BMP7基因克隆及其在兔关节软骨细胞中的表达

目的：克隆骨形态发生蛋白BMP7基因并检测其在体外培养的兔关节软骨细胞中的表达。方法：从体外培养的幼兔膝关节软骨细胞中提取总RNA;按GenBank BMP7基因序列化学合成2条引物,采用RT-PCR方法得到BMP7基因;将BMP7基因片段插入到真核表达载体pcDNA 3.1中,构建pcDNA3.1-BMP7真核表达载体质粒;利用双酶切、PCR及核苷酸序列分析鉴定BMP7目的基因;将重组pcDNA3.1-BMP7真核表达载体质粒转染家兔关节软骨细胞,分别采用原位杂交、PCR、Western blotting法测定BMP-7表达。结果：克隆得到的BMP7基因核苷酸序列长约1 300 bp,构建的重组pcDNA 3.1-BMP7真核表达载体质粒目的基因BMP-7序列与GenBank报道的BMP-7基因（No. BC008584)一致,转染了BMP7基因的体外培养的成年家兔膝关节软骨细胞表达了BMP7蛋白。结论：成功构建表达BMP7蛋白的转基因关节软骨细胞,其可用于细胞移植治疗或作为种子细胞构建组织工程软骨修复关节软骨缺损。     

兔实验性骨关节病髁突软骨细胞表达软骨基质分子的变化及白细胞介素1β的影响

目的 :研究外源性炎症因子白细胞介素 1β(interleukin 1β,IL 1β)对颞下颌关节骨关节病与正常髁突软骨细胞代谢活动的影响 ,探讨其在颞下颌关节骨关节病进展过程中所发挥的作用。方法 :采用 2 0 μg·L-1重组白介素1β(recombinedhumaninterleukin 1β ,rhIL 1β)刺激体外贴壁培养条件下的成兔正常成熟髁突软骨细胞与兔实验性颞下颌关节骨关节病模型髁突软骨细胞 ,RT PCR方法检测、比较细胞对软骨基质成分Ⅱ型胶原、蛋白多糖聚糖体、胶原酶以及内源性生长因子胰岛素样生长因子 1(insulin likegrowthfactor 1,IGF 1)和转移生长因子 β1(trans forminggrowthfactor β1,TGF β1)的mRNA表达变化。结果 :在 2 0 μg·L-1rhIL 1β的刺激下 ,(1)正常成熟髁突软骨细胞Ⅱ型胶原和软骨蛋白多糖聚糖体的表达均明显降低 ,胶原酶表达水平变化不明显 ;(2 )在IL 1β的作用下 ,骨关节病软骨细胞对Ⅱ型胶原和胶原酶的表达水平降低 ,对软骨蛋白多糖聚糖体的表达水平无明显影响 ;(3)IL 1β对正常和骨关节病髁突软骨细胞内源性生长因子IGF 1和TGF β1的表达均无明显影响。 结论 :蛋白多糖聚糖体的合成 ,导致髁突软骨病变发生 ,而且能不断干扰骨关节病髁突软骨细胞代谢 ,导致关节软骨基质环境进一步恶化。     

rhBMP-2诱导的相关信号转导分子在NIH3T3细胞中的表达

目的 :观察NIH3T3细胞中BMP信号转导因子的表达 .方法 :用免疫组化和原位杂交方法检测NIH3T3细胞中BMP ,BMPⅠ ,Ⅱ型受体和Smad1,4 ,5的表达 ,在细胞培养液中加入 5 0 μg·L-1rhBMP 2 ,检测细胞的碱性磷酸酶 (ALP)活性和骨钙素 (OC)含量观察细胞是否有成骨趋向 .结果 :细胞中有BMPⅠ ,Ⅱ型受体和Smad1,4 ,5的表达 ;没有BMP的表达 ;加入 5 0 μg·L-1rhBMP 2后 ,ALP活性和OC含量均增高 .结论 :rhBMP 2作用于NIH3T3细胞后 ,细胞有成骨趋向 .NIH3T3细胞是rhBMP 2的靶细胞 ,细胞中有BMPs信号转导因子的表达     

脂质体介导下重组pcDNA3-hBMP3转染兔关节软骨细胞的条件

目的　探讨基因转移效率与 pc DNA3- h BMP3质粒及阳离子脂质体的浓度、转染时机以及细胞的种殖密度等因素的关系 ,以寻求最佳的基因转染条件 .方法　细胞密度按 2× 10 4· cm- 2 接种后 ,对细胞接种后即时、孵化 2 ,5和 7d进行转染效率研究 ;G418浓度每 m L DMEM分别含有 2 0 0 ,30 0 ,40 0 ,5 0 0和 6 0 0μg,探讨 G418对软骨细胞的杀伤作用 ;选择不同细胞接种密度、不同脂质体浓度和 pc DNA3- BMP3浓度 ,在细胞对数生长期且细胞融合至 70 %～ 80 %时开始做转染 ,各组软骨细胞爬片的原位杂交结果通过计算机图像分析 ,以其灰度值判定基因转染的效率 .结果　最佳期的转染时机为软骨细胞接种后在孵箱内放置 2 d转染 ,即在软骨细胞对数生长期内做转染 .G418对软骨细胞的最佳筛选浓度为 40 0 mg· L- 1 .最佳的细胞种植密度、pc DNA3- BMP3浓度和脂质体的量应分别为 2× 10 4· cm- 2 ,5 μL 和 10 μL.结论　通过本研究探索出脂质体介导下 pc DNA 3- BMP3转染兔关节软骨细胞的最佳条件 .     

重组BMP7真核表达载体的构建及其对关节软骨细胞的转染

目的：构建pcDNA3.1-BMP7真核表达载体,并探讨转染关节软骨细胞的脂质体和DNA的最佳比例及BMP7基因表达。方法：构建pcDNA3.1-BMP7真核表达载体。用脂质体将pcDNA3.1-BMP7包裹形成DNA脂质体复合物,转染家兔关节软骨细胞,G₄₁₈筛选。转染过程中确定脂质体浓度、脂质体与pcDNA3.1-BMP7质粒的比例。原位杂交、PCR、Western blotting测定BMP7表达。结果：构建了pcDNA3.1-BMP7真核表达载体,脂质体与 pcDNA3.1-BMP7质粒最佳转染浓度为3 mL培养液中加10 μL脂质体和4 μg pcDNA3.1-BMP7质粒(2.5∶1);以400 mg·L^-1 G₄₁₈的正常培养液筛选28 d,BMP7为阳性表达。结论：在脂质体介导下,pcDNA3.1-BMP7转染家兔关节软骨细胞获得成功,且BMP7在该细胞中稳定表达。     

Noggin基因沉默对BMP和Wnt信号通路表达的影响

目的 检测分析Noggin基因沉默对毛囊发育中BMP和Wnt信号通路的影响。方法 采用实时荧光定量PCR和Western Blot技术对Noggin基因沉默的MC3T3-E1稳转细胞系中BMP-2、BMP-4、BMPR-ⅠA、BMP-6、BMP-7、LEF-1、β-catenin的表达情况进行检测分析。 结果 实时荧光定量PCR结果显示,BMP信号通路中的五个基因的表达都受到Noggin基因沉默的显著的影响,其中BMP-2（P<0.001）、BMP-4（P<0.01）、BMP-6（P<0.001）、BMP-7（P<0.001）表达量均升高;BMPR-ⅠA（P<0.01）表达量降低。同时Wnt信号通路中的两个基因LEF-1（P<0.001）、β-catenin（P<0.001）的表达也都显著降低。Western Blot结果显示,两条信号通路中这几种蛋白的表达也都受到影响,其中显著升高的有BMP-2（P<0.05）、BMP-4（P<0.05）、BMP-6（P<0.05）和BMP-7（P<0.05）;显著降低的是β-catenin（P<0.05）、BMPR-ⅠA（P<0.01）和LEF-1（P<0.001）。结论 在体外Noggin基因对BMP信号通路可能存在反馈性抑制机制,而对Wnt信号通路存在反馈性激活机制,为下一步探究在体内Noggin基因对BMP和Wnt信号通路表达的作用提供一定的依据。     

骨形成蛋白-4参与调控胚胎舌形态发育

目的：采用胚胎舌体外培养结合扫描电子显微镜、免疫组织化学方法,探讨骨形成蛋白（bone morphogenetic protein-4, BMP4)对舌体形态发育的影响。方法：分别向标准培养基中添加不同浓度的BMP4及其拮抗剂Noggin,以所加因子及其浓度的不同分为6个实验组, BMP4分为3组,浓度分别为0.03 mg/L, 0.3 mg/L, 1 mg/L; BMP4的拮抗剂Noggin分为3组, 浓度分别为1 mg/L, 3 mg/L, 10 mg/L; 标准培养基培养组为对照组。将解剖获得的大鼠胚胎第13天（embryonic day 13,E13）的胚胎舌在培养基中格栅法培养3 d, 固定后, 用扫描电子显微镜观察记录胚胎舌; 分别测量胚胎舌全长、舌前1/8、舌前1/4和舌体1/2宽度, 统计分析测量结果。胚胎舌内放置经PBS和BMP4（667 mg/L）溶液处理的凝胶颗粒, 以PBS组为对照组, 在标准培养基中培养3 d后, 制成冰冻切片, 检测Ki67的表达。结果：（1）舌形态：舌体长度明显改变（P<0.05）, 相对对照组舌体长度（1 037.8±126.2 μm）, BMP4各浓度组舌体长度明显变短（0.03 mg/L组877.3±67.6 μm, 0.3 mg/L组838.5±88.9 μm,1 mg/L组718.7±38.6 μm）, Noggin各浓度组变化不明显（1 mg/L组1 191.1±75.7 μm , 3 mg/L组1 169.8±108.7 μm, 10 mg/L组1 241.3±17.4 μm）; 舌前1/8宽度明显改变（P<0.05）, 相对对照组（639.1±106.2 μm）, BMP4各浓度组舌前1/8宽度明显变窄（0.03 mg/L组332.1±80.9 μm, 0.3 mg/L组305.1±51.3 μm, 1 mg/L组276.9±45.9 μm）, Noggin各浓度组除10 mg/L组外, 舌前1/8宽度加宽（1 mg/L组815.5±90.3 μm, 3 mg/L组857.6±87.1 μm, 10 mg/L组807.1±113.8 μm）; 舌前1/4宽度改变明显（P<0.05）, 相对对照组（653.7±101.6 μm）, BMP4各浓度组舌前1/4宽度明显变窄（0.03 mg/L组421.3±43.8 μm, 0.3 mg/L组407.3±15.6 μm, 1 mg/L组363.7±24.7 μm）, 而Noggin各浓度组明显加宽（1 mg/L组838.0±130.5 μm, 3 mg/L组947.2±34.9 μm, 10 mg/L组889.4±74.6 μm）; 舌体1/2宽度变化明显（P<0.05）, 相对对照组（683.1±79.8 μm）, BMP4各浓度组舌体1/2宽度明显变窄（0.03 mg/L组567.3±35.8 μm , 0.3 mg/L组548.4±30.5 μm, 1 mg/L组457.4±48.0 μm）, Noggin各浓度组舌体1/2有增宽趋势, 与其他两组比较, 3 mg/L组差异有统计学意义（1 mg/L组776.2±134.1 μm, 3 mg/L组964.3±44.3 μm, 10 mg/L组777.2±46.7 μm）。（2）BMP4凝胶颗粒周围Ki67阳性细胞数量少于对照组。结论：（1）BMP4可影响E13胚胎舌形态发育, 使舌体呈现短、窄、尖的外形; （2）BMP4抑制胚胎舌的细胞增殖。     

GIT1通过BMP-2/p-Smad1/5/8信号通路调节骨折愈合

目的:探讨G蛋白偶联受体激酶结合蛋白1(G-protein coupled receptor kinase-interacting protein 1,GIT1)影响骨折愈合的具体机制?方法:分别取 GIT1基因敲除小鼠和同窝野生型小鼠制作股骨骨折模型,每组30只?造模成功后2周,免疫组化检测骨痂区软骨细胞矿化及p-Smad1/5/8表达量?分别取2组小鼠的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),予以10 ng/mL的骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP2)刺激后检测Smad1/5/8磷酸化水平和核转入能力;取C3H10T1/2细胞,分别用1 μg pGL3重组质粒和1 μg GIT1-siRNA共转染细胞,荧光报告素酶技术检测细胞内GIT1蛋白对BMP2转录水平的影响?结果:与同窝野生型小鼠相比,GIT1基因敲除小鼠软骨内骨化减弱,骨痂区软骨细胞堆积,骨折愈合延迟,p-Samd1/5/8表达水平明显减少;与GIT1基因敲除小鼠相比,BMP2可明显提高同窝野生型小鼠BMCs中p-Samd1/5/8核转入能力;GIT1蛋白表达的缺失可明显降低BMP2的转录水平?结论:GIT1可通过调节Samd1/5/8的磷酸化及BMP2信号转导影响骨折部位的软骨内骨化?     

阻断TGF-β/TGF-βRⅠ通路对ATDC5细胞增殖、分化及细胞外基质的影响

目的研究转化生长因子βⅠ型受体(transforming growth factor beta typeⅠreceptor,TGF-βRⅠ)阻断剂SB-505124对软骨细胞增殖、分化及细胞外基质的影响与机制。方法利用Western blot检测不同浓度的SB-505124处理后,前软骨细胞系ATDC5中p-Smad2/3的变化。MTT法检测SB-505124处理对ATDC5细胞生长、增殖的影响及时间、浓度依赖性效应。Western blot检测c-Myc蛋白水平的变化。Real-time PCR检测SB-505124处理后软骨分化、细胞外基质合成及降解相关分子CollagenⅡ、Aggrecan及Adamts5表达与变化,并利用阿尔新蓝染色法检测SB-505124处理对ATDC5细胞中蛋白聚糖合成的影响。结果 Western blot检测结果示:SB-505124处理ATDC5细胞明显抑制TGF-β1激活的p-Smad2/3,并呈浓度依赖性;MTT检测结果示:SB-505124浓度和时间依赖性的抑制ATDC5细胞增殖;Real-time PCR检测结果示:SB-505124处理明显抑制ATDC5细胞中CollagenⅡ、Aggrecan的表达,同时上调了Adamts5的表达;阿尔新蓝染色结果提示SB-505124处理明显抑制ATDC5细胞中蛋白聚糖的合成。结论利用SB-505124阻断内源性TGF-β信号,可抑制软骨细胞增殖、分化及细胞外基质的合成,同时促进细胞外基质的降解。     

骨形成蛋白7重组腺病毒转染培养兔软骨细胞的体外研究

目的：观察骨形成蛋白7重组腺病毒（Ad-BMP7）转染兔软骨细胞后BMP7的表达。方法：分离培养3周龄兔膝关节软骨细胞,将Ad-BMP7转入,RT-PCR检测BMP7在mRNA水平的表达,Western Blot和免疫组化染色检测其在蛋白水平的表达。另设空白对照组。结果：实验组在mRNA水平和蛋白水平均能有效表达BMP7基因。结论：携带BMP7基因的重组腺病毒体外转染的关节软骨细胞,可以产生BMP7。     

软骨寡聚基质蛋白在颞下颌关节滑膜软骨瘤病中的表达

目的: 检测软骨寡聚基质蛋白(cartilage oligomeric matrix protein,COMP)在颞下颌关节滑膜软骨瘤病(synovial chondromatosis of the temporomandibular joint,TMJSC)中的表达,并初步探讨其在TMJSC发病中可能的作用。方法: ...     

基于双荧光素酶报告基因系统建立miR-140生物传感器

目的：利用双荧光素酶报告基因系统构建可检测miR-140活性的生物传感器。方法：首先,在psiCHECK-2双荧光报告基因质粒的多克隆位点插入miR-140成熟体的4个拷贝反义序列,构建miR-140 sensor。其次,将miR-140 sensor和miR-140 mimics共转染HEK-293 T细胞,利用双荧光素酶报告基因系统检验miR-140 sensor的功能。最后,转染miR-140 sensor至大鼠骨髓间充质干细胞（ rat MSCs ）,分析在成软骨诱导中miR-140的活性变化,并与miR-140的表达水平相比较。结果：在HEK-293T细胞中,相对于阴性对照组,miR-140 sensor与miR-140 mimics共转能明显降低49％（20 nmol· L-1）和65％（50 nmol· L-1）的荧光活性。将转染miR-140 sensor的rat MSCs成软骨诱导7 d后,荧光活性降低43％,提示miR-140活性升高,与RT-qPCR法检测的miR-140表达水平相一致。结论：构建的miR-140 sensor是一种简单方便有效的miRNA传感器,可用于检测miR-140活性。     

骨形成蛋白-7对多孔钽／软骨细胞复合物分泌功能以及 Col-Ⅱ、AGG 和 Sox9基因表达的影响

目的：研究人重组骨形成蛋白-7（bone morphogenetic protein-7,BMP-7）对国产多孔钽／软骨细胞复合物中软骨细胞分泌功能以及Ⅱ型胶原（ typeⅡcollagen,Col-Ⅱ）、蛋白聚糖（ aggrecan,AGG）和SRY相关高迁移率组基因9（SRY-related high mobility group-box gene 9,Sox9）mRNA表达的影响。方法：3周龄新西兰幼兔,取双膝关节软骨细胞分离培养及鉴定,将生长状态良好的第2代细胞以1×106／mL浓度接种于多孔钽并给予不同浓度BMP-7,分为对照组（多孔钽／软骨细胞组）、50μg／L BMP-7／多孔钽／软骨细胞组、100μg／L BMP-7／多孔钽／软骨细胞组及200μg／L BMP-7／多孔钽／软骨细胞组。 CCK-8法检测不同浓度BMP-7对多孔钽／软骨细胞生长及增殖的影响,扫描电镜观察各组软骨细胞在多孔钽表面及内部生长情况,二甲基亚甲蓝（ dimethyl methylene blue,DMMB）比色定量法对BMP-7／多孔钽／软骨细胞复合物糖胺多糖（ glycosaminoglycan,GAG）进行定量检测,实时荧光定量PCR检测Col-Ⅱ、AGG和Sox9 mRNA的表达。结果：原代软骨细胞培养24 h后呈梭形生长,4 d后细胞呈多角形,胞浆丰富。阿辛蓝（ alcian blue）、番红O（ safranin O）、Col-Ⅱ免疫细胞化学染色均呈阳性反应。 CCK-8法细胞增殖检测结果显示,100μg／L BMP-7／多孔钽／软骨细胞组细胞增殖水平高于其他各组（ P＜0．05）。扫描电镜示各组软骨细胞在多孔钽表面生长状态良好,细胞有多个突起、伸展、叠层生长并覆盖于多孔钽表面。 GAG定量检测显示,100μg／L BMP-7／多孔钽／软骨细胞组GAG含量比其他各组均明显升高（ P＜0．05）;实时荧光定量PCR检测显示,各实验组Col-Ⅱ、AGG和Sox9 mRNA表达量均高于对照组,以200μg／L BMP-7／多孔钽／软骨细胞组升高最为明显（ P＜0．05）。结论：BMP-7／多孔钽／软骨细胞复合体能促进体外软骨细胞增殖及细胞外基质的分泌,促进软骨基因的表达。     

四环素调控系统在肿瘤细胞株中的建立和鉴定

目的 建立受四环素及其衍生物强力霉素(doxycycline,DOX) 诱导调控的高表达外源目的 基因的人胰腺癌细胞株.方法 构建高效表达转录激活因子(tTA) 的真核表达载体,利用脂质体转染法导入人胰腺癌细胞株PANC-1,经嘌呤霉素筛选后挑取单克隆扩大培养,利用荧光素酶报告基因系统筛选受强力霉素诱导调控的高表达外源目的 基因的PANC-1 细胞株(Tetoff细胞株),并利用RT-PCR 和免疫荧光细胞化学法检测tTA 在Tet-off 细胞株中的表达.结果 荧光素酶报告基因技术、RTPCR和免疫荧光化学染色法检测均表明成功构建了三株受强力霉素高度调控的高表达低背景的PANC-1 细胞株.结论 成功获得含四环素调控系统的Tet-off 人胰腺癌细胞株,其调控活性好、背景低,为研究外源基因功能提供了一条有效途径.     

ATDC5:一株反映软骨形成完整过程的细胞系

中医学认为,筋骨失养,系肝肾虚衰所致。补肾中药的某些有效成分具有与细胞因子、激素类似的生理活性和广泛的药理作用,不仅可用于骨性关节炎的治疗,而且在组织工程及干细胞工程领域有广泛的应用前景。ATDC5细胞株来源于小鼠畸胎癌株AT805,作为一个前软骨细胞株其分化过程与软骨形成过程类似。在细胞因子、激素和无机磷酸盐等作用下,ATDC5细胞将发生增殖、聚集进而进入软骨细胞分化阶段,分化为增殖性软骨细胞。增殖性软骨细胞随后继续分化为肥大性软骨细胞,从而进入终末分化阶段,软骨基质发生矿化,最终沉积成骨。通过从系统调节因子、局部调节因子和细胞培养条件三个方面,揭示ATDC5细胞增殖、分化与矿化的分子机制,为软骨发育研究及中药有效成分高通量筛选提供理论依据。     

成纤维细胞生长因子抑制长链非编码RNA Malat1的表达及对软骨细胞增殖的影响

目的 探讨在软骨细胞模型中成纤维细胞生长因子通路对长链非编码RNA(long noncoding RNA,LncRNA) Malat1的调控作用.方法 采用Ⅰ型成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor 1,Fgfr1)组织特异性敲除小鼠和Ⅲ型成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor 3,Fgfr3)敲除小鼠的原代软骨,以及利用软骨细胞系培养充当软骨细胞模型,成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2,FGF2)及下游细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)通路阻断剂U0126处理细胞,利用荧光定量PCR检测Malat1的表达变化.在ATDC5细胞模型中通过siRNA转染干扰Malat1或Fgfr1,质粒转染过表达Fgfr1,利用荧光定量PCR检测Malat1的表达,细胞计数检测细胞增殖变化.结果Malat1被干扰24、36、48、60 h后,ATDC5细胞增殖速度显著减慢(P＜0.05),FGF2处理ATDC5细胞24 h后Malat1表达显著下降(P＜0.05),且ERK通路抑制剂U0126处理细胞后FGF2对Malat1的抑制作用消失.Fgfr1条件性敲除或si-Fgfr1干扰后Malat1表达显著升高(P＜0.05),且FGF2对Malat1的抑制作用消失,Fgfr1在ATDC5细胞中过表达后Malat1表达与对照组相比显著降低(P＜0.05).结论软骨细胞中FGF2可能通过Fgfr1激活下游ERK通路,抑制了Malat1的表达,从而影响软骨细胞增殖.     

Improvement of Chemically-activated Luciferase Gene Expression Bioassay for Detection of Dioxin-like Chemicals

To improve the chemically-activated luciferase expression (CALUX)bioassay for detection of dioxin-like chemicals (DLCs) based on the toxicity mechanisms of DLCs. Method A recombinant vector was constructed and used to transfect human hepatoma (HepG2). The expression of this vector was 10-100 folds higher than that of pGL2used in previous experiments. The transfected cells showed aromatic hydrocarbon receptor (AhR)-meditated luciferase gene expression. The reliability of luciferase induction in this cell line as a reporter of AhR-mediated toxicity was evaluated, the optimal detection time was examined and a comparison was made by using the commonly used ethoxyresoufin-Odeethylase (EROD) activity induction assay. Result The results suggested that the luciferase activity in recombinant cells was peaked at about 4 h and then decreased to a stable activity by 14 h after TCDD treatment. The detection limit of this cell line was 0.1 lpmol/L, or 10-fold lower than in previous studies, with a linear range from 1 to 100pmol/L, related coefficient of 0.997, and the coefficient of variability (CV) of 15-30%,Conclusion The luciferase induction is 30-fold more sensitive than EROD induction, the detection time is 68 h shorter and the detection procedure is also simpler.     

人骨形成蛋白7基因的克隆及其在兔骨髓基质干细胞中的瞬时表达

目的克隆人骨形成蛋白7(BMP-7基因,并构建其真核表达载体,观察其在兔骨髓基质干细胞(rBMSC)中的表达并探讨其应用于骨科局部基因治疗的可能性.方法用RT-PCR法从人胎肾组织中克隆人BMP-7基因全长cDNA并测序.将BMP-7基因cDNA克隆到穿梭载体pShuttle中构建表达载体pShuttle-BMP-7,经鉴定后利用LipofectAMINE2000瞬时转染rBMSC,用RT-PCR方法及免疫组化检测BMP-7基因的表达.结果用RT-PCR法从胎肾组织中克隆出1296 bp的cDNA,测序证实为人BMP-7基因.RT-PCR方法及免疫组化检测证实其能在rBMSC中表达.结论成功克隆人BMP-7基因并证实其在rBMSC的表达,为下一步腺病毒介导的局部基因治疗打下基础.     

骨形态反应蛋白-2对骨髓基质干细胞与软骨细胞共培养向软骨细胞分化的影响

目的研究细胞因子骨形态反应蛋白-2(BMP-2)与软骨细胞共同诱导骨髓基质干细胞(BMSCs)向软骨细胞分化是否有协同作用,并检测BMP-2对BMSCs和软骨细胞共培养诱导分化为软骨细胞的最佳浓度。方法将体外分别培养扩增的兔BMSCs和软骨细胞按相同的比例(7∶3)混合后,均以5.0×107.mL-1的细胞浓度接种混合培养,根据不同的BMP-2浓度分为以下几组,5、10、20、30、40、50 ng/mL组,以单独培养的软骨细胞作为阳性对照组,以单独培养的BMSCs作为阴性对照组,以混合培养后不加BMP-2作为0 ng/mL组。通过MTT、Ⅱ型胶原蛋白表达以及糖胺聚糖蛋白表达的检测,确定BMP-2与软骨细胞共同作用于BMSCs是否有协同作用及促进BMSCs向软骨细胞转化的最佳BMP-2浓度。结果单独培养BMSCs的阴性对照组向软骨细胞分化的倾向不明显,而与软骨细胞混合培养的0 ng/mL组软骨细胞增多,添加BMP-2的5、10、20、30、40、50 ng/mL组向软骨细胞分化更加明显。结论 BMP-2与软骨细胞共同作用于BMSCs对于其向软骨细胞分化有协同作用,BMP-2的最佳作用浓度为20 ng/mL。     

CYP3A4＊1G基因多态性及功能的初步探讨

采用双荧光素酶报告基因系统分析CYP3A4＊ 1G多态性对CYP3A4基因转录活性的影响.构建含CYP3A4＊ 1G突变位点的荧光素酶基因表达载体,用Lipofectamine 2000转染HepG2细胞,化学发光法检测荧光素酶活性. 应用双荧光素酶报告基因系统检测显示,pGL3-promoter-A质粒转染后荧光素酶活性显著高于pGL3-promoter-G（P=0.022＜ 0.05）. CYP3A4＊ 1G能够增强荧光素酶基因的表达,可能增强CYP3 A4基因的转录活性.