豚鼠耳蜗单离外毛细胞外向钾电流的特性

目的：探讨豚鼠耳蜗单离外毛细胞（ＯＨＣ）钾电流（Ｉｋ）的正常值及其特性。方法：应用膜片钳全细胞记录技术及多种辅助方法,测试在不同细胞内、外液和电压刺激条件下的Ｉｋ、钾尾电流（Ｉｋｔａｉｌ）和反转电位。结果：Ｉｋ具有明显的电压依赖性和时间依赖性,在２０ｍｓ内达峰值,平均激活电压约为－３２．７ｍＶ,从激活电压至０电压时Ｉｋ增长最快,在４０ｍＶ时接近饱和。正常条件下Ｉｋ无明显“ｒｕｎ－ｄｏｗｎ现象”。细     

豚鼠耳蜗外毛细胞的钾通道

目的研究外毛细胞钾离子通道的生物物理学和药理学特性.方法用细胞贴附式和内面向外式膜片钳技术,研究豚鼠耳蜗单离外毛细胞底侧膜的钾离子单通道电流.结果记录到两种钾离子单通道电流:(1)大电导型钙激活钾通道,在等渗140mmol/L KC1溶液时电导为161 26pS(内面向外式)或155±27pS(细胞贴附式),反转电位为0mV;浴液为Hanks液而电极内液为140mmo/L KC1液时,电导为133±9pS(细胞贴附式).当膜内面浴于无钙液时通道活动消失.通道呈簇状发放或快速簇状发放方式,其开启和关闭时程直方图均可用三阶指数方程拟合.双氢链霉素能够可逆性地抑制外毛细胞的大电导型钙激活钾通道,表现为电流幅度减少,在链霉素浓度增大以及细胞膜电位偏正时更明显,新霉素的抑制作用更强.(2)～44pS钾通道.结论豚鼠耳蜗外毛细胞底侧膜具有两种钾离子通道,研究了其大电导型钙激活钾通道的生物物理学和药理学特性.     

利诺吡啶对豚鼠耳蜗外毛细胞和支持细胞钾电流的影响

目的　观察KCNQ家族钾通道特异性阻滞剂利诺吡啶 (linopirdine)对豚鼠耳蜗单离外毛细胞和Deiters细胞 (支持细胞 )总钾电流的影响 ,初步探讨KCNQ家族钾通道在耳蜗外毛细胞和Deiters细胞的分布。方法　运用膜片钳技术 ,在全细胞模式下记录正常细胞外液中 8个外毛细胞和5个Deiters细胞的总钾电流 ,并观察 10 0 μmol/L利诺吡啶对外毛细胞和Deiters细胞总钾电流的影响。结果　在正常细胞外液中 ,单离外毛细胞可记录到四乙基二乙胺敏感的外向性钾电流和静息膜电位附近激活的内向性钾电流 (theK+ currentactivatedatnegativepotential,IKn)两种钾电流 ,而单离Deiters细胞中只记录到外向整流性钾电流。加入 10 0 μmol/L利诺吡啶后 ,外毛细胞中的四乙基二乙胺敏感的钾电流减小 ,IKn被完全抑制 ;而Deiters细胞中的外向整流性钾电流大小无变化。结论KCNQ家族钾通道存在于豚鼠耳蜗外毛细胞 ,其介导的钾电流是四乙基二乙胺敏感的钾电流的组成部分 ,并构成全部的IKn;但KCNQ家族钾通道不存在于豚鼠耳蜗Deiters细胞。     

豚鼠耳蜗单离外毛细胞游离钙的胆碱能调控

目的　观察胆碱能兴奋剂和拮抗剂对豚鼠耳蜗单离外毛细胞 (OHC)内游离钙浓度 ([Ca2 + ]i)的影响 ,探讨OHC内 [Ca2 + ]i的胆碱能调控机制。方法　健康豚鼠 15只处死 ,Hanks液中分离活性单离OHC ,Fluo - 3/AM负载 30min。分 7组进行不同干预 ,包括乙酰胆碱 (ACH ,胆碱能M和N受体兴奋剂 )、毒蕈碱 (M受体兴奋剂 )、阿托品 (M受体拮抗剂 )、庆大霉素 (N受体拮抗剂 )、加Hanks液对照组和不加干预对照组 ;另 1组为dHanks液中加ACh。用激光扫描共聚焦显微镜 (Bio-Rad ,英国 )观察OHC内 [Ca2 + ]i的变化。结果　Hanks液中不加干预试剂、加毒蕈碱、加Hanks液对照和无钙dHanks液中加ACh等 4组 ,[Ca2 + ]i在 2 5～ 30min内升幅 <1.10倍。Hanks液中加ACh组 [Ca2 + ]i最高升幅平均为 3.0 9倍 ;阿托品 +ACh组 [Ca2 + ]i为 2 .92倍 ;庆大霉素 +ACh组[Ca2 + ]i为 1.81倍。结论　豚鼠耳蜗传出神经递质ACh通过兴奋N受体 ,开放OHC的细胞膜钙离子通道 ,使细胞外Ca2 + 内流外毛细胞内 ;[Ca2 + ]i增加需要细胞外液中钙离子存在。     

豚鼠耳蜗单离外毛细胞的外向整流钾电流

目的 :观察豚鼠耳蜗单离外毛细胞 (OHC)的电生理特性 ,记录不同长度OHC的外向整流钾电流 ,分析区分外向整流钾电流所包含的通道电流成分 ,研究外向整流钾电流的动力学特征。方法 :采用酶消化法及机械分离OHC。运用全细胞膜片钳技术 ,在电压钳下记录K+ 通道电流。结果 :OHC的全细胞膜电容为 (30 .96±2 .79) pF(n =2 9) ,零电流电位 (30± 2 .1)mV(n =16 ) ,反转电位为 (- 5 1.6 7± 1.84 )mV(n =9)。不同长度OHC的外向整流钾电流存在系统差异 ,短OHC表现出大的钾电导 ,长OHC则相反。 10 0 μmol/L的氯化镉 (Cd Cl2 )抑制了OHC外向整流钾电流的最大电流幅度的 6 0 % ,且改变了电流的动力学特征 ,对峰电流的影响明显大于稳态电流 (P<0 .0 1,n =5 ) ;1mmol/L的四氨基吡啶 (4 AP)抑制了最大电流幅度的 4 3% ,没有改变电流的动力学特征。外向整流钾电流的激活符合Boltzmann方程 ,V1/ 2 =(- 11.0 7± 0 .2 6 )mV ,S =(6 .6 2± 1.74 )mV(n=13)。结论 :外向整流钾电流包含有钙离子激活的钾离子电流、外向延迟整流钾电流和A型电流     

尼莫地平对豚鼠耳蜗外毛细胞钙电流的影响

为研究尼莫地平对豚鼠耳蜗外毛细胞钙电流的影响，应用全细胞式记录膜片钳技术，观察１８只豚鼠耳蜗分离出的２０个外毛细胞中，用全细胞方式记录到通道电流２０次。结果发现，尼莫地平可部分阻断豚鼠耳蜗外毛细胞电压依赖性钙电流，减轻毛细胞内Ｃａ＾２＋负荷，其阻断作用是可逆的，对电流的抑制率与尼莫地平的浓度有关，其半数抑制浓度为６０．１４ｎｍｏｌ／Ｌ，对电流的最大抑制率为３４．１６％。推测尼莫地平在治疗梅尼埃病等     

利诺吡啶对豚鼠耳蜗外毛细胞和支持细胞钾电流的影响

目的 观察KCNQ家族钾通道特异性阻滞剂利诺吡啶(linopirdine)对豚鼠耳蜗单离外毛细胞和Deiters细胞(支持细胞)总钾电流的影响，初步探讨KCNQ家族钾通道在耳蜗外毛细胞和Deiters细胞的分布。方法 运用膜片钳技术，在全细胞模式下记录正常细胞外液中8个外毛细胞和5个Deiters细胞的总钾电流，并观察100μmol／L利诺吡啶对外毛细胞和Deiters细胞总钾电流的影响。结果 在正常细胞外液中，单离外毛细胞可记录到四乙基二乙胺敏感的外向性钾电流和静息膜电位附近激活的内向性钾电流(the K^ current activated at negative potential，IKn)两种钾电流，而单离Deiters细胞中只记录到外向整流性钾电流。加入100μmol／L利诺吡啶后，外毛细胞中的四乙基二乙胺敏感的钾电流减小，IKn被完全抑制；而Deiters细胞中的外向整流性钾电流大小无变化。结论 KCNQ家族钾通道存在于豚鼠耳蜗外毛细胞，其介导的钾电流是四乙基二乙胺敏感的钾电流的组成部分，并构成全部的IKn；但KCNQ家族钾通道不存在于豚鼠耳蜗Deiters细胞。     

豚鼠耳蜗外毛细胞的简化分离

目的:为获得能够满足电生理需要的外毛细胞,探讨简单可靠的分离外毛细胞的方法。方法:暴露听泡后去除耳蜗骨壳,将螺旋韧带连同基底膜和蜗轴一起放入酶液消化,减少显微镜下分离基底膜的操作程序,同时避免去除螺旋韧带时部分基底膜片段的丢失。结果:获得较多的保持良好活性的单离外毛细胞,耳大约80%的细胞能保持活性平均约6h。结论:去除骨壳后的残余耳蜗整体消化并适当提高消化液浓度的分离法,操作简单,可以获得能够满足电生理实验需要的较多的单离的耳蜗外毛细胞,有利于内耳研究工作的开展。     

一氧化氮对豚鼠耳蜗外毛细胞L-型钙通道电流影响的实验研究

目的观察一氧化氮(NO)供体L-精氨酸(L-Arg)对豚鼠耳蜗外毛细胞L型钙通道电流(ICa-L)的影响。方法以40只杂色或白色豚鼠为研究对象,采用急性酶分离方法分离豚鼠耳蜗外毛细胞,根据溶液中加入的L-Arg浓度分为0.5×10-6 mol/L组(A组)、1.0×10-6 mol/L组(B组)、1.5×10-6 mol/L组(C组),采用全细胞膜片钳技术分别记录不同浓度L-Arg组外毛细胞L-型钙通道电流。结果低浓度的NO供体L-Arg可以抑制ICa-L,此作用具有电压依赖性,对反转电位无明显影响。在指令电压0mV时,峰值电流密度增幅最大值A组为-2.12%,用药前后差异无统计学意义(P>0.05);B组增幅为-30.69%,用药前后差异有统计学意义(P<0.01);C组增幅为-65.08%,用药前后差异有统计学意义(P<0.01)。结论低浓度的NO可以抑制ICa-L。     

豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞乙酰胆碱敏感性钾电流的钙离子依赖性

目的研究豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)敏感性钾电流对钙离子的依赖性。方法应用全细胞膜片钳技术研究新鲜单离的豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞ACh-敏感性钾电流在细胞内外钙离子浓度改变时其电流幅值的变化。结果①细胞外ACh激活一缓慢持久的外向性钾电流,其反转电位为(-70±10)mV;②ACh-敏感性钾电流电流对细胞外四乙胺(10mmol/L)敏感,而对细胞外4-氨基吡啶(100μmol/L)不敏感;③ACh-敏感性钾电流的幅值大小依赖于细胞外的钙离子浓度,无钙外液中ACh激活一很小的电流,4mmol/L外钙溶液中ACh-敏感性钾电流的幅值达到最大值,而0·5mmol/L外钙溶液中ACh-敏感性钾电流的幅值抑制至(36·5±6·5)%;④细胞内三磷酸肌醇-钙离子释放过程不参与ACh-敏感性钾电流的激活,细胞内透析肝素8mg/ml后30min,ACh-敏感性钾电流的幅值没有明显改变;⑤ACh敏感性钾电流对钙通道阻断剂Cd2+敏感。结论豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞ACh-敏感性钾电流的激活依赖于细胞外的钙离子浓度,ACh与豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞胆碱能受体结合后,首先激活膜上钙通道引起细胞外钙离子内流,毛细胞内游离钙离子浓度的升高进一步激活钙依赖性钾电流。     

豚鼠耳蜗各回外毛细胞L型钙通道的分布

目的探讨耳蜗2～4回外毛细胞(outer hair cell,OHC)L型钙通道分布密度.方法豚鼠耳蜗外毛细胞L型钙通道经DM-BODIPY DHP和RH414标记后用激光扫描共聚焦显微镜观察,以DM-BODIPY DHP / RH414荧光比值大小指示L型钙通道密度的高低.结果①应用硝苯地平阻断后,质膜的DM-BODIPY DHP荧光染色明显减弱,表明其钙通道为特异性L型钙通道;②L型钙通道密度从低频区(第4回)向高频区(第2回)有逐渐增加的趋势,方差分析示第4回和第2回OHC之间L型钙通道的分布差异有显著性意义;③OHC质膜不同区域L型钙通道分布差异无显著性意义.结论耳蜗2～4回OHC之间L型钙通道分布的差异可能是耳蜗音位分布图的分子机制之一.     

三种神经活性物质对离体豚鼠耳蜗外毛细胞内游离钙浓度的影响

目的研究神经活性物质对耳蜗外毛细胞内游离钙离子浓度（［Ｃａ２＋］ｉ）的影响。方法应用显微荧光测钙技术检测豚鼠耳蜗离体外毛细胞［Ｃａ２＋］ｉ在加入乙酰胆碱、ＡＴＰ、碳酰胆碱之后的变化。结果在含钙的细胞外液中，乙酰胆碱、ＡＴＰ和碳酰胆碱均可引起［Ｃａ２＋］ｉ升高，幅度分别为（０．７４±０．１２９）μｍｏｌ／Ｌ（乙酰胆碱），（０．６５±０．１１）μｍｏｌ／Ｌ（ＡＴＰ），（１．１６±０．２７）μｍｏｌ／Ｌ（碳酰胆碱）；而细胞外液中无钙时，ＡＴＰ仅可引起缓慢而小幅度（０．１８±０．０５）μｍｏｌ／Ｌ的［Ｃａ２＋］ｉ升高。结论同属胆碱能毒蕈碱受体激动剂的乙酰胆碱和碳酰胆碱可作用于受体，打开离子通道，使细胞外Ｃａ２＋进入细胞内，导致外毛细胞［Ｃａ２＋］ｉ升高；细胞外液有Ｃａ２＋时，ＡＴＰ引致的［Ｃａ２＋］ｉ升高，可能是因为引发了内向的Ｃａ２＋流，细胞外液无Ｃａ２＋时，［Ｃａ２＋］ｉ升高则可能源于细胞内钙库的释放。     

水杨酸钠对豚鼠单离外毛细胞外向钾电流和静息电位及膜电容影响

目的　探讨水杨酸钠对豚鼠单离外毛细胞（ｏｕｔｅｒｈａｉｒｃｅｌｌ,ＯＨＣ） 钾电流（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｕｒｒｅｎｔ,ＩＫ）、静息电位（ｒｅｓｔｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ,ＲＰ） 和膜电容（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ,ＭＥＣ） 的影响,分析水杨酸钠影响毛细胞功能的细胞电生理机制。方法　应用膜片钳全细胞记录技术,测试０．１ 和１ ．０ ｍｍｏｌ／Ｌ水杨酸钠用药前后ＯＨＣ的ＩＫ、ＲＰ和ＭＥＣ 变化。结果　水杨酸钠对ＩＫ 的影响具有时效和量效关系,即用药后有ＩＫ 先增加后降低的双相作用,而高浓度水杨酸钠无论是对ＩＫ 的增加作用还是降低作用都比低浓度时明显。ＲＰ平均约为－６０ ｍＶ,ＭＥＣ 平均约为３９ ｐＦ。水杨酸钠有降低ＲＰ和ＭＥＣ的作用,且均存在着量效关系,即高浓度时的作用大于低浓度时。水杨酸钠对ＲＰ和ＭＥＣ影响的时效关系不明显。结论　水杨酸钠具有影响ＯＨＣ两侧膜的Ｋ＋ 电导和细胞内外Ｋ＋ 分布的作用,并通过对ＩＫ、ＲＰ和ＭＥＣ的影响改变ＯＨＣ的兴奋性和机械活动特性,可能是水杨酸影响毛细胞功能的耳蜗机制之一。     

Tip-link organization in anomalously-oriented hair cells of the guinea pig cochlea

Stereocilia are described in a group of guinea pigs with abnormal conformation of the outer hair cell stereociliary bundles. Rows of Stereocilia were found which were circular instead of V- or W-shaped, and rotated or even reversed in orientation with respect to normal. The Stereocilia have however a normal gradation in heights of the rows of Stereocilia, and have tip links running in the direction of gradation in height.     

Comparative ultrastructure of subsurface cisternae in inner and outer hair cells of the guinea pig cochlea

Summary The subsurface cisternal systems of outer hair cells (OHCs) from different cochlear regions have been compared with the subsurface cisternal system of inner hair cells. Three main observations have been made: (1) the number of cisternal layers, when there is more than one present, is reduced along the length of an individual outer hair cell; (2) basal outer hair cells may have only one fenestrated cisternal layer; and (3) the inner hair cells possess a lateral cistern and associated pillar and filament complexes which are very similar to those of some basal OHCs. These observations are discussed in relation to hypotheses regarding the role of these structures in hair cell motility.Presented at the 25th Workshop on Inner Ear Biology in London, England, 4–7 September 1988     

Acetylcholine-induced calcium oscillation in isolated outer hair cells in guinea pig

Objective This study is to explore the relationship between acetylcholine(ACh)-induced calcium release from intracellular Ca2 stores and function of outer hair cell(OHC) motors, in an attempt to elucidate the mechanism of OHC electromotility at resting state. Methods OHCs were isolated from adult guinea pig (200-300 g) cochlea and loaded with Fluo-3/AM. The cells were treated with ACh/dHBSS, ACh/HBSS, dHBSS only or HBSS only. Intracellular [Ca2 ]i variations in cells under the four treatments were observed using an Ar-Kr laser scan confocal microscope. Results [Ca2 ]i oscillations were recorded in five OHCs treated with ACh/dHBSS but not in other cells. This is the first time that Ach-excited [Ca2 ]i oscillations are reported in guinea pig OHCs independent of extracellular calcium. Conclusions ACh-excited [Ca2 ]i oscillations in OHCs originates from intracellular calcium release and may play a crucial role in maintaining active mechanical motility of the OHC at resting and modulating OHC electromotility.     

豚鼠耳蜗螺旋器细胞微管蛋白的表达

目的研究正常生理状态下微管蛋白(tubulin)的结构特征和分布规律。方法采用免疫荧光标记技术,借助激光扫描共聚焦显微镜,逐层观察耳蜗毛细胞中微管蛋白的分布特点。结果豚鼠耳蜗内毛细胞、外毛细胞和支持细胞内都有微管蛋白的特异性染色,支持细胞内微管蛋白的分布自基底转到顶转逐渐减弱(纵向梯度),豚鼠耳蜗感觉细胞的微管蛋白表达则无此特征,外毛细胞静纤毛中微管蛋白着色明亮,三排"V"形清晰可见,这与以往结果不同。结论豚鼠耳蜗外毛细胞中微管蛋白的结构和分布无差异,支持细胞内的分布存在差异。表明局部结构的梯度决定局部功能的差异。