HBV基因组转染对小鼠NIH3T3细胞内基质金属蛋白酶组织抑制因子的转录调控作用

ObjectiveTo understand the mechanism of liver cirrhosis after the infection of hepatitis B virus.MethodsMouse fibroblast NIH3T3 cells were transfected with 3.2 kb HBV DND by exposure of the cells to calcium phosphate.The change of the levels of mRNA for tissue inhibitor of metalloproteinase 1and 2(TIMP1,2) was detected in mouse fibroblast NIH3T3 cells and the cells of transfection with HBV Genome by in situ hybridization.ResultsThe levels of mRNA for TIMP1 and TIMP2 were increased significantly.ConclusionHBV infection can induce the expression of the mRNA for TIMP1 and TIMP2.     

肺间质纤维化大鼠肺组织基质金属蛋白酶及其组织抑制因子含量变化

观察肺纤维化形成过程中基质金属蛋白酶（Matrix Metallo proteinas简称MMPs)及其组织抑制因子（Tissue inhibitors of Metallo proteinases简称TIMPs)含量的变化,探讨其在肺纤维化发病中的作用。将Wistar大鼠60只,随机均分为对照组及模型组,气管内注入博莱霉素A5 5mg/kg,制备肺间质纤维化动物模型,观察注药后1、3、7、14及28d肺脏病理变化,利用酶谱法及免疫印记法分析肺组织MMP－2、MMP－9、TIMP－1的含量变化。结果显示各模型组pro-MMP-2、MMP－2、TIMP－1蛋白含量均较对照组增加,尤其7、14及28d组MMP－2较前明显增多。而MMP－9变化不很明显。提示在肺纤维化形成过程中,pro-MMP-2、MMP－2及TIMP－1都有所增高,MMP／TIMP比例失衡是最终导致肺间质纤维化形成的重要因素。     

小鼠β2m正反义核酸表达载体转染NIH3T3细胞后的表达

目的:探讨小鼠β₂m正、反义核酸表达载体pcDNA3-β₂mSN和pcDNA3-β₂mAN对NIH3T3细胞表达β₂m的影响, 为降低MHCⅠ类分子表达的研究提供新方法和实验依据。方法:本研究应用分子生物学技术,构建小鼠β₂m正、反义核酸表达载体pcDNA3-β₂mSN和pcDNA3-β₂mAN,用脂质体转染NIH3T3细胞。经过RT-PCR及Western blot检测,观察正、反义核酸对细胞β₂m mRNA和蛋白表达的影响。 结果: 小鼠β₂m正、反义核酸表达载体成功导入NIH3T3细胞中,且有效表达,转染正义核酸的细胞β₂m mRNA和蛋白表达水平升高,而转染反义核酸则β₂m mRNA和蛋白表达水平降低。 结论:小鼠β₂m反义核酸表达载体pcDNA3-β₂mAN可以降低NIH3T3细胞β₂m基因的表达,本研究结果为降低MHCⅠ类分子的表达、解决同种异体排斥反应提供了新的研究方法和途径。     

微囊化NGF基因修饰NIH3T3细胞对体外培养的组织工程皮肤功能的影响

神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)能促进周围神经再生,还能加速创面收缩和再上皮化。本实验采用微囊和组织工程研究技术,探讨构建微囊化转NGF基因NIH3T3细胞复合组织工程真皮的可行性及其生物效应。我们将NGF基因修饰的NIH3T3细胞包裹在海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊内体外培养,夹心ELISA法测定其上清NGF含量,将此微囊与人表皮细胞、成纤维细胞共培养一周后行MTT、羟脯氨酸(HP)测定、超微结构及组织形态学观察。用组织工程皮肤培养系统构建复合微囊的组织工程真皮,HE染色、羟脯氨酸测定和扫描电镜观察其生物功能及活性。我们发现:转NGF基因微囊体外培养8周,仍稳定分泌NGF,能促进人表皮细胞增殖,促进人成纤维细胞分泌胶原,复合组织工程真皮后仍保持此功能。因此,将微囊和转基因技术结合构建组织工程皮肤是可行的。     

转染Smad7基因的大鼠肾系膜细胞基质金属蛋白酶2及其组织抑制因子2表达的改变

目的　通过对大鼠肾小球系膜细胞 (mesangialcell,MsC)转染Smad 7基因 ,观察转染阳性细胞克隆基质金属蛋白酶 2 (MMP 2 )及其组织抑制因子 2 (TIMP 2 )表达的改变 ,以进一步阐明Smad7阻断肾组织纤维化过程的作用机制。方法　经脂质体介导将含有Smad 7重组表达质粒转染大鼠MsC ,用G4 18筛选及Western印迹分析、逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)法鉴定 ;又分别采用Western印迹分析、酶谱分析法和RT PCR法 ,检测转染阳性细胞克隆MMP 2和TIMP 2表达改变。结果　成功建立高表达Smad 7的阳性MsC克隆 (S 2 2 ,S 2 6 ) ,并证实其MMP 2蛋白分泌和酶活性均明显升高 ,而TIMP 2mRNA及其蛋白的表达则被明显抑制。阳性MsC克隆S 2 2 ,S 2 6细胞分泌MMP 2比对照组高约 3 8倍 (P <0 0 1) ;S 2 2与S 2 6细胞TIMP 2蛋白表达约为对照组 4 8% (P <0 0 5 )。结论　Smad 7可能通过增强肾组织内MMP 2酶活性和抑制TIMP 2的生成而起到减轻肾组织纤维化进展的作用。     

HBV转基因小鼠CD4＋CD25＋调节性T细胞免疫抑制功能的研究

目的通过对HBV转基因小鼠CD4＋、CD4＋CD25＋调节性T细胞数量和免疫抑制功能的研究,探讨CD4＋CD25＋调节性T细胞在乙肝免疫耐受中的作用。方法用流式细胞术对12只HBV转基因小鼠和12只正常小鼠外周血CD4＋、CD4＋CD25＋调节性T细胞的频率进行检测;磁珠分选小鼠脾CD4＋CD25-T细胞和CD4＋CD25＋T细胞,分为HBsAg刺激组和ConA刺激组体外单独和共培养,ELISA方法检测诱生的细胞因子IL-2。结果与正常小鼠比较,HBV转基因小鼠外周血CD4＋、CD4＋CD25＋调节性T细胞数量差异无统计学意义（P〉0.05）。HBsAg刺激组,CD4＋CD25-T细胞单独或共培养,HBV转基因小鼠CD4＋CD25-T细胞诱生IL-2水平显著低于正常小鼠（P〈0.01）;ConA刺激组,HBV转基因小鼠CD4＋CD25-T细胞诱生IL-2水平与正常小鼠相比则差异无统计学意义（P〉0.05）;两组小鼠CD4＋CD25-T细胞单独培养时诱生IL-2水平均显著高于共培养（P〈0.01）。结论与正常小鼠比较,HBV转基因小鼠CD4＋、CD4＋CD25＋调节性T细胞数量和免疫抑制功能差异无统计学意义,但T细胞水平对乙肝病毒存在特异性免疫耐受。CD4＋CD25＋调节性T细胞可抑制CD4＋、CD8＋T细胞。     

小鼠NGE基因真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的：构建小鼠β-NGF基因真核表达载体并观察其稳定转染的NIH 3T3细胞系中NGF的表达情况。方法：用基因重组技术，将小鼠β-NGF的成熟cDNA序列及其前导序列，克隆到真核表达载体pcDNA3．1 中，用限制性内切酶酶切鉴定重组体。利用脂质体FuGENET^TM6方法，转染NIH3T3细胞。转染后72h，用G418筛选阳性克隆并培养至20d。对阳性克隆培养上清中NGF的表达用Western blot分析并观察该上清中NGF对PCI2细胞突起生长的作用。结果：β-NGF基因在NIH3T3细胞中获得表达。阳性克隆培养上清能促进PC12细胞突起生长。结论：重组真核表达载体PcDNA3．1 ／NGF构建成功，NGF蛋白在NIH3T3细胞中表达，并具有良好的生物学活性，为进一步开展NGF基因治疗神经系统疾病奠定了基础。     

小鼠NGF基因真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的 :构建小鼠 β NGF基因真核表达载体并观察其稳定转染的NIH 3T3细胞系中NGF的表达情况。方法 :用基因重组技术 ,将小鼠 β NGF的成熟cDNA序列及其前导序列 ,克隆到真核表达载体 pcDNA3.1+中 ,用限制性内切酶酶切鉴定重组体。利用脂质体FuGENETM6方法 ,转染NIH 3T3细胞。转染后 72h ,用G4 18筛选阳性克隆并培养至 2 0d。对阳性克隆培养上清中NGF的表达用Westernblot分析并观察该上清中NGF对PC12细胞突起生长的作用。结果 :β NGF基因在NIH 3T3细胞中获得表达。阳性克隆培养上清能促进PC12细胞突起生长。结论 :重组真核表达载体 pcDNA3.1+/NGF构建成功 ,NGF蛋白在NIH 3T3细胞中表达 ,并具有良好的生物学活性 ,为进一步开展NGF基因治疗神经系统疾病奠定了基础     

含稳定整合pMCLacI／Neo质粒的NIH3T3细胞体外突变研究？…

目的 建立一个用于比较研究哺乳动物细胞内表达基因和沉默基因的突变机理的实验模型。方法 以脂质体转染法将线性化的ｐＭＣＬａｃＩ／Ｎｅｏ质粒导入ＮＩＨ３Ｔ３细胞,用Ｇ４１８筛选,造反一个药物抗性细胞克隆进行扩增,用基因组Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交,ＲＴ－ＰＣＲ及ＲＴ－ＰＣＲ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交进行了分子鉴定。结果 （１）在此细胞克隆的基因组中整合有ｐＭＣＬａｃＩ／Ｎｅｏ质粒;（２）该质粒上的两个ｌａｃＩ靶     

金属蛋白酶组织抑制因子转染骨髓间充质干细胞静脉输入治疗缺血性心肌病

背景：金属蛋白酶组织抑制因子1可能通过抑制基质金属蛋白酶活性降低干细胞侵袭能力,提高其归巢修复能力。 目的：观察转染金属蛋白酶组织抑制因子1基因骨髓间充质干细胞移植修复损伤心肌的能力。 方法：开胸结扎SD大鼠冠状动脉前降支建立心肌梗死模型,1周后随机分组：空白组经尾静脉内注射DMEM悬液;干细胞组经尾静脉内注射含1×10⁷骨髓间充质干细胞的DMEM悬液;绿色荧光蛋白-干细胞组经尾静脉内注射转染带有绿色荧光蛋白基因慢病毒空载体的骨髓间充质干细胞(1×10⁷)DMEM悬液;TIMP-1-shRNA-干细胞组经尾静脉内注射转染TIMP-1-shRNA的骨髓间充质干细胞(1×10⁷)DMEM悬液。 结果与结论：造模后,4组大鼠心脏功能受损,收缩能力下降,治疗4周后心脏功能均有不同程度改善：与空白组比较,干细胞组、绿色荧光蛋白-干细胞组、TIMP-1-shRNA-干细胞组心脏收缩功能明显提高(P < 0.05),心肌梗死面积百分比明显缩小(P < 0.05),梗死区毛细血管密度明显增加(P < 0.05),且TIMP-1-shRNA-干细胞组改善程度优于干细胞组、绿色荧光蛋白-干细胞组(P < 0.05)。说明转染金属蛋白酶组织抑制因子1基因的骨髓间充质干细胞移植能够明显改善损伤心肌功能,修复缺血性心肌病。     

表没食子儿茶素-3-没食子酸酯抑制小鼠皮肤外伤愈合组织基质金属蛋白酶1的表达

目的 探讨50 mg/L表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)对小鼠皮肤外伤愈合组织基质金属蛋白酶1(MMP-1) mRNA表达及MMP-1水平的影响。 方法 将57只小鼠随机分为对照组(含无损伤组和损伤对照组)、50 mg/L EGCG处理组和辅料组,除无损伤组为3只外,其余各组均为18只,然后分别于损伤后6、12、24、72、120、168 h取损伤愈合皮肤。利用RT-PCR和酶联免疫吸附法(ELISA)检测皮肤外伤愈合期间损伤愈合组织MMP-1 mRNA表达水平和MMP-1含量。 结果 检测结果表明,50 mg/L EGCG 能在皮肤外伤愈合晚期(72 h后)抑制损伤愈合组织MMP-1 mRNA表达,降低MMP-1含量。 结论 EGCG对皮肤外伤愈合、晚期愈合组织MMP-1 mRNA表达和MMP-1生成具有抑制作用,提示50 mg/L的EGCG能促进皮肤外伤愈合。     

芪参二莲汤对肝纤维化大鼠基质金属蛋白酶-1及 抑制因子的影响

目的 研究不同剂量芪参二莲汤对肝纤维化大鼠基质金属蛋白酶-1及抑制因子变化的影响。方法 于2017年6月~8月选择90只SD雄性大鼠作为研究对象,按照体质量随机分为6组,每组15只,其中1组为正常组,其余5组均为肝纤维化模型,将其分为模型组、秋水仙碱组以及芪参二莲汤低剂量组（5 g/kg）、中剂量组（10 g/kg）和高剂量组（15 g/kg）;各给药组分别给予相应的药物灌胃,正常组、模型组则给予生理盐水灌胃;对比各组大鼠MMP-1和TIMP-1水平以及肝纤维化指标水平。结果 正常组与模型组比较,后者的MMP-1、MMP-1/TIMP-1水平明显降低,而TLISA-1水平则明显升高,差异有统计学意义（P＜0.05）;模型组与各给药组比较,各给药组的MMP-1、MMP-1/TIMP-1水平较模型组升高,而TIMP-1水平则较模型组降低,差异有统计学意义（P＜0.05）,且给药组中,以芪参二莲汤高剂量组的变化水平最为显著,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 15 g/kg高剂量的芪参二莲汤用于治疗肝纤维化大鼠,能够有效促进MMP-1表达、减少TIMP-1表达,进而起到逆转肝纤维化的作用。     

登革2型病毒NGC株E基因在NIH3T3细胞中的表达？…

目的 构建登革２型病毒Ｅ基因的真核表达载体,实现登革病毒Ｅ蛋白的真核表达。方法 采用逆录－多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增登革２型病毒（ＮＧＣ株）包膜糖蛋白Ｅ基因全长片段,克隆人真核表达载体ｐｃＤＮＡ３的Ｐｃｍｖ启动子下游,构建重组真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－Ｅ,用脂质体转染法转染ＮＩＨ３Ｔ３细胞,表达产物以免疫荧光、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和蛋白质印迹进行分析检测。结果 成功构建了重组真核表达质粒ｐｃＤＮ     

重组跨模型人CD55分子在小鼠NIH3T3细胞上的表达及其补体溶破保护功能的研究

目的：在小鼠NIH3T3细胞转染表达人天然GPI锚固型CD55和重组跨膜型CD55-TM分子，观察比较它们对人补体溶破异源细胞的抑制功能。方法：将带有CD55cDNA、CD55-TMcDNA的重组逆病毒表达质粒CD55-pLXSN、CD55TM-pLXSN经脂腩体法转染PA317细胞，用病毒上清感染小鼠成纤维母细胞NIH3T3。经G418加压筛选，利用FACS检测获得表达CD55和CD55-TM分子的阳性细胞克隆，通过MTT比色法比较两种分子对人血清补体溶破细胞的抑制功能有无差别。结果：细胞转染筛选获得多个表达跨膜型人CD55分子的NIH3T3细胞克隆，补体杀伤试验证实其具有抑制人补体溶破的功能，且两种分子的补体抑制功能无明显差异。结论：成功地建立了稳定表达天然CD55、跨膜型CD55分子的小鼠NIH3T3细胞，证实其表达的GPI型CD55分子和CD55TM分子均具有抑制人补体溶破细胞的功能，为进一步探讨应用跨膜型的CD55分子对PNH进行基因治疗奠定了基础。     

shRNAs 介导的EM>Smad2/EM> 基因在小鼠成纤维细胞NIH/3T3中表达的沉默

目的 通过构建5个shRNA表达质粒,对转化生长因子β/Smads信号通路中受体调节性Smads蛋白中的Smad2的表达进行抑制.方法 针对鼠Smad2基因的mRNA序列,设计合成了5条shRNA-Smad2 DNA序列,分别插入至shRNA表达载体中,获得了5个shRNA-Smad2表达质粒,将shRNA表达质粒转染NIH/3T3细胞,采用半定量RT-PCR和Western blotting方法,检测shRNA表达质粒对Smad2表达的抑制效果.结果 编号为2.4的shRNA-Smad2表达质粒能够显著降低Smad2的表达,同时发现由不同的shRNA-Smad2表达质粒组成的RNAi池,产生的抑制效果比单个RNAi表达质粒的抑制效果明显提高.结论 成功地构建了特异、高效抑制Smad2表达的shRNA表达质粒.     

重组跨膜型人CD55分子在小鼠NIH3T3细胞上的表达及其补体溶破保护功能的研究

目的 :在小鼠NIH3T3细胞转染表达人天然GPI锚固型CD5 5和重组跨膜型CD5 5 TM分子 ,观察比较它们对人补体溶破异源细胞的抑制功能。方法 :将带有CD5 5cDNA、CD5 5 TMcDNA的重组逆病毒表达质粒CD5 5 pLXSN、CD5 5TM pLXSN经脂质体法转染PA317细胞 ,用病毒上清感染小鼠成纤维母细胞NIH3T3。经G418加压筛选 ,利用FACS检测获得表达CD5 5和CD5 5 TM分子的阳性细胞克隆 ,通过MTT比色法比较两种分子对人血清补体溶破细胞的抑制功能有无差别。结果 :细胞转染筛选获得多个表达跨膜型人CD5 5分子的NIH3T3细胞克隆 ,补体杀伤试验证实其具有抑制人补体溶破的功能 ,且两种分子的补体抑制功能无明显差异。结论 :成功地建立了稳定表达天然CD5 5、跨膜型CD5 5分子的小鼠NIH3T3细胞 ,证实其表达的GPI型CD5 5分子和CD5 5TM分子均具有抑制人补体溶破细胞的功能 ,为进一步探讨应用跨膜型的CD5 5分子对PNH进行基因治疗奠定了基础。     

肝门静脉海绵样变性模型大鼠组织抑制因子及基质金属蛋白酶表达 与周围血管新生

背景：目前国内外尚无有效治疗肝门静脉海绵样变性的策略,且其病因的基础研究报道较为鲜见。 目的：拟建立大鼠门静脉海绵样变性模型,检测基质金属蛋白酶2,9,基质金属蛋白酶组织抑制剂1,2在大鼠门静脉及其周围组织的表达及周围血管新生中的作用。 方法：SD大鼠80只随机分为3组。以门静脉部分缩窄法复制门静脉海绵样变性的大鼠模型,以21 G钝针头操作。模型组和假手术组分别设术后2,4,6周3个时间点,对照组即不做任何处理的正常SD大鼠(造影后取材)。各组分别于处理后不同时间点行门静脉造影,免疫组织化学检测血管内皮细胞标记物CD31观察门静脉周围血管变化,并使用实时荧光定量PCR和免疫组织化学法检测大鼠门静脉及其周围组织的基质金属蛋白酶2,9,基质金属蛋白酶组织抑制剂1,2 mRNA的含量和蛋白的表达。 结果与结论：门静脉造影及血管内皮细胞标记物CD31免疫组织化学显示,模型组门静脉周围新生血管明显增多。RT-PCR与免疫组织化学结果分析显示：对照组和假手术组基质金属蛋白酶2 mRNA及蛋白表达均较同期模型组低(P < 0.01,P < 0.05),基质金属蛋白酶9 mRNA及蛋白表达均较同期模型组低。模型组基质金属蛋白酶组织抑制剂1,2各个时间段的表达水平与对照组和假手术组相比差异无显著性意义(P > 0.05);模型组造模后第2周基质金属蛋白酶2/基质金属蛋白酶组织抑制剂2比值明显高于对照组和假手术组同期(P < 0.05)。结果提示,构建的门静脉海绵样变性的模型大鼠死亡率低,成模率高,且比较稳定。基质金属蛋白酶2,9表达升高以及基质金属蛋白酶2/基质金属蛋白酶组织抑制剂2的比值失衡,可能是大鼠门静脉海绵样变周围血管新生的分子机制之一。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植;肝移植;移植;心脏移植;组织移植;皮肤移植;皮瓣移植;血管移植;器官移植;组织工程全文链接：     

小鼠精子发生相关蛋白3基因在小鼠生精细胞的特异表达及对HEK 293T细胞凋亡和自噬的影响

目的检测小鼠精子发生相关蛋白3(spata3)基因在小鼠生精细胞的表达情况,并借助过表达细胞模型进一步分析该基因对人胚肾HEK 293T细胞凋亡及自噬的影响,旨在探讨spata3在精子发生过程中的意义。方法分别采用RT-PCR和免疫印迹法检测spata3基因mRNA及蛋白产物在小鼠各组织中的表达;应用免疫组织化学和免疫荧光染色观察SPATA3蛋白在生精细胞中的定位;借助脂质体将真核表达载体Plv-EGFP-2(a)purospata3瞬时转染HEK 293T细胞,进一步在蛋白水平分析细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)、BAX和Bcl-2及自噬相关蛋白LC3A/B的变化。结果 Spata3基因及其编码产物在小鼠睾丸组织特异表达;粗线期精母细胞和圆形精子细胞的胞质与胞核均有显著SPATA3蛋白的阳性着色,长形精子细胞的胞质也有大量分布;过表达spata3的HEK 293T细胞内活化型Caspase-3和PARP降解产物的含量较对照组差异无显著性,BAX表达量0.815±0.020较裸细胞组0.469±0.012和空载体转染组0.588±0.018均有所增高,Bcl-2含量0.214±0.020低于裸细胞0.507±0.021和空载体转染组0.545±0.024,LC3A/B-Ⅱ的表达量0.741±0.037则显著高于裸细胞组0.136±0.011和空载体转染组0.169±0.012。结论 Spata3基因在小鼠生精细胞特异表达,过表达spata3对HEK 293T细胞凋亡无明显影响,但可以促进细胞自噬。