金黄色葡萄球菌肠毒素A基因克隆及表达

目的 对金黄色葡萄球菌肠毒素A基因（SEA）进行克隆、鉴定与表达，为制备单抗、诊断试剂及进一步深入研究SEA的功能奠定基础。方法 用聚合酶链反应（PCR）扩增SEA基因，将扩增的产物连接于测序载体pMD18-T上，经测序反应确定无误，酶切后将SEA基因与原核表达载体pET42b（＋）构建表达SEA的重组质粒。将重组质粒先转化入大肠杆菌DH5a内并提取质粒，经双酶切鉴定后，再转化入表达宿主大肠杆菌B121菌株内，对转化菌株进行诱导后，破菌，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。结果 构建了表达载体pET42b（＋）-SEA，并获得高效表达，表达的蛋白质相对分子质量为27000，重组蛋白（rSEA）在37℃、25％经异丙基硫化-β-D半乳糖苷（IPTG）诱导时均以包涵体形式存在。结论 SEA基因成功克隆到表达质粒内并表达，为制备单抗、诊断试剂及其致病机制研究奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸2-异构酶基因的克隆与表达

目的对金黄色葡萄球菌N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸2-异构酶基因(APE)进行克隆、鉴定与表达,为新型抗菌药物的设计提供参考依据。方法采用聚合酶链反应(PCR)扩增APE基因,将扩增产物酶切后与原核表达载体pET-32a(+)连接,构建表达APE的重组质粒,将重组质粒先转化大肠杆菌TG1内并提取质粒,经PCR、双酶切鉴定后再转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),对转化菌株进行诱导后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果构建了表达载体pET-32a(+)-APE,在37℃经异丙基-β-D硫代半乳糖苷诱导时获得表达,表达的蛋白质相对分子质量为45.2×10~3。结论 APE基因成功克隆到表达质粒内并获得了表达。     

结核分枝杆菌MPT64基因克隆与表达质粒构建

[目的] 克隆并构建编码结核分枝杆菌MPT64分泌蛋白的重组表达质粒。[方法] 采用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出MPT64基因(687bp)，并克隆到T载体，然后用双内切酶消化后，与同样酶消化的pGEX-4T-2连接，转化大肠杆菌E．coil DH5α，阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。[结果] 酶切鉴定所切下的片段大小与预计相符，测序结果与文献报道一致，证实符合表达框架。[结论] 成功地克隆并构建了MPT64基因的重组表达质粒pGEX-MPT64。     

副溶血弧菌TDH基因的克隆与表达

目的对副溶血弧菌TDH基因进行克隆、鉴定与表达，为制备单抗、诊断试剂及进一步深入研究TDH的功能奠定基础。方法用聚合酶链反应(PCR)扩增TDH基因将扩增的产物连接于测序载体pGEM-T上，经测序反应确定无误后，再将PCR产物与原核表达载体pQE100构建表达TDH的重组质粒，将重组质粒先转化人大肠杆菌DH5a内并提取质粒，经双酶切鉴定后，再转化入表达宿主大肠杆菌BL21菌株内，对转化菌株进行诱导后，破菌，进行SDS-PAGE电泳。结果电泳发现转化了重组质粒的菌株有表达蛋白，其表达的蛋白质相对分子质量为24000。结论TDH基因成功克隆到表达质粒内并表达，为制备单抗、诊断试剂与其致病机制研究奠定了基础。     

人血浆蛋白S成熟肽基因在大肠杆菌中的融合表达

目的 构建人血浆蛋白S的原核表达载体并诱导其表达。方法 自行设计引物，采用PCR法，以现有人血浆蛋白S真核表达载体为模板，扩增人血浆蛋白S成熟肽的编码序列。PCR产物经EcoRI和BamHI双酶切后，克隆至GST融合表达载体pGEX-2T中，在E．coli BL21中诱导GST-人血浆蛋白S融合蛋白的表达。结果 对重组质粒的序列分析表明，插入片段的序列与Gen Bank登录的人血浆蛋白S基因编码序列完全一致。10％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳显示，在IPTG的诱导下，BL21重组菌高效表达分子量约为96kD的产物．并可通过GST亲和层析柱纯化。结论 人血浆蛋白S编码序列已被克隆至GST融合表达载体pGEX-2T，并在E．coli BL21中获得表达。     

人骨形成蛋白2真核表达载体的构建和体外表达

背景：骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein2，BMP-2）是已知的所有生长因子中对骨的形成作用最强的生长因子，被认为是最具有前途的骨诱导物质。目的：构建人骨形成蛋白2真核表达载体并观察其体外表达情况。设计、时间及地点：自身对照实验，于2005-07／2006-05在华中科技大学同济医学院分子生物中心实验室完成。材料：pcDNA3．1（＋）载体由华中科技大学同济医学院左石博士惠赠；成骨肉瘤组织由华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科提供。方法：从人成骨肉瘤细胞中提取细胞总RNA，利用反转录．聚合酶链反应方法扩增获得人BMP-2基因cDNA，将基因片断重组到pGEM-T质粒中构建pGEM．T-hBMP-2重组质粒载体，转化到大肠杆菌DH5n后筛选阳性克隆，利用限制性酶切和DNA序列分析鉴定重组质粒。分别用RcoRI和NotI双酶切pGEM-T-hBMP-2质粒和pcDNA3．1真核表达载体，将克隆载体中人骨形成蛋白2基因重组到pcDNA3．1真核表达载体，提取质粒作酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序后，用脂质体体外转染小鼠骨髓基质细胞，反转录-聚合酶链反应检测BMP．2的表达。主要观察指标：①人骨肉瘤细胞总RNA反转录-聚合酶链反应结果。②重组质粒pGEM．T-hBMP-2和pcDNA3．1-hBMP-2的构建和酶切鉴定。③BMP-2在小鼠骨髓基质细胞内的表达。结果：人骨肉瘤细胞总RNA经反转录-聚合酶链反应扩增后，获得1．2kb条带。经酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序证实实验成功克隆BMP-2基因，重组质粒pcDNA3．1-hBMP-2构建正确；该重组质粒能在体外培养的小鼠骨髓基质细胞中有效表达BMP-2。 结论：实验成功克隆人骨形成蛋白2基因并构建了此基因的真核表达载体。     

金黄色葡萄球菌肠毒素A基因克隆及表达

目的对金黄色葡萄球菌肠毒素A基因(SEA)进行克隆、鉴定与表达,为制备单抗、诊断试剂及进一步深入研究SEA的功能奠定基础。方法用聚合酶链反应(PCR)扩增SEA基因,将扩增的产物连接于测序载体pMD18-T上,经测序反应确定无误,酶切后将SEA基因与原核表达载体pET42b( )构建表达SEA的重组质粒,将重组质粒先转化入大肠杆菌DH5α内并提取质粒,经双酶切鉴定后,再转化入表达宿主大肠杆菌BL21菌株内,对转化菌株进行诱导后,破菌,进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。结果构建了表达载体pET42b( )-SEA,并获得高效表达,表达的蛋白质相对分子质量为27 000,重组蛋白(rSEA)在37℃、25℃经异丙基硫化-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导时均以包涵体形式存在。结论SEA基因成功克隆到表达质粒内并表达,为制备单抗、诊断试剂及其致病机制研究奠定了基础。     

大鼠神经营养因子4基因克隆及表达载体的构建

目的：克隆大鼠神经营养因子4全长基因，构建真核细胞表达质粒。 方法：实验于2004—06／2005-12在昆明医学院神经病学研究所完成。选用成年SD大鼠，用反转录聚合酶链反应以大鼠海马总RNA为模板，应用基因重组技术将大鼠神经营养因子4的全长基因克隆到真核表达载体pcDAN3中，构建重组表达质粒。用限制性内切酶酶切分析和DNA测序对重组质粒载体pcDNA3-神经营养因子4进行鉴定。 结果：提取的总RNA电泳出现18S和28S两个条带，聚合酶链反应扩增目的基因为720bp的条带，测序结果为720bp。重组质粒的测序结果经比对与GeneBank上报道的序列一致（M86742），说明神经营养因子4基因已成功克隆至pcDNA3载体中。 结论：正确的克隆了大鼠神经营养因子4基因全序列。     

基因重组降钙素原蛋白在大肠杆菌中的克隆表达及纯化

目的构建降钙素原（PCT）基因的原核表达载体，并在大肠杆菌中进行表达，以获取高产量、低成本、高纯度的PCT蛋白。方法按人的全长PCT cDNA序列，设计引物用标准的聚合酶链反应（PCR）法全基因合成步骤合成扣除信号肽外PCT的片段，应用基因重组技术将该片段克隆到质粒pET21a（＋）中，进行限制性内切酶酶切分析和DNA测序鉴定。将重组质粒转化大肠杆菌E．coli（DH5α），经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达后，用镍-氮三乙酸（Ni-NTA）亲和层析纯化获取蛋白，用十二烷基硫酸-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹（Western blot）的方法鉴定。结果扩增出的人PCT片段于原核表达载体中克隆，经酶切和核酸测序鉴定，得到正确的重组质粒pET-PCT，并在大肠杆菌中得以表达。纯化后的蛋白经考马氏亮蓝染色呈单一条带；用抗PCT的抗体进行Western blot分析证明目的蛋白有反应性。结论本研究成功构建了表达基因重组人PCT的原核表达载体，基因重组人PCT蛋白在大肠杆菌中获得了表达和纯化，为进一步获取高纯度、高效价的单克隆抗体和开展临床检测提供了必要的条件。     

人T-bet基因的体外扩增及克隆和鉴定

目的:克隆人T-bet基因,构建其真核表达载体pEGFP-C1-T-bet。方法:实验于2005-07/2006-07在北京大学深圳医院中心实验室完成。①根据Genebank的人T-bet基因的全长cDNA序列,设计合成一对附加BglⅡ和SalⅠ两个限制性内切酶酶切位点的特异性引物。②分离人外周血单个核细胞,提取RNA,用反转录-聚合酶链反应方法将T-bet的编码序列cDNA扩增,装入pMD18-T载体并送去测序。③BglⅡ SalⅠ双酶切质粒pMD18-T-bet,经琼脂糖电泳切胶回收T-bet片段,将T-bet插入载体pEGFP-C1构建成重组真核表达载体pEGFP-C1-T-bet。④用双酶切和聚合酶链反应对插入片段进行分析和验证。结果:①反转录-聚合酶链反应产物经琼脂糖电泳结果显示在预期位置有相对分子质量为1608bp的特异性扩增带。②测序结果证实,T-bet的编码序列和Genbank中T-bet mRNA序列相同。③双酶切和聚合酶链反应结果证实插入片段序列正确。结论:实验成功扩增出人T-bet基因,构建了基因重组真核表达载体pEGFP-C1-T-bet,为探索T-bet基因对免疫细胞的调节作用和肿瘤基因治疗奠定了基础。     

乳腺珠蛋白基因在大肠杆菌中的诱导表达及纯化研究

目的 克隆乳腺珠蛋白（human mammaglobin,hMAM）编码全长cDNA,原核表达并纯化蛋白产物,为后期研制乳腺癌早期诊断试剂盒奠定基础,从而为早期发现乳腺癌提供科学的监测方法。方法 自乳腺癌组织提取总RNA,通过RT-PCR克隆hMAMcDNA,构建pQFA0-hMAM表达质粒,在大肠杆菌M15中表达,利用镍-亚硝胺乙酸组氨酸（Ni-NTA-His）亲和层析法对重组蛋白进行纯化。结果 表达的融合蛋白以不溶性包涵体形式存在,纯化后得到纯度为97％的目的蛋白。结论 成功地纯化出hMAM重组蛋白。     

人核心蛋白聚糖基因靶向肺癌细胞特异性表达载体的构建及其表达

目的构建调控人核心蛋白聚糖基因特异性在肺癌细胞A549内表达的基因表达载体,为进一步应用该基因进行肺癌靶向治疗的研究奠定实验基础。方法应用PCR技术从人外周血基因组中扩增肺癌细胞特异性表达的人分泌型白细胞蛋白酶抑制剂的启动子,利用基因重组技术将该启动子插入真核细胞表达载体pcDNA3.1（＋）,替换该载体的CMV启动子与增强子序列,从而构建成由人分泌型白细胞蛋白酶抑制剂基因的启动子启动基因表达的基因表达载体。将人核心蛋白聚糖基因通过基因重组技术插入到上述载体人分泌型白细胞蛋白酶抑制剂基因启动子的下游。PCR产物通过测序鉴定核苷酸序列。重组载体通过限制性酶切进行鉴定。结果 PCR扩增的人分泌型白细胞蛋白酶抑制剂的启动子片段长度为1 250 bp;该启动子经测序获得的核苷酸序列与Genebank上该基因上游5′末端转录调控区的序列完全一致;重组载体的酶切鉴定结果显示（1）该启动子成功插入到pcDNA3.1（＋）载体,并替换CMV启动子与增强子序列,（2）人核心蛋白聚糖基因成功插入该载体。结论成功构建由人分泌型白细胞蛋白酶抑制剂基因启动子调控人核心蛋白聚糖基因表达载体,该载体实现调控人核心蛋白聚糖基因在肺癌细胞内特异性表达。     

肺炎链球菌重组PrtA蛋白克隆与表达的相关研究

目的 构建携带PrtA基因的原核表达载体,诱导表达具有活性的重组PrtA融合蛋白.方法 根据GenBank中肺炎链球菌表面蛋白细胞壁相关丝氨酸蛋白酶A(PrtA)蛋白基因序列,设计合成了一对特异性引物,扩增目的 片段,建立了RT-PCR检测方法.应用RT-RCR方法 扩增得到PrtA蛋白基因,并克隆到pMD18-T载体上,筛选、鉴定阳性重组子pMD18-T-PrtA,然后克隆到原核表达载体pET-30a(+)上,经双酶切、PCR鉴定,获得重组表达质粒pET-30a-PrtA.将含有pET-30a-PrtA的重组菌,经终浓度为0.6 mmol/L的IPTG诱导后,重组PrtA蛋白获得高效表达.通过Western blot检测结果,检测表达的重组PrtA蛋白的反应原性.结果 所获PrtA基因与GenBank的基因序列同源性为99%;重组质粒经IPTG诱导,不同浓度的IPTG均能诱导重组蛋白表达,且IPTG终浓度为0.6 mmol/L时,目的 蛋白的表达量最高,约占菌体总蛋白的18%.通过抗-His标签单克隆抗体在IPTG诱导6 h的重组菌蛋白中检测到一条大小约为40×103的特异性清晰条带,与预期结果 相符,表明表达的蛋白为肺炎链球菌重组PrtA蛋白.结论 成功地克隆和表达了肺炎链球菌表面蛋白细胞壁PrtA,为进一步研究以PrtA蛋白作为免疫原预防和治疗由肺炎链球菌引起的疾病奠定基础.     

人线粒体肌酸激酶广泛型亚型在大肠埃希菌中的表达及抗体制备

目的　获得人线粒体肌酸激酶广泛型亚型 (uMtCK)的全长基因 ,在大肠埃希菌中表达 ,研制抗uMtCK多克隆抗体。方法　采用逆转录PCR从培养的肿瘤细胞 (Hela细胞 )中成功扩增出 10 6 2bp的uMtCK的基因片段 ,插入到质粒pMD18 T中 ,经酶切和测序证实为uMtCK的基因编码序列 ,再插入到质粒pQE30 ,转化大肠埃希菌 ,诱导重组质粒pQE30 uMtCK表达酶融合蛋白。经亲和层析纯化 ,并进行SDS PAGE、westernblot鉴定及酶活性测定。纯化的uMtCK蛋白免疫家兔制备抗uMtCK多抗。结果　RT PCR扩增出的片段经酶切鉴定和测序证实为uMtCK的基因 ;在大肠埃希菌M15中实现了高效、可溶性的融合表达 ,表达量约 17%。重组uMtCK具有CK样催化活性 ,表明原核表达的uMtCK具有类似于天然蛋白质的生物学活性。经免疫印迹分析 ,制备的抗uMtCK多抗适合作uMtCK的进一步分析之用。结论　人uMtCK在大肠埃希菌中实现了高效表达 ,制备了针对uMtCK的抗体。     

SARS病毒S蛋白编码基因表达载体的构建及在Vero细胞中的表达

目的构建含SARS病毒S蛋白编码基因片段的表达载体,并将其置于Vero细胞中表达。方法设计1对PCR引物,在其下游引入Flag序列,通过PCR方法从质粒pGEX-6P-1-SARS-S中扩增出S蛋白编码基因,PCR产物经酶切后,插入表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组表达质粒pcDNA3.1(+)-SARS-S。重组质粒经酶切鉴定及核苷酸序列测定和分析后转染Vero细胞,用抗Flag单克隆抗体通过Western blot检测S蛋白片段在Vero细胞中的表达。结果酶切鉴定及核苷酸序列测定和分析示重组质粒构建完全正确;Western blot证实重组S蛋白片段能够在Vero细胞表达。结论融合Flag序列的SARS病毒S蛋白片段在Vero细胞中获得了正确表达。     

骨肉瘤细胞热休克蛋白70基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的从人的骨肉瘤细胞中钓取热休克蛋白70(HSP70)基因并在大肠杆菌中表达出热休克蛋白,为进行热休克蛋白的功能试验提供抗原。方法热休克人骨肉瘤细胞后,采用One-Step,RT-PCR方法从人骨肉瘤细胞中钓取HSP70基因,DNA测序正确的HSP70基因和表达载体pET28a连接后,构建成功了重组表达质粒pET28a-HSP70,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导蛋白表达后,进行SDS-PAGE及Westernblot鉴定。结果人骨肉瘤细胞HSP70基因的PCR产物约为1.9 kb,DNA序列测定结果证实,所获目的序列与文献报道的基本一致,仅有两个碱基的差异。构建的重组表达质粒pET28a-HSP70,能够在大肠杆菌中表达。结论从人骨肉瘤细胞中成功地钓取了HSP70基因并在大肠杆菌中表达出HSP70蛋白,为研究人骨肉瘤细胞HSP70的结构、功能与临床应用奠定了基础。     

人心肌肌钙蛋白I的原核表达与纯化

目的构建人心肌肌钙蛋白Ⅰ（human cmdiac troponin I,hcTnI）原核表达载体并表达、分离纯化重组蛋白。方法RT-PCR从人心肌组织中克隆出hcTnI的cDNA序列构建到原核表达载体pQE30,获得重组表达质粒pQE30-hcTnI,并在大肠杆菌M15中诱导表达。镍凝胶亲和层析纯化目的蛋白,Western Blot杂交鉴定重组蛋白。结果经测序证实,获得的目的基因与（GeneBankM64247）公布的hcTnI基因序列一致。pQE30-hcTnI在大肠杆菌M15中经WFG诱导后表达出相对分子量约为29kD的目的蛋白,镍柱纯化后经抗hcTnI单克隆抗体进行Western印记,在相对分子量约29kD处可见特异性着色带。结论体外成功诱导了重组hcTnI蛋白表达,通过镍凝胶亲和层析法获得纯度较高的hcTnI蛋白,为进一步获得hcTnI的抗体及建立相应的临床快速检测方法奠定了实验基础。     

人von Willebrand因子A1区基因的克隆和表达

为了深入研究血栓形成的机制以及开发新的抗血栓药物 ,将人vonWillebrand(vWF)因子A1区cDNA在大肠杆菌中表达 ,以获得高效表达的具有生物学活性的重组A1区蛋白 ,应用PCR方法从含有人全长vWFcDNA质粒中扩增A1区基因片段 ,并将其克隆至pUCm T载体中 ,经DNA序列分析后 ,将其重组于有 6×HisTag的融合蛋白表达载体pQE 31中 ,并在大肠杆菌M1 5中诱导表达。采用Ni NTA柱进行纯化 ,用Western印迹鉴定。结果表明 ,PCR扩增得到 854bp的A1区基因片段 ,序列测定结果与文献报道一致。IPTG诱导 5小时后表达的vWF因子A1蛋白占菌体总蛋白的 30 %左右 ,经Ni NTA纯化后其纯度在 95 %以上。Western印迹检测显示A1蛋白具有很好的抗原性和特异性。结论 :成功地在大肠杆菌中高效表达了人vWFA1区蛋白 ,为进一步研究vWF在血栓形成与止血中的作用奠定了基础     

溶瘤腺病毒介导的超抗原SEA基因的构建和潜在的靶向抗膀胱肿瘤机制

目的通过重组pSG218质粒构建携带超抗原葡萄球菌肠毒素A（SEA）基因的pDC318-SEA腺病毒载体,将其扩增纯化,并探讨其潜在的靶向抗肿瘤机制。方法通过PCR技术,从产SEA的葡萄球菌标准菌株基因组DNA中获得SEA全长基因,酶切后克隆入pSG218质粒,获得重组质粒pDC318-SEA。鉴定正确后,将pDC318-SEA与病毒骨架质粒pPE3-ccdB通过脂质体共转染HEK293细胞,9～14d出现病毒空斑。提取腺病毒的DNA,进行PCR鉴定。扩增DC318-SEA,氯化铯梯度离心纯化腺病毒,测定病毒滴度。结果应用PCR验证、双酶切分析、序列测定表明,成功构建了pDC318-SEA质粒,通过同源重组成功获得携带超抗原SEA基因片段的DC318-SEA腺病毒。结论获得可表达SEA基因的DC318-SEA溶瘤腺病毒载体,为进一步研究该病毒对膀胱肿瘤靶向治疗的作用奠定了基础,该病毒载体应该有巨大的、多靶向性、高效抗膀胱肿瘤作用。     

CDCP1胞外段基因的克隆及在大肠杆菌中表达

目的：构建携带 CDCP1胞外段基因的原核表达载体。方法以 A549的 mRNA 为模板,应用所设计的引物通过 RT-PCR 法扩增 CDCP1胞外段基因;将 PCR 产物与 pGEX-KG 载体连接,获得重组质粒 pGEX-KG/CDCP1;经双酶切、PCR 及 DNA 序列测定进行鉴定;IPTG 诱导表达。结果①RT-PCR 扩增得到约270 bp 大小的 CDCP1胞外段基因目的片段;②目的片段正确插入到 pGEX-KG 中;③经 IPTG 诱导表达,可见在相对分子质量约35kD 处出现明显的诱导蛋白条带,与预期一致。结论成功构建了携带 CDCP1胞外段基因的原核表达载体,在大肠杆菌中获得大量表达。