KRAS突变对肺损伤大鼠蛋白激酶信号途径的影响

目的 研究鼠类肉瘤病毒癌(KRAS)基因突变对肺损伤大鼠蛋白激酶信号途径的影响。方法 建立大鼠急性肺损伤模型。根据组织芯片KRAS蛋白表达分组,KRAS阴性组:KRAS蛋白表达H-score计分<3分),KRAS阳性组(KRAS蛋白表达H-score计分> 3分)。KRAS突变型组:突变型KRAS蛋白的表达H-score计分<3分,KRAS野生型组:突变型KRAS蛋白的表达H-score计分> 3分。采用免疫组化法检测10种肺损伤相关蛋白[磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K),KRAS,KRAS突变蛋白,NRAS,BRAF,丝裂原活化的细胞外信号调节激酶(MEK),细胞外信号调节激酶(ERK),磷酸化MEK1(p MEK1),磷酸化MEK2(p MEK2)和磷酸化ERK1/2(p ERK1/2)]的阳性表达,采用组织化学评分法(H-score)对蛋白表达情况进行定量并分组,比较各组KRAS下游蛋白及MEK2/ERK通路蛋白的表达情况。结果①与KRAS阴性组相比,KRAS阳性组该基因下游蛋白中BRAF、MEK、ERK表达显著上升(P <0. 05),而NRAS无显著差异(P> 0. 05);②与KRAS野生型相比,KRAS突变型基因下游蛋白中BRAF、MEK、ERK表达显著上升(P <0. 05),而NRAS无显著差异(P> 0. 05);③与KRAS阴性组相比,KRAS阳性组pMEK2,pERK1/2蛋白表达显著上升(P <0. 05),而p MEK1无显著差异(P> 0. 05)。结论 KRAS蛋白阳性大鼠肺损伤组织中,该蛋白下游蛋白BRAF、MEK和ERK(RAS/RAF/MEK/ERK信号通路的下游蛋白)在KRAS基因突变的肺损伤组织中的表达量显著增加,且MEK2/ERK通路蛋白MEK、p MEK2和ERK表达率也显著增加,提示KRAS蛋白通过调控其下游蛋白表达调控肺组织损伤,该过程可能与MEK2/ERK通路相关。     

益气养阴活血法对胃癌前病变大鼠MEK/ERK的影响

目的:研究益气养阴活血法对胃癌前病变大鼠MEK/ERK的影响。方法:75只Wistar大鼠被随机分成模型组、空白组、中药低剂量组、中药高剂量组和维霉素组,每组15只。采用以MNNG为主的四因素联合造模法建立胃癌前病变的大鼠模型,维霉素组给予维霉素混悬液1.0g/kg每日1次灌胃;中药低剂量组、中药高剂量组大鼠分别给予生药浓度为1.0g/mL、2.0g/mL的益气养阴活血方中药煎剂(10mL/kg)每日1次灌胃。16周后观察大鼠胃黏膜病理变化,以及对MEK1和ERK1水平的影响。结果:模型组大鼠胃黏膜MEK1、ERK1水平与空白组比较升高(P<0.05),中药高剂量组大鼠胃黏膜MEK1、ERK1水平与模型组比较降低(P<0.05),中药高剂量组大鼠胃黏膜病理改变得到改善。结论:益气养阴活血法可改善胃癌前病变大鼠胃黏膜病理状况,下调胃黏膜MEK1及ERK1水平。     

槲皮素调控EGFR/AKT/mTOR信号通路对人乳腺癌细胞株T47D增殖和凋亡的影响

目的观察槲皮素通过调控表皮生长因子(EGFR)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)信号通路对人乳腺癌细胞株T47D增殖、凋亡的影响。方法人乳腺癌细胞株T47D用常规培养至对数期时,以1. 5×10~6个/孔分装至6孔板,随机分为4组,每组5个复孔,待细胞贴壁生长后,对照组、低、中、高剂量组分别用磷酸盐缓冲液(PBS)、(25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L)槲皮素进行处理。对比干预24 h、48 h、72 h细胞增殖抑制率和凋亡率;对比干预72 h细胞EGFR、AKT、m TOR、血管内皮生长因子(VEGF)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(Caspase9) mRNA相对表达量及VEGF、Caspase9蛋白相对表达量和磷酸化EGFR(p-EGFR)/EGFR、p-AKT/AKT、p-m TOR/m TOR。结果增殖抑制率组间比较,中剂量组最高、高剂量组其次、低剂量组最低,每两组间比较差异均显著(P 0. 05),凋亡率组间比较,中剂量组最高、高剂量组其次、低剂量组稍低、对照组最低,每两组间比较差异均显著(P 0. 05),3个剂量组增殖抑制率、凋亡率均随时间延长呈显著升高趋势(P 0. 05),对照组凋亡率随时间延长变化不明显(P 0. 05);EGFR、AKT、m TOR、VEGF mRNA相对表达量、VEGF蛋白相对表达量、p-EGFR/EGFR、p-AKT/AKT、p-m TOR/m TOR组间比较,中剂量组最低、高剂量组其次、低剂量组稍高、对照组最高,每两组间比较差异均有统计学意义(P 0. 05);Caspase9 mRNA和蛋白相对表达量组间比较,中剂量组最高、高剂量组其次、低剂量组稍低、对照组最低,每两组间比较差异均有统计学意义(P 0. 05)。结论槲皮素可抑制人乳腺癌细胞株T47D的增殖、促进其凋亡,其中浓度为50μmol/L槲皮素时效果最佳,推测与下调EGFR、AKT、m TOR、VEGF mRNA和p-EGFR、p-AKT、p-m TOR、VEGF蛋白相对表达、上调Capase9 mRNA和蛋白相对表达、调节EGFR/AKT/m TOR信号通路有关。     

ERK1/2信号通路阻断剂PD98059对慢性高原病患者骨髓有核红细胞中Ras、BRaf、MEK、ERK1/2表达的影响

目的:探讨ERK1/2信号通路阻断剂PD98059对Ras、B型丝/苏氨酸蛋白激酶(BRaf)、丝裂原活化蛋白激酶(MEK)、细胞信号调节激酶1/2(ERK1/2)表达的影响,以期为慢性高原病(chronic mountain sickness,CMS)的基础研究和临床治疗探讨新的途径。方法:选取CMS患者16例,取骨髓液分离单个核细胞,以CD71与CD235a抗体磁珠分选阳性细胞,将细胞分为5组:空白对照组、DMSO溶剂组及PD98059 5、10和20μmol/L组。在低氧条件下培养72 h,应用ELISA法测定培养骨髓有核红细胞上清液中Ras-GTP水平,RT-PCR法测定骨髓有核红细胞中BRaf、MEK、ERK1/2 mRNA的表达,Western blot方法检测骨髓有核红细胞中p-BRaf、p-MEK、pERK1/2蛋白表达。结果:PD98059对各组Ras-GTP的水平无明显影响(P=0.798)。溶剂组与空白对照组相比,BRaf、MEK mRNA的表达水平差异无统计学意义(P=0.826、P=0.298)。与PD98059 20 mol/L比较,其余4组ERK1/2 mRNA的表达水平差异有统计学意义(P=0.001、P=0.002)。溶剂组与空白对照组相比,p-BRaf、p-MEK蛋白的表达差异无统计学意义(P=0.370、P=0.351)。与PD98059 20 mol/L比较,其余4组p-ERK1/2蛋白水平差异有统计学意义(P0.001、P0.007)。结论:PD98059能下调骨髓有核红细胞ERK1/2 mRNA及p-ERK1/2蛋白的表达。Ras/Raf/MEK/ERK 1/2通路是调控CMS骨髓有核红细胞的主要信号传导途径,可能参与了慢性高原病的发病过程。     

丙泊酚对大鼠海马ERK1/2磷酸化和c-fos mRNA表达水平的影响

目的探讨丙泊酚对大鼠海马ERK1/ERK2磷酸化和c-fos mRNA表达水平的影响。方法成年雄性SD大鼠64只,体重250-280 g,随机分为2组(n=32),丙泊酚组(P组)于训练前15 min腹腔注射丙泊酚9 mg/kg,容量2 ml/kg;生理盐水组(S组)注射等容量生理盐水。采用避暗箱实验测试大鼠认知功能。首先对大鼠进行训练,记录100 s内大鼠不再钻入暗室所需的训练次数。于训练结束后1、3、24 h(T1-3)时点记录大鼠在明室停留的时间即记忆潜伏期。各组于给药后15 min(T0)和T1-3记忆能力测试结束后,各断头处死8只大鼠,分离海马,测定ERK1/ERK2、磷酸化ERK1/ERK2(p-ERK1/ERK2)、c-fos mRNA的表达水平。结果与S组比较,P组大鼠不再钻入暗室所需的训练次数增加,T2和T3时记忆潜伏期缩短,T2,3时ERK1磷酸化水平降低,T0-3时ERK2磷酸化水平降低(P0.01),T0,3时海马c-fos mRNA表达水平无明显变化(P0.05),各时点海马ERK1、ERK2的表达差异均无统计学意义(P0.05)。结论丙泊酚可抑制大鼠海马ERK1/ERK2的磷酸化水平,对c-fos mRNA的表达尚不确定。     

MAPK/FOXA2介导香烟烟雾提取物对支气管上皮细胞分化的影响

目的:探讨吸烟对支气管上皮细胞分化的影响及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/叉头框转录因子A2(FOXA2)信号通路在此过程中发挥的作用。方法:培养BEAS-2B细胞,分为空白对照组、香烟烟雾提取物(CSE)处理组、CSE+ERK抑制剂U0126处理组、CSE+JNK抑制剂SP600125处理组、CSE+p38抑制剂SB203580处理组。ELISA测定各组磷酸化的ERK1/2、JNK、p38蛋白的水平;实时荧光定量PCR检测FOXA2、E-cadherin、CD44、ZO-1的mRNA水平;用Western印迹检测FOXA2、E-cadherin、CD44、ZO-1的蛋白水平。结果:与空白对照组相比,用CSE的细胞中磷酸化的ERK1/2、JNK、p38蛋白水平明显升高(P0.05),而FOXA2、E-cadherin、CD44、ZO-1的mRNA及蛋白表达水平均明显降低(P0.05);CSE处理同时采用ERK、JNK或p38抑制剂处理显著改善上述基因及蛋白表达的变化(P0.05)。结论:吸烟可影响支气管上皮细胞分化,而MAPK/FOXA2信号通路在此过程中发挥重要调节作用。     

表皮生长因子受体活化与胰腺癌细胞解离关系的实验研究

目的 明确表皮生长因子受体(EGFR)活化参与胰腺癌细胞解离调节的分子机制.方法 通过免疫荧光法检测仓鼠高转移株(PC-1.0)和低转移株(PC-1)胰腺癌细胞中EGFR、活化(磷酸化)EGFR (p-EGFR)、活化(磷酸化)丝裂原活化蛋白激酶激酶2 (p-MEK1/2)及活化(磷酸化)细胞外信号调节激酶1/2 (p-ERK1/2)的表达变化及其与胰腺癌细胞解离状态变化的关系.结果 胰腺癌细胞解离因子(DF)明显诱导低转移株胰腺癌细胞(PC-1)中EGFR、p-EGFR、p-MEK1/2和p-ERK1/2的表达,同时诱导其细胞克隆解离.相反,AG1478(EGFR活化抑制剂)明显抑制高转移株胰腺癌细胞(PC-1.0)中EGFR、p-EGFR、p-MEK1/2和p-ERK1/2的表达,同时诱导PC-1.0细胞聚集成细胞克隆.结论 表皮生长因子受体活化后激活MEK/ERK信号通路,从而参与胰腺癌细胞解离的调节.     

体外缺氧条件下新生鼠神经干细胞pERK1/2表达与叶酸的影响

背景:课题组前期实验已经证实,神经干细胞在正常培养条件下,叶酸可通过丝裂原活化蛋白激酶通路激活ERK1/2的磷酸化,进而促进神经干细胞的增殖.目的:探讨叶酸在体外缺氧条件下对神经干细胞外信号调节蛋白激酶pERK1/2表达的影响.方法:采用无血清培养法体外分离培养新生鼠神经干细胞,以1×10~8 L~(-1)接种于培养瓶,设立4组,除正常对照组外,缺氧模型组、叶酸缺乏组、叶酸添加组细胞均于第3天放入自制缺氧装置,37 ℃恒温箱中缺氧培养6 h,4组的叶酸含量分别为4 mg/L,4 mg/L,0.65 mg/L,8 mg/L.收集增殖6 d的细胞,锥虫蓝计数细胞密度,RT-PCR法检测pERK1/2 mRNA的表达,Western blot法检测pERK1/2蛋白的表达.结果与结论:与正常对照组比较,缺氧模型组神经干细胞增殖能力、pERK1/2 mRNA及蛋白的表达均明显降低.与缺氧模型组比较,叶酸添加组能促进缺氧条件下神经干细胞增殖以及pERK1/2 mRNA、蛋白的表达,而叶酸缺乏组则抑制缺氧条件下神经干细胞的增殖以及pERK1/2 mRNA、蛋白的表达,各组间比较差异有显著性意义(P < 0.001).证实添加叶酸后可激活ERK1/2磷酸化,进而促进缺氧条件下神经干细胞的增殖.     

广藿香油治疗皮肤光老化大鼠的效果研究及对p38MAPK/ERK通路蛋白的调控作用分析

目的对广藿香油治疗皮肤光老化大鼠的效果及对p38MAPK通路蛋白的调控作用进行分析,为临床治疗提供参考。方法 48只清洁级SD大鼠随机分为6组:对照组、模型组、PD98059组和广藿香油低、中、高剂量治疗组,每组8只。对照组大鼠给予正常光照射,其余各组采用长波段紫外线+中波紫外线(UVA+VUB)光源照射制备大鼠皮肤光老化模型。PD98059组和广藿香油组大鼠分别给予对应药物治疗,对照组给予生理盐水灌胃。分析各组大鼠血清中氧化还原酶、细胞凋亡蛋白及p38MAPK/ERK通路蛋白的表达。结果对照组皮肤无明显异常。模型组大鼠皮毛光泽度下降,皮肤颜色变深,且表皮干燥、粗糙、增厚、纹理增宽加深,弹性丧失;模型组大鼠血清中MDA、p38MAPK、Ras、Raf、MEK、ERK1/2、Bax、Caspase9及C-Fos和C-Jun水平明显升高而Bcl2、SOD、GSHPX和CAT蛋白水平明显降低(P0.01),而广藿香油治疗后上述蛋白异常得到明显的恢复,且与治疗前比较差异有统计学意义(P0.01);同时,广藿香油治疗具有剂量依从性,低剂量组、中剂量组和高剂量组之前差异有统计学意义(P0.01)。结论藿香油治疗皮肤光老化大鼠的效果与其调控p38MAPK/ERK通路相关蛋白及Bax、Bcl2、C-Fos和C-Jun表达有关。     

IKKε通过调控异常的MAPK/MEK/ERK信号转导通路参与急性主动脉夹层形成的机制研究

目的分析MAPK/MEK/ERK信号转导通路与急性主动脉夹层形成的关系及IKKε的调控作用,为临床相关治疗和新药研发提供参考。方法清洁级C57BL/6小鼠随机分为5组:对照组、模型组、IKKε-IN-1低剂量、中剂量和高剂量干预组。除对照组外,其余各组小鼠给予2 500 ng/(kg·min)血管紧张素Ⅱ(对照组给予生理盐水)14 d。自第7天起IKKε-IN-1低剂量、中剂量和高剂量干预组小鼠分别给予IKKε-IN-1治疗(1 mg/kg、5 mg/kg和25 mg/kg)。采用老龄小鼠埋泵缓释血管紧张素Ⅱ建立急性主动脉夹层动物模型,并采用IKKε特异性拮抗剂IKKε-IN-1进行干预,分析各组小鼠血浆MAPK/MEK/ERK信号转导通路相关蛋白表达。结果清洁级C57BL/6小鼠皮下植入缓释泵输注血管紧张素Ⅱ7 d后模型组小鼠收缩压为153±11.4 mm Hg(对照组为105±10.4 mm Hg),14 d后收缩压变为176±12.6 mm Hg,而IKKε-IN-1低剂量、中剂量和高剂量干预组小鼠的收缩压明显低于模型组(P0.05),且呈剂量依赖性(P0.05);与对照组相比,急性主动脉夹层小鼠Ras、Raf、MEK、ERK1/2、基质金属蛋白酶2(MMP2)及基质金属蛋白酶6(MMP6)蛋白表达明显增强而金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP1)和金属蛋白酶组织抑制因子2(TIMP2)的表达明显减弱(P0.05),而IKKε-IN-1低剂量、中剂量和高剂量干预组上述蛋白的表达明显恢复(P0.05),且呈剂量依赖性(P0.05)。结论激活的MAPK/MEK/ERK信号转导通路及基质金属蛋白酶参与了急性主动脉夹层形成,且此过程与IKKε的调控密切相关。     

益气养阴活血方对肾小球系膜细胞增殖及ERK通路的影响

目的 观察益气养阴活血方含药血清对高糖条件培养的大鼠肾小球系膜细胞增殖及胞外信号调节激酶(ERK)通路的影响.方法 制备益气养阴活血方和福辛普利含药血清.将大鼠肾小球系膜细胞分为正常对照组、高糖培养组、高糖培养+福辛普利含药血清组和高糖培养+三个不同浓度益气养阴活血方含药血清组.培养6 h、12 h、24 h、48 h、72 h后用Western-blot法对系膜细胞中磷酸化ERK1/2(pERK1/2)的表达进行半定量分析,用4-甲偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖.结果 与正常对照组相比,高糖组早期(24 h、48 h)能显著促进系膜细胞增殖,福辛普利和高浓度中药含药血清组均可抑制高糖引起的系膜细胞增殖(P<0.05),两组间无统计学差异(P>0.05).高糖刺激6 h后系膜细胞中pERK1/2蛋白的表达即明显增高,24 h达到高峰,后逐渐减弱,福辛普利和不同浓度中药含药血清干预后,pERK1/2蛋白水平显著下降(P<0.05),中药组和西药组间无统计学差异(P>0.05).结论 益气养阴活血方能抑制肾小球系膜细胞增殖和ERK通路的磷酸化,这可能是其临床肾脏保护作用机制所在.     

葡萄籽原花青素通过细胞外信号调节激酶1/2途径对放射性脑损伤大鼠海马区生长相关蛋白-43活性的影响

目的观察葡萄籽原花青素(GSPE)对放射性脑损伤大鼠的防治作用,并分析可能的保护机制。方法 72只3月龄雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为对照组(n=18)、模型组(n=18)、低剂量GSPE组(n=18)和高剂量GSPE组(n=18)。用直线加速器进行脑部照射22 Gy制作放射性脑损伤模型。采用穿梭箱实验检测大鼠学习能力;HE染色观察海马区神经细胞组织形态变化;RT-PCR法检测生长相关蛋白-43(GAP-43)m RNA表达,Western blotting检测磷酸化的细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)表达。结果与模型组比较,各GSPE组动物穿梭箱主动回避反应率显著升高(P0.001),被动回避潜伏期显著缩短(P0.001);海马区神经细胞结构损伤减轻;GAP-43 m RNA和磷酸化ERK1/2表达水平增高(P0.001)。且高剂量GSPE组显著优于低剂量GSPE组(P0.001)。模型组中GAP-43 m RNA表达水平与磷酸化ERK1/2水平呈正相关(r=0.764,P0.001);低剂量GSPE组和高剂量GSPE组中GAP-43 m RNA表达水平与磷酸化ERK1/2水平呈正相关(r=0.814,0.822,P0.001)。结论 GSPE通过ERK1/2途径提高大鼠海马区GAP-43表达,发挥防治放射性脑损伤作用。     

骨髓增生异常综合征患者造血细胞膜因子受体后信号通路的研究进展

近年研究发现骨髓增生异常综合征(MDS)患者造血细胞膜因子受体后信号通路有多种异常,这些异常与恶性克隆细胞凋亡减少、恶性增殖和分化障碍有关.现对此研究进展进行综述.一、Ras/Raf/MEK/ERK通路1.正常造血中的Ras/Raf/MEK/ERK通路:许多促进增殖、抑制凋亡的细胞因子能激活Ras/Raf/MEK/ERK[又称促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases,MAPK)]通路,常见的如EPO、干细胞因子(SCF)、G-CSF、GM-CSF、IL-3.以及近年发现的FMS样的酪氨酸激酶3(fmslike tyrosine kinase-3,Flt3)配体FL、血小板生成素(TPO)和表皮生长因子(EGF)等[1].配体和受体结合,使得胞质中包含SH2区的蛋白Shc和受体C末端相联系并引导Ras蛋白和三磷酸鸟苷(GTP)与细胞膜结合,Ras、GTP复合体进而通过Scr家族激酶激活Raf蛋白.     

茶多酚减轻哮喘大鼠气道损伤的作用观察及信号通路调控机制探讨

目的观察茶多酚减轻哮喘大鼠气道损伤的作用,并探讨其信号通路调控机制。方法取50只SD大鼠,其中40只采用腹腔注射卵清蛋白激发和雾化吸入的方法建立哮喘大鼠模型,将其随机分为哮喘组、低、中、高剂量组。其余10只大鼠用生理盐水代替激发和雾化液,设为对照组。末次雾化后6 h,低、中、高剂量组大鼠分别给予25mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg的茶多酚灌胃,模型组和对照组均给予生理盐水溶液灌胃,连续7 d。处死大鼠取肺泡灌洗液(BALF),检测并比较各组大鼠BALF中白介素-6(IL-6)、γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;观察各组肺组织病理学变化,并比较支气管壁厚度(Wat)、平滑肌厚度(Wam);比较肺组织中核转录因子κB(NF-κB)p65、转化生长因子-β1(TGF-β1)、结蹄组织生长因子(CTGF) mRNA和蛋白相对表达量。结果肺组织病理学观察,对照组无明显异常;哮喘组支气管黏膜皱襞增多,气道壁及平滑肌明显增厚,黏膜下层大量炎性细胞浸润,管腔黏液堵塞; 3剂量组上述变化均较哮喘组减轻,其中中剂量组减轻最为明显。Wat、Wam组间比较,对照组最薄、中剂量组其次、低、高剂量稍厚、哮喘组最厚,除低、高剂量组比较差异无显著性外(P 0. 05),每两组间比较差异均有显著性(P 0. 05); BALF中IL-6、IFN-γ、TNF-α水平、肺组织NF-κB p65、TGF-β1、CTGF mRNA和蛋白相对表达量组间比较,对照组最低、中剂量组其次、低、高剂量组稍高、哮喘组最高,除低、高剂量组比较差异无显著性外(P 0. 05),每两组间比较差异均有显著性(P 0. 05)。结论茶多酚可显著缓解哮喘大鼠气道炎症及气道重塑,其中50 mg/kg的茶多酚效果最佳,其机制可能与抑制NF-κB p65/TGF-β1/CTGF信号通路有关。     

AG1478对大鼠脊髓损伤后反应性星形胶质细胞增生的影响

目的:研究表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂AG1478对大鼠脊髓损伤后反应性星形胶质细胞增生的影响。方法:SD大鼠60只,随机分为对照组,AG1478组和假手术组,各组20只。观察AG1478对大鼠脊髓损伤后磷酸化表皮生长因子受体(pEGFR)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达、髓鞘脱失、神经功能恢复及体重的影响。结果:AG1478组大鼠pEGFR和GFAP的表达较对照组明显减弱(P0.01),损伤区脱髓鞘范围明显较对照组减小(P0.01),BBB评分明显高于对照组(P0.01),体重较对照组增加更明显(P0.05)。结论:AG1478可能通过阻断星形胶质细胞上的EGFR通路抑制胶质增生,促进脊髓损伤大鼠神经功能的恢复。     

柚皮素对肺鳞癌大鼠的抗肿瘤作用及microRNA34a/Sirt1/p53信号通路的调控机制

目的观察柚皮素对肺鳞癌大鼠的抗肿瘤作用,并探讨其对microRNA34a/Sirt1/p53信号通路的调控机制。方法选取50只Wistar大鼠,随机分为模型组,低、中、高剂量组和对照组,前4组利用3-甲基胆蒽(MCA)及二乙基亚硝胺(DEN)灌注左肺叶支气管建立肺鳞癌模型,对照组同时灌注等量的碘油。建模成功后,低、中、高剂量组分别给予10 mg/(kg·d)、20 mg/(kg·d)、40 mg/(kg·d)剂量的柚皮素注射液经尾静脉注射,模型组和对照组给予等量的无菌生理盐水。观察各组大鼠的一般情况,均于8周后处死,比较瘤体质量、抑瘤率;采用TNUEL检测凋亡指数(LI);采用RT-PCR检测肺组织中microRNA34a、Sirt1mRNA、p53 mRNA的表达;以WB检测肺鳞癌组织中Sirt1蛋白、p-p53蛋白的相对表达量及p-p53/p53。结果对照组大鼠状态良好,模型组大鼠状态最差,低剂量组明显优于模型组,中剂量组明显优于低剂量组,高剂量组明显优于中剂量组,但是3剂量组大鼠状态均不如对照组;各组大鼠瘤体质量、抑瘤率、LI比较差异均有统计学意义(P 0. 05),瘤体质量比较模型组最高,低剂量组稍低,中剂量组更低,高剂量组最低;抑瘤率比较高剂量组最高,中剂量组次之,低剂量组最低; LI比较高剂量组最高,中剂量组次之,低剂量组最低;各组microRNA34a、Sirt1 mRNA及蛋白、p53 mRNA、p-p53蛋白的相对表达量及p-p53/p53比较差异均有统计学意义(P 0. 05),其中microRNA34a、p53 mRNA、p-p53蛋白的相对表达量及p-p53/p53比较,模型组最高,低剂量组次之,中剂量组稍低,高剂量组更低,对照组最低; Sirt1 mRNA及蛋白的相对表达量比较,对照组最高,高剂量组次之,中剂量组稍低,低剂量组更低,模型组最低。上述指标每两组间比较均可见显著性差异(P 0. 05)。结论柚皮素对肺鳞癌大鼠有良好的抗肿瘤效果,能够控制瘤体质量,提高LI,并其作用呈剂量依赖性,推测与调控microRNA34a/Sirt1/p53信号通路,上调Sirt1 mRNA及蛋白表达,抑制microRNA34a、p53 mRNA、p-p53蛋白表达有关。     

MEK/ERK信号通路在环磷酰胺诱导的白细胞减少症模型大鼠造血功能中的作用研究

目的探讨丝裂原活化蛋白激酶激酶/细胞外信号调节激酶(MEK/ERK)信号通路在环磷酰胺诱导的白细胞减少症模型大鼠造血功能中的作用。方法采用随机数字表法将60只SD大鼠分为ARRY-162组、模型组和空白对照组。ARRY-162组和模型组连续3 d腹腔注射环磷酰胺30 mg/(kg·d)造模,对照组注射等体积生理盐水。自造模当天起,ARRY-162组给予ARRY-1623 mg/(kg·d)尾静脉注射,模型组和对照组给予生理盐水尾静脉注射处理。连续干预7 d,采用全自动分析仪分析外周血白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血小板(PLT)、网织红细胞(REC)数量,苏木素-伊红(HE)染色观察骨髓组织病理改变,流式细胞仪检测骨髓细胞凋亡情况,蛋白免疫印迹分析Bax、Bcl-2、MEK1/2、ERK1/2蛋白表达情况。结果与对照组比较,模型组大鼠外周血WBC、RBC、PLT数量及REC比率均显著减少,差异有统计学意义(P0.05);骨髓组织增生程度低,造血细胞减少,现大量脂肪组织增生,造血组织结构被破坏;骨髓细胞凋亡率明显升高(P0.05);骨髓组织Bcl-2蛋白水平显著降低,Bax、p-MEK1/2、p-ERK1/2蛋白水平明显增高(P0.05)。与模型组比较,ARRY-162组大鼠外周血WBC、RBC、PLT数量及REC比率均明显增多(P0.05);骨髓细胞凋亡率明显降低(P0.05);骨髓组织增生明显好转,组织损伤程度减轻;骨髓组织Bcl-2蛋白水平显著升高,Bax、p-MEK1/2、pERK1/2蛋白水平明显降低(P0.05)。结论 MEK/ERK信号通路在环磷酰胺诱导的白细胞减少症大鼠的造血功能下降中具有重要作用,MEK抑制剂ARRY-162可有效改善白细胞减少症大鼠的造血功能。     

二肽基肽酶-Ⅳ抑制剂对自发性2型糖尿病大鼠血清GLP-1和GIP的影响及调控机制

目的观察二肽基肽酶-Ⅳ(DPP-4)抑制剂沙格列汀对自发性2型糖尿病(T2DM)大鼠血清肠促胰素胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、葡萄糖依赖性促胰岛素释放肽(GIP)的影响,并探讨其调控机制。方法选取40只OLETF大鼠,随机分为4组:自发性T2DM组,低、中、高剂量组,另选取同种系10只LETO大鼠为对照组。3剂量组给予浓度分别为(0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、2 mg/ml)沙格列汀灌胃,自发性T2DM组和对照组给予生理盐水灌胃,1次/d,持续12周。对比灌胃6、12周后各组血清胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、葡萄糖依赖性促胰岛素释放肽(GIP)水平;灌胃12周后进行糖耐量试验,并对比各组空腹胰岛素(FINS)水平;灌胃12周后处死取胰脏组织检测并对比胰腺细胞凋亡率、蛋白激酶B(Akt)、叉头转录因子1(FoxO1)、胰十二指肠同源盒因子(Pdx1)、葡萄糖转运子1(GLUT2)、葡萄糖激酶(GCK)mRNA、磷酸化Akt(p-Akt)、磷酸化FoxO1(p-FoxO1)蛋白相对表达量。结果血清GLP-1、GIP、FINS水平、p-Akt/Akt、p-FoxO1/FoxO1值、Pdx1、GLUT2、GCK mRNA和蛋白组间比较,对照组最高、中剂量组其次、低、高剂量组稍低、自发性T2DM组最低,除低、中剂量组比较差异无显著性外(P0.05),其他每2组间比较差异均有显著性(P0.05);灌胃第12周血清GLP-1、GIP水平与灌胃第6周比较,3剂量组显著升高(P0.05),自发性T2DM组显著降低(P0.05),对照组差异无显著性(P0.05);自发性T2DM组大鼠在注射葡萄糖后60 min血糖水平达到峰值;对照组及3剂量组在注射后30 min血糖水平达到峰值,且在30~120 min内随时间延长显著降低(P0.05);糖耐量试验血糖水平、胰腺细胞凋亡率组间比较,对照组最低、中剂量组其次、低、高剂量组稍高,自发性T2DM组最高,除低、中剂量组比较差异无显著性外(P0.05),其他每2组间比较差异均有显著性(P0.05)。结论 DPP-4抑制剂可显著促进自发性T2DM大鼠GLP-1、GIP的分泌,调节糖代谢,减少胰岛细胞凋亡,其中1 mg/kg DPP-4抑制剂效果最佳,推测与上调p-Akt、p-FoxO1蛋白、Pdx1、GLUT2、GCK mRNA和蛋白表达、激活FoxO1/Pdx1信号通路有关。     

核因子κB抑制剂PDTC对颈椎病大鼠椎间盘炎症反应的抑制作用

目的探讨核因子κB(NF-κB)抑制剂吡咯烷二硫基甲酸盐(PDTC)对颈椎病大鼠椎间盘炎症反应的抑制作用。方法构建动静力失衡性颈椎病大鼠模型,将造模成功大鼠分为模型组,PDTC低、中、高剂量组,另外设立假手术组(仅切开颈部皮肤),每组大鼠10只,PDTC低、中、高剂量组大鼠每天分别腹腔注射50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg PDTC,假手术组及模型组腹腔注射等量生理盐水,连续28 d。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组大鼠椎间盘组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α),白介素-1β(IL-1β)及IL-6含量,Realtime PCR检测TNF-α,IL-1β及IL-6 mRNA表达,Western blot检测各组大鼠椎间盘组织中NF-κB p65、NF-κB抑制蛋白(IκBα)表达。结果与假手术组比较,模型组中大鼠椎间盘组织中TNF-α,IL-1β及IL-6 mRNA及蛋白含量提高(P <0. 05),p-NF-κB p65、p-IκBα表达量上调(P <0. 05)。与模型组比较,PDTC低、中、高剂量组大鼠椎间盘组织中TNF-α,IL-1β及IL-6 mRNA及蛋白含量降低(P <0. 05),p-NF-κB p65、p-IκBα表达量下调(P <0. 05),并呈剂量依赖性。结论 PDTC能显著地抑制颈椎病大鼠椎间盘炎症反应,并其作用呈剂量依赖性。     

冬凌草甲素抑制胃癌细胞增殖及增强西妥昔单抗化疗敏感性的机制研究

目的探讨冬凌草甲素抑制胃癌细胞增殖及增强西妥昔单抗化疗敏感性的机制。方法采用不同浓度冬凌草甲素或相同浓度冬凌草甲素在不同时间处理SGC7901胃癌细胞株,通过MTT法检测其增殖水平。冬凌草甲素、西妥昔单抗、冬凌草甲素联合西妥昔单抗与SGC7901胃癌细胞株共培养后,采用流式细胞技术检测细胞凋亡率和细胞周期的变化,Western blot检测细胞中表皮生长因子受体(EGFR)、蛋白激酶B(AKT)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)、信号传导及转录激活蛋白3(STAT3)磷酸化表达水平,Real-time PCR检测Bcl-xL、Cyclin D1的转录水平。结果冬凌草甲素对SGC7901胃癌细胞株的增殖作用呈浓度及时间依赖性,浓度越高则增殖水平越低,相同浓度冬凌草甲素对细胞的增殖抑制作用随时间延长而增强,差异有统计学意义(P 0. 05)。流式细胞技术检测细胞凋亡结果显示,SGC7901胃癌细胞株无药物干预时凋亡率为(2. 90±0. 90)%;西妥昔单抗作用细胞后,细胞凋亡率为(9. 30±2. 20)%;冬凌草甲素作用后细胞凋亡率为(18. 20±4. 20)%;冬凌草甲素联合西妥昔单抗处理组细胞凋亡率高达(57. 10±8. 70)%,显著高于单药组细胞凋亡率(P 0. 05)。冬凌草甲素联合西妥昔单抗处理SGC7901胃癌细胞后,磷酸化表皮生长因子受体(pEGFR)、磷酸化蛋白激酶B(pAKT)、磷酸化细胞外调节蛋白激酶(p ERK)、磷酸化信号传导及转录激活蛋白3(p STAT3)表达水平减少,与冬凌草甲素组、西妥昔单抗组比较有显著差异(P 0. 05),Bcl-xL、Cyclin D1 mRNA转录减少,差异有统计学意义(P 0. 05)。结论冬凌草甲素通过抑制EGFR/STAT3通路来抑制胃癌细胞增殖及增强西妥昔单抗化疗敏感性。