双酶切鉴定后再转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),对转化菌株进行诱导后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果构建了表达载体pET-32a(+)-APE,在37℃经异丙基-β-D硫代半乳糖苷诱导时获得表达,表达的蛋白质相对分子质量为45.2×10~3。结论 APE基因成功克隆到表达质粒内并获得了表达。     

利用酵母双杂交研究与Ca2+CRAC通道Orai1相互作用蛋白

目的:利用酵母双杂交等技术研究与CRAC通道蛋白Orai1发生相互作用的蛋白质,从而揭示CRAC通道分子作用机制.方法 :以Orai1-C端为诱饵蛋白筛选大鼠海马和皮质cDNA文库,寻找能与之相互作用的蛋白质, 运用营养缺陷型培养,X-β-Gal蓝斑筛选等实验去除假阳性克隆,并通过GST-Pulldown体外实验验证其相互作用.结果:以Orai1-C端为诱饵最终筛出了几个阳性克隆,经测序分析, 发现了其中一个感兴趣的蛋白.结论:Orai1可以和该蛋白发生相互作用,其相互作用可能与CRAC通道功能调节有关.