通过受体介导法将核酶特异导入肝细胞以阻断HBV蛋白表达的初步研究

应用半乳糖末端糖蛋白受体（ＡＳＧＰ－Ｒ）介导的内吞作用，将外源基因导入真核细胞，与脂质体介导的转染和细胞表面转铁蛋白受体（Ｔｆ－Ｒ）介导的内吞作用相比，虽然三种方式均能有效介导外源基因的转移，但ＡＳＧＰ－Ｒ法具有肝细胞特异性，而脂质体法和Ｔｆ－Ｒ法不具此特性。将克隆于真核表达载体的针对乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）ｍＲＮＡＰｒｅＣ／Ｃ区的核酶质粒ｐＣＭＶ－Ｒｉｐｃ特异性导入肝细胞并发挥作用，通过酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）检测细胞培养液中的乙型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）和ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ），评价核酶在细胞水平对ＨＢＶ抗原表达的阻断作用。结果表明当核酶质粒ｐＣＭＶ－Ｒｉｐｃ与ＨＢＶ抗原表达质粒ｐＵＣ－２ＨＢＶ共转染ＨｅｐＧ２细胞时，核酶对ＨＢｓＡｇ和ＨＢｅＡｇ表达的抑制率分别为５５．２９％和６８．７３％。     

逆转录病毒载体介导乙型肝炎病毒反义基因的转录表达

为了探索在真核细胞内转录表达乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）反义核酸的方法，用基因重组技术将ＨＢＶ前Ｃ／Ｃ基因（ＰｒｅＣ／Ｃ）和前Ｓ／Ｓ基因（ＰｒｅＳ／Ｓ）片段反向插入逆转录病毒载体质粒，再将重组体分别转染ＰＡ３１７包装细胞，进而获得能够介导ＨＢＶ反义基因向小鼠ＮＩＨ３Ｔ３细胞转移表达的重组逆转录病毒。经分子杂交试验表明，含有ＨＢＶ反义基因的重组逆转录病毒序列已经整合到转染的ＰＡ３１７细胞染色体上；转导的ＮＩＨ３Ｔ３细胞内有ＨＢＶ反义ＲＮＡ转录表达。结论：逆转录病毒载体包装细胞系统能够介导ＨＢＶ反义基因在真核细胞中转录表达，因而有可能利用反义技术和基因转移方法进行抗－ＨＢＶ基因治疗     

乙型肝炎病毒在丁型肝炎病毒包装中的作用机理研究

用含ＨＢＶ全基因和ＨＢＶ大、中、小分子表面蛋白基因的真核细胞表达质粒（ＣＭＶ－ＨＢＶ、ＣＭＶ－ＬＳ、ＣＭＶ－ＭＳ、ＣＭＶ－Ｓ）分别与含ＨＤＶ ｃＤＮＡ三聚体的重组质粒共转染ＣＨＯ细胞。转染后３天在上述４种转染细胞内及培养上清中均检出了ＨＤＶ ＲＮＡ和ＨＤＡｇ表明上述４种转染细胞的培养上清中均有ＨＤＶ病毒颗粒的包装和分泌。提示：ＨＤＶ病毒的包装可能仅需ＨＢＶ Ｓ 基因及其小分子表面蛋白的辅助。     

表达HBsAg和HBeAg小鼠成纤维胞膜型的建立

目的：建立表达乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）主要基因产物的细胞克隆，为研究ＨＢＶ的生物学性状及其致病机制提供细胞模型；方法：应用磷酸钙沉淀技术将环化的３．２ｋｂ ＨＢＶＤＡＮ和携带新霉素抗药基因的真核细胞表达载体ｐＣＮＣＸ，导入体外培养的小鼠成纤维ＮＩＨ３Ｔ３细胞；结果：成功地获得表达ＨＢｓＡｇ和ＨＢｅＡｇ的小鼠成纤维ＮＩＨ３Ｔ３细胞克隆；结论：将ＨＢＶ基因组ＤＮＡ导入体外培养的非肝细胞，ＨＢＶ病毒的ＨＢ     

针对包装信号起始区的硫代反义核苷酸抗HBV的研究

目的筛选高效特异的抗ＨＢＶ反义核酸药物。方法针对ＨＢＶ包装信号ε起始区设计并合成硫代反义寡聚核苷酸（ｓ－ａｓＯＤＮ）片段，通过ＥＬＩＳＡ检测法、ＭＴＴ法、电子显微镜等观察，研究此ｓ－ａｓＯＤＮ对ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ和ＨＢｃＡｇ表达，以及对细胞毒性，细胞形态的影响。结果针对ε起始区的ｓ－ａｓＯＤＮ显著抑制ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ和ＨＢｃＡｇ的表达，其中，对ＨＢｅＡｇ和ＨＢｃＡｇ的抑制率分别为３８．１％和５８．７％高于Ｓ基因起始区（３２．１％和３７．２％，Ｐ＜０．０１），对ＨＢｓＡｇ抑制率为８２％，低于Ｓ基因起始区（９３．４１％），在实验浓度下ｓ－ａｓＯＤＮ对细胞无毒性，对细胞形态无影响。结论ＨＢＶ包装信号区是反义核酸抗ＨＢＶ复制研究的重要的靶序列选择区域。     

丙型肝炎患者外周血单个核细胞HCV感染的电镜研究

目的 以常规电镜和免疫电镜技术,发现和证实慢性丙型肝炎患者外周血单个核细胞９ＰＢＭＣｓ）内丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）颗粒。试图在病毒形态学和形态发生学上证实ＰＢＭＣｓ的ＨＣＶ感染和复制。方法 以逆转录多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）和免疫组织化学方法,分别检测２８例患者ＰＢＭＣｓ内ＨＣＶ ＲＮＡ和ＨＣＶＡｇ,对其中阳性标本重点进行电镜研究。结果 ＨＣＶ ＲＮＡ和ＨＣＶ Ａｇ阳性检出率分别为７７．２７％（１     

抗HBV最佳反义寡核苷酸片段的体外筛选

目的 寻找抗ＨＢＶ最佳反义寡核苷酸区段。方法 合成４种互补于ＨＢＶ不同区段的反义硫代寡核酸（ａｓＯＮ）,加入ＨＢＶ基因转染的肝癌细胞模型ＨｅｐＧ２２．２．１５,以ＥＬＳＡ法测定ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ含量。结果 互补于ｐｒｅ－Ｓ２翻译起始区的ａｓＯＮ（序列Ⅰ）抗ＨＢＶ基因表达作用最强（Ｐ〈０．０２）,对ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ的最高表达抑制率分别为６６％和９１％,针对增强Ⅱ（ＥＮⅡ）的序列Ⅲ也有较强的     

乙型肝炎病毒e抗原的纯化及其在人血清抗体检测中？…

目的 方法利用Ｚｈｏｕｊｉａｎ教授提供的重组质粒ＤＮＡ ｐＢＶ２２０／ｅＡｇ，转染ＤＨ５＾α细胞经３０℃培养３小时，４２℃培养６小时温度诱导后，提取乙型肝炎病毒ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）。经ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ层折 纯化后免疫打点分析，收集阳性蛋白。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳，考马斯亮蓝Ｇ２５０染色，显为单一的蛋白带，用免疫印迹法（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）和免疫打点（ｌｍｍｕｎ     

乙型肝炎病毒e抗原的纯化及其在人血清抗体检测中的应用

目的方法利用ＺｈｏｕＪｉａｎ教授提供的重组质粒ＤＮＡｐＢＶ２２０／ｅＡｇ，转染ＤＨ５α细胞，经３０℃培养３小时，４２℃培养６小时温度诱导后，提取乙型肝炎病毒ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）。经ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ层折纯化后免疫打点分析，收集阳性蛋白。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳，考马斯亮蓝Ｇ２５０染色，显示为单一的蛋白带，用免疫印迹法（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ）和免疫打点（ｌｍｍｕｎｏｄｏｔ）法，确定表达产物的特异性。将纯化的ＨＧｅＡｇ用酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）和免疫条。方法基检测人血清中的相关抗体。结果经４９例乙型肝炎病毒ｅ抗体（ＨＢｅＡｂ）阳性病人血清检验证实了其特异性。结论免疫条方法较ＥＬＩＳＡ方法更敏感、特异。     

乙型肝炎病毒感染者癌基因蛋白的表达及与HBeAg的关系

目的为了阐明癌基因蛋白异常表达与乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）复制的关系。方法用链霉菌素－生物素（ＳＬＡＢ）免疫组织化学染色和酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）方法，检测了６４例慢性ＨＢＶ感染者肝细胞中Ｃ－ｅｒｂＢ－２Ｐ１８５、ｒａｓＰ２１和Ｐ５３等癌基因蛋白和血清乙型肝炎病毒ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）。结果Ｃ－ｅｒｂＢ－２Ｐ１８５和ｒａｓＰ２１阳性组中，血清ＨＢｅＡｇ的阳性检出率分别为８９４％和８４６％，而阴性组ＨＢｅＡｇ的检出率分别为２０％和４８％，两组差异显著。结论表明癌基因蛋白Ｃ－ｅｒｂＢ－２Ｐ１８５和ｒａｓＰ２１的异常表达与ＨＢＶ复制密切相关。     

受体导向药物L-HSA-Ara-AMP对乙型肝炎病毒抑制作用的临床初探

目的为初步试探受体导向药物Ｌ－ＨＳＡ－Ａｒａ－ＡＭＰ的抗病毒效果。方法应用５天疗法治疗慢性乙型肝炎１０例，并以Ａｒａ－ＡＭＰ为对照。结果治疗组ＨＢｓＡｇ无变化，１０例ＨＢｅＡｇ阳性者阴转３例，滴度下降６例，４例抗－ＨＢｃＩｇＭ阳性均阴转，８例ＨＢＶＤＮＡ阳性阴转４例，浓度下降４例，未发现任何毒副反应。结论显示该药对ＨＢＶ复制指标的近期抑制效果与Ａｒａ－ＡＭＰ相近或略优，但日剂量仅为后者的１／７。     

HBcAg/HBeAg对慢性乙型肝炎患者PBMC中Th1/Th2类细胞应答的影响

目的 探讨ＨＢｃＡｇ／ＨＢｅＡｇ对慢性乙型肝炎患者ＰＢＭＣ中Ｔｈ１／Ｔｈ２类细胞应答的影响。方法 用套式ＰＣＲ法检测６４便慢性ＨＢＶ感染者ＰＢＭＣ中ＨＶＢ ＤＮＡ;分别用ＰＨＡ、ＨＢｃＡｇ和ＨＢｅＡｇ体外培养;ＥＬＩＳＡ法检测ＰＢＭＣ产生Ｔｈ１类细胞因子（ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ）和Ｔｈ２类细胞因子（ＩＬ－４、ＩＬ－１０）的含量。结果 表明ＨＢＶ ＤＮＡ阳性组和阴性组相比,无论是在ＰＨＡ还是在ＨＢｃＡ     

外周血单个核细胞中乙型肝炎病毒感染的研究进展

乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）感染乙肝（ＨＢ）患者外周血单个核细胞（ＰＢＭＣｓ），ＨＢＶ－ＤＮＡ以游离和整合型两种形式存在于ＰＢＭＣｓ内。在ＰＢＭＣｓ内复制与表达。研究ＰＢＭＣｓ内ＨＢＶ感染对于探讨ＨＢ的临床进程、治愈和指导治疗等均具有重要的意义。最近提出了一种与上述相反的观点，ＰＢＭＣｓ内有关的ＨＢＶ－ＤＮＡ和ＲＮＡ是吸附的结果，而非病毒的复制。     

外周血单个核细包中乙型肝炎病毒感染的研究进展

乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）感染乙肝（ＨＢ）患者外用血单个核细胞（ＰＢＭＣｓ），ＨＢＶ－ＤＮＡ以游离和整合型两种形式存在于ＰＭＢＣｓ内。在ＰＢＭＣｓ内复制与表达。研究ＰＢＭＣｓ内ＨＢＶ感染对于探讨ＨＢ的临床进程、治愈和指导治疗等均具有重要的意义。最近提出了一种与上述相反的观点，ＰＢＭＣｓ内有关的ＨＢＶ－ＤＮＡ和ＲＮＡ是吸附的结果，而非病毒的复制。     

应用重组质粒pAM－HBsAg在果蝇细胞中表达乙型肝炎病毒表面抗原及基因免疫的初步研究

应用果蝇（ＤＳ２）表达系统，构建了含有乙型肝炎病毒表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、摄金蛋白启动子（ＭＴｎ－ｐｒｏｍｏｔｅｒ）的共表达质粒ｐＡＭ－ＨＢｓＡｇ，转染细胞，经克隆，存活细胞株的培养上清液经硫酸铵沉淀、氯化铯（ＣＳＣｌ）密度梯度离心沉淀，获得的抗原用酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫分析（ＲＩＡ）法检测抗体，免疫吸印法（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ）和电泳凝胶银染显色证实分子量为２３０００和２７０００，免疫电镜观察显示表达产物为２２ｕｍ球型颗粒，通过重金属离子（ＣｕＳＯ４、ＺｎＳＯ４）的诱导可增加抗原的表达量。用共表达质粒ｐＡＭ－ＨＢｓＡｇ的ＤＮＡ，注射Ｂａｌｂ／Ｃ小鼠的股四头肌。经ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ检测抗体产生情况，结果免疫后的小鼠经硫酸锌喂养抗体高于普通喂养的小鼠。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证实鼠肌肉细胞存在ＨＢｓＡｇ基因。小鼠免疫接种实验表明，ＤＳ２细胞表达的抗原与直接用ＤＮＡ含有ＨＢｓＡｇ的重组质粒）免疫小鼠均获抗ＨＢｓＡｇ的抗体。     

HBV-SAg特异性靶细胞系的构建

目的　研究特异性细胞免疫反应在病毒性肝炎发生发展中的作用及观察药物等对细胞免疫反应的影响。方法　用ＤＮＡ 重组技术构建逆转录病毒重组质粒ＰＬＸＳＮＳ，以电穿孔方法转入ＰＡ３１７ 细胞，筛选高表达克隆，收集其假病毒颗粒感染ＥＬ４ 细胞，经有限稀释选择高表达克隆。结果　重组质粒转染ＰＡ３１７ 细胞后，５３ 个克隆形成（１∶１０ 传代），在２４ 孔板中扩增后有７ 个克隆细胞上清ＨＢｓＡｇ 阳性。用ＨＢｓＡｇ Ａ值（曾称ＯＤ值） 最高克隆的假病毒感染ＥＬ４ 细胞，再经有限稀释得到稳定、高效表达ＨＢｓＡｇ 的靶细胞系（ＥＬ４Ｓ），在体外传１００ 代以上，ＨＢｓＡｇ 仍能高效表达（４８ 小时上清中ＨＢｓＡｇ 的Ａ值达０－８５）。经检测ＰＬＸＳＮＳ及重组腺病毒ｒＡｄＢ７２Ｓ免疫后小鼠对ＨＢｓＡｇ 特异的细胞免疫反应，得到较为满意的结果。结论　我们成功构建了稳定表达ＨＢｓＡｇ 的靶细胞，对研究ＨＢｓＡｇ 细胞免疫反应及乙肝免疫发病机理等方面有重要意义     

TIMP-3基因转染抑制人肺癌细胞系侵袭与转移的研究

目的探讨金属蛋白酶组织抑制因子３（ＴＩＭＰ３）对高转移性人肺巨细胞癌细胞系（ＢＥ１）恶性表型的影响。方法构建含全长人ＴＩＭＰ３ｃＤＮＡ的真核表达载体,用脂质体法转入ＢＥ１细胞。检测转染后ＢＥ１细胞的体外侵袭及裸鼠体内成瘤性及转移能力的变化。结果ＢＥ１细胞在转入ＴＩＭＰ３ｃＤＮＡ后表达ＴＩＭＰ３ｍＲＮＡ,与母系及空载体对照相比,体外侵袭力降低,在裸鼠体内成瘤率降低（对照组６／６只,实验组９／１２只）,成瘤潜伏期延长,转移至肺和淋巴结的能力降低（对照组分别为５／６只和６／６只;实验组分别为１／１２只和５／１２只）。结论特异性上调ＴＩＭＰ３基因的表达可在一定程度上逆转ＢＥ１细胞的恶性表型     

乙型肝炎病毒S基因129Leu和145Arg变异株的抗原表达？…

目的 研究我国发现的乙型病毒Ｓ基因突变株表达ＨＢｓＡｇ及ＤＮＡ免疫的特性。方法 用自乙肝疫苗免疫无保护婴儿血清中克隆的２株变异Ｓ基因片段,置换已知核苷酸序列并可表达及复制的ＨＢＶ１．２个拷贝全基因野毒株重组质粒Ｐ３．８Ⅱ的Ｓ基因,将重组质粒转染ＨｅｐＧ２细胞,用Ａｂｂｏｔｔ试剂和２４种单抗检测染细胞培养上清中ＨＢｓＡｇ的结合力。用重组质粒ＨｅｐＧ２细胞,用Ａｂｂｏｔｔ试剂和２４种单抗检测转染细胞培     

受体导向药物L—HSA—Ara—AMP对乙型肝炎病毒抑制作？…

目的 为初步试探受体导向药物Ｌ－ＨＳＡ－Ａｒａ－ＡＭＰ的抗病毒效果。方法 应用５天疗法治疗慢性乙型肝炎１０例，并以Ａｒａ－ＡＭＰ为对照。结果 治疗组ＨＢｓＡｇ无变化，１０例ＨＢｓＡｇ阳性者阴转３例，滴度下降６例，４例抗－ＨＢｃ ＩｇＭ阳性均转阴，８例ＨＢＶ ＤＮＡ阳性阴转４例，浓度下降４例，未发现任何毒副反应。结论 显示该药对ＨＢＶ复制指标的近期抑制效果与Ａｒａ－ＡＭＰ相近或略优，但日剂量仅为后者     

ASODN对白细胞抗原Ⅰ类基因表达的影响

目的为观察针对乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）ｘ基因特异性反义核酸（ＡＳＯＤＮ）对２２１５细胞表面白细胞抗原Ⅰ类基因（ＨＬＡ－Ⅰ）表达的影响。方法人工合成互补于ｘ基因关键区的三段反义核酸，用流式细胞仪检测ＡＳＯＤＮ对２２１５细胞表面ＨＬＡ－Ⅰ表达的影响，细胞原位杂交观察作用细胞内ＨＬＡ－ⅠｍＲＮＡ含量变化，同时用ＰＡＰ－ＥＬＩＳＡ法检测作用细胞上清中ＨＢｘＡｇ的含量。结果三段ＡＳＯＤＮ均能抑制ＨＢｘＡｇ的表达，２２１５细胞表面ＨＬＡ－Ⅰ类抗原的表达及细胞内ＨＬＡ－ⅠｍＲＮＡ含量也降低。结论ＨＢｘＡｇ表达量的降低可能系ＡＳＯＤＮ序列特异性抑制作用所致，而ＨＬＡ－Ⅰ表达的降低可能是ＨＢｘＡｇ对ＨＬＡ－Ⅰ基因启动子的激发减少的间接结果。