熊果酸对人卵巢癌 SKOV3细胞增殖与凋亡的影响

【目的】探讨熊果酸(Ursolic acid,UA)对人卵巢癌 SKOV3细胞增殖与凋亡的影响。【方法】常规培养人卵巢癌 SKOV3细胞,应用 UA 浓度为5、10、20、40和80μmol/L 分别干预12 h、24 h 和48 h,采用 MTT 法检测细胞增殖;采用流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期变化,应用 Western blot 技术检测细胞周期相关蛋白 P21、CyclinD1的表达水平。【结果】与空白对照组(0μmol/L UA)比较,40和80μmol/L UA 分别作用 SKOV3细胞12 h、24 h 和48 h 后 OD 值均显著降低(P <0.05);10、20和40μmol/L UA 作用24 h 后 SKOV3细胞早期凋亡率、晚期凋亡率和 G0/G1期比率较对照组升高,20和40μmol/L UA 作用24 h 后 SKOV3细胞周期蛋白 Cyclin D1明显降低而 P21水平显著升高(P <0.05)。【结论】体外实验中,UA 可抑制人卵巢癌 SKOV3细胞增殖和促其凋亡,其机制可能与细胞周期蛋白 Cyclin D1表达降低和 P21表达升高有关。     

抑制凋亡相关基因PNAS-2表达后U937细胞凋亡率的改变

目的:构建并鉴定凋亡相关基因——PNAS-2的短发夹RNA(shRNA)质粒表达载体,将其转染U937细胞,筛选后检测细胞凋亡的变化。方法:shRNA质粒载体pRNAT U6.1/NEO经限制性内切酶BamHⅠ及HindⅢ双酶切后,连接带有BamHⅠ及HindⅢ黏性末端的shRNA插入片段,转化感受态细菌,并行测序鉴定。将阳性shRNA质粒载体进行细胞转染,合并使用G418及流式细胞仪(FCM)筛选出GFP阳性细胞,应用半定量PCR鉴定shRNA封闭效果;用Annexin V-APC/7-AAD标记后,使用FCM及激光共聚焦显微镜检测细胞凋亡。结果:测序鉴定证实,PNAS-2特异的shRNA质粒表达载体构建正确;合并使用G418及FCM分选出GFP阳性细胞后,半定量PCR鉴定示shRNAⅠ、Ⅱ、Ⅲ组对PNAS-2的抑制率分别为78.1%、75.4%及51.4%。FCM显示shRNA对照组的细胞凋亡率为(3.52±1.25)%;而shRNAⅠ组为(9.23±1.88)%(P<0.01);shRNAⅡ(8.85±1.80)%(P0.05)。激光共聚焦显微镜观察显示,shRNA对照组细胞凋亡率为7.3%;shRNAⅠ组为14.7%;shRNAⅡ为13.8%;shRNAⅢ为10.3%。结论:测序结果表明,本研究成功构建了PNAS-2的shRNA质粒表达载体。半定量PCR显示shRNA抑制PNAS-2表达效果佳;抑制PNAS-2后可促使细胞凋亡,提示该基因是抗细胞凋亡基因。     

靶向沉默Gli1基因表达对K562细胞增殖的影响及其机制探讨

目的 探讨靶向沉默Sonic hedgehog(Shh)信号通路的转录因子Gli1基因表达对K562细胞增殖的影响及其机制.方法 将针对Gli1的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)通过脂质体(LipofectamineTM 2000)导入K562细胞作为实验组,并以非特异性siRNA为对照组.实时定量PCR和Western blot法检测Gli1 mRNA和蛋白表达,MTT检测细胞增殖,碘化丙锭(PI)检测细胞周期,实时定量PCR检测c-myc、p21基因的表达变化.结果 转染后24 h实验组Gli1 mRNA表达水平为对照组的(52.60±3.57)%(P<0.01),转染后48 h实验组Gli1的蛋白表达水平为对照组的 (79.31±5.58)% (P<0.01).转染后24 h实验组细胞增殖率为对照组的 (94.41±3.58)% (P<0.05),48 h为对照组的(90.22 ±3.34)% (P<0.01).转染后24、48 h 实验组细胞出现G2/M期阻滞且c-myc的表达水平下降,而p21的表达水平升高 (P值均<0.05).结论 靶向沉默Gli1基因表达抑制了K562细胞的增殖,该抑制作用是通过下调c-myc基因、上调p21基因的表达实现的.     

Bmi-1沉默对K562细胞功能的影响

Bmi-1是一种转录抑制子,属于Polycomb家族成员之一。Bmi-1基因在调控正常或白血病干细胞的自我更新中起着至关重要的作用。缺乏Bmi-1表达的急性髓系白血病细胞遭遇了增殖阻止和表现了分化和凋亡的征兆,这些发现导致有人提议和认为Bmi-1在白血病治疗中可作为潜在靶点。本研究探讨靶向针对Bmi-1的短发夹RNA（shRNA）对人慢性髓系白血病K562细胞功能的影响。采用RNA干扰技术,构建靶向针对Bmi-1的shRNA真核表达载体,利用脂质体lipofactamine2000将shRNA真核表达载体转染入K562细胞中,经G418（400μg／ira）筛选得到抗性克隆。用PCR和Western blot分别检测转染shRNA后K562细胞中Bmi-1的mRNA和蛋白水平的变化;以MTT法检测干扰组、对照组和未转染组细胞间的增殖情况;以集落形成实验测定3组间集落形成能力。结果表明：在设计的4个shRNA片段中,有1个片段显示显著的抑制效果。该shRNA转染K562细胞后,在mRNA水平上Bmi-1的表达明显下调,Western blot在蛋白水平上也证实了Bmi-1表达显著下调。MTT法和集落形成实验显示了干扰组、对照组和未转染组细胞3者间的增殖能力没有显著差异。结论：抑制Bmi-1的表达并不能减少K562细胞的增殖,这提示了可能存在其它一些平行的信号通路在细胞转化中起重要作用,而且可能独立于Bmi-1的过表达。Bmi-1在慢性髓系白血病的转化中起着次要的作用。     

短发夹RNA靶向抑制环氧化酶-2基因表达对肺癌细胞A549增殖的影响

目的评价短发夹RNA（shorthairpinRNA，shRNA）靶向肺癌细胞A549环氧化酶-2（COX-2）基因表达的抑制作用，并观察对肺癌细胞A。生长和细胞周期的影响。方法将抑制COX-2基因的shRNADNA模板插入到真核表达载体pGenesil-1的U6启动子下游，构建靶向抑制COX-2基因的重组表达载体pshRNA-COX-2。将试验分为3组：未转染肺癌细胞A549组、阴性对照HK组和pshRNA-COX-2转染组。用脂质体Lipofectamine^TM 2000转染肺癌细胞A549逆转录（RT）-PCR和免疫印迹法（Wb）分别检测COX-2基因mRNA和蛋白表达情况，流式细胞术检测细胞周期，细胞计数检测细胞生长变化。结果与阴性对照组相比，pshRNA-COX-2重组表达载体抑制COX-2mRNA及蛋白表达的抑制率分别为72．2％和48．6％；G0-G1期细胞由63．7％上升为71．0％，S期细胞由26．5％下降为20．0％；细胞生长明显减慢。结论pshRNA-COX-2重组表达载体能显著抑制肺癌细胞COX-2表达，引起G0-G1期细胞增多，S期细胞减少，从而抑制肺癌细胞生长。     

NOB1影响胶质瘤细胞增殖、凋亡的实验研究

目的 利用RNA干扰（RNAi）在人胶质瘤U251和U87-MG细胞中沉默NOB1基因的表达,探讨NOB1对恶性胶质瘤细胞增殖以及凋亡的影响.方法 构建NOB1基因的短发卡（shRNA）慢病毒表达载体,包装成病毒颗粒并感染人胶质瘤U251和U87-MG细胞,采用实时定量聚合酶链反应检测NOB1在恶性胶质瘤细胞系中的表达.采用甲基噻唑基四唑（MTT）比色法和克隆形成实验检测细胞增殖和克隆形成能力情况;同时利用PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡情况,观察NOB1基因对U251和U87-MG细胞增殖、凋亡的影响.结果 NOB1基因在人胶质瘤U251、U87-MG细胞系中均明显高表达.NOB1-shRNA慢病毒能有效感染胶质瘤细胞,实验结果显示感染后U251和U87-MG细胞的增殖能力明显下降;U251克隆形成能力明显受到抑制;细胞周期在G0/G1停滞,而且细胞出现显著性凋亡;上述差异均具有统计学意义（P＜0.05）.结论 NOB1在人胶质瘤U251和U87-MG细胞中高表达;降低NOB1基因的表达,可以显著降低胶质瘤细胞的增殖,并促进胶质瘤细胞凋亡;NOB1基因在体外对胶质瘤细胞的发生发展可能具有癌基因的调节作用.     

沉默核干因子基因表达对HL-60白血病细胞凋亡的影响

本研究探讨靶向沉默白血病细胞的核干因子（nucleostemin,NS）基因对HL-60白血病细胞凋亡的影响。用T7启动子介导体外合成两条短发夹状干扰RNA（NS-shRNA）,以其中沉默NS基因作用强的一条NS-shRNA转染HL-60细胞,同时以与NS基因序列无关小干扰RNA转染HL-60细胞作对照,应用RT-PCR检测被转染的HL-60细胞NS-mRNA抑制效果,倒置显微镜下观察活体细胞形态变化,Wright-Giemsa染色观察细胞胞体和细胞核形态学变化,以流式细胞仪（FCM）和TdT介导的dUTP缺口末端标记技术（TUNEL）测定凋亡细胞数并计算凋亡阳性率。结果表明：HL-60细胞被NS-shRNA转染48小时后NS-inRNA阻断率达到74．94％,凋亡率分别为（25．32±3．06）％和（27．3±3．21）％,对照组仅（3．12±0．38）％和（3．30±1．52）％,转染组与对照组比较差异显著（P〈0．01）。Wright-Giemsa染色显示细胞发生核碎裂并出现“凋亡小体”。结论：靶向沉默NS基因表达可诱发和促进HL-60白血病细胞发生凋亡,为NS基因作为恶性肿瘤治疗的候选靶基因奠定了理论基础。     

RNA干扰Caspase-8基因及抑制细胞凋亡的作用

目的:探讨RNA干扰caspase-8基因及抑制细胞凋亡的作用效果.方法:构建针对大鼠caspase-8基因编码区的短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体质粒pRNAT-U6.1-caspase-8 shRNA,采用电穿孔的方法转染RK3E细胞,经G418筛选后,形成稳定表达caspase-8 shRNA的细胞系.实验分为3组,(1)正常对照组,未转染的RK3E细胞;(2)阴性对照组,转染空载体pRNAT-U 6.1的RK3E细胞系;(3)实验组,转染caspase-8 shRNA的RK3E细胞系.经脂多糖孵育12 h后,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,RT-PCR和Real time PCR检测mRNA的表达,以及各组caspase-8蛋白的活性.结果:与正常对照组和阴性对照组相比,实验组的细胞凋亡率显著降低(P＜0.01),caspase-8的mRNA水平和蛋白活性显著降低(P＜0.01).结论:针对caspase-8的特异性shRNA可以明显引起靶基因的沉默,进而抑制细胞凋亡的发生.     

抑制Skp2基因表达对NK/T细胞淋巴瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的:研究抑制Skp2基因表达对NK/T细胞淋巴瘤细胞系HANK1细胞增殖和凋亡的影响,探讨抑制Skp2基因表达治疗NK/T细胞淋巴瘤的潜在应用价值。方法:用RNA干扰(RNA interference,RNAi)方法抑制HANK1细胞Skp2基因表达,实时定量RT-PCR和Western blot检测Skp2基因表达,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期分布和细胞凋亡。结果:Skp2-shRNA表达载体明显抑制HANK1细胞Skp2基因表达,细胞增殖受抑,细胞周期G1期停滞,凋亡细胞增多。结论:抑制Skp2蛋白功能可能是治疗NK/T细胞淋巴瘤的好方法,值得深入研究。     

miR-153在卵巢癌中的表达及其生物学功能

目的分析mi R-153在卵巢癌中的表达,并探讨mi R-153的生物学作用。方法荧光定量PCR法检测卵巢癌组织及细胞中mi R-153的表达水平;转染mi R-153类似物(mimics)至SKOV3细胞,MTT法、平板克隆实验及流式细胞仪分别检测mi R-153对细胞增殖及凋亡的影响。结果 mi R-153在卵巢癌组织及细胞中的表达显著下调;转染mi R-153 mimics后细胞生长受到明显抑制,克隆数目减少,细胞早期凋亡率显著增加(P<0.01)。结论 mi R-153在卵巢癌中表达下调;过表达mi R-153可显著抑制SKOV3细胞增殖,促进细胞凋亡。     

shRNA沉默GnT-V基因表达对前列腺癌PC-3细胞增殖和凋亡的影响

目的构建针对N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V（GnT-V）的小片段发夹状RNA（shRNA）表达质粒,研究shRNA表达质粒沉默GnT-V基因后对前列腺癌PC-3细胞增殖和凋亡的影响。方法设计针对GnT-V基因的小于扰RNA（siRNA）靶序列,构建shRNA表达载体并转染PC-3细胞,通过G418筛选,建立稳定表达GnT-V基因的细胞株,采用RT-PCR和蛋白质印迹检测GnT-VmRNA和蛋白的表达,并通过CCK-8增殖实验、流式细胞仪评价GnT-VshRNA对前列腺癌PC-3细胞增殖和凋亡的影响。结果成功构建了GnT-VshRNA表达质粒,且该质粒明显下调GnT-V的表达;PC-3细胞GnT-V／1079的tuRNA和蛋白质水平的抑制率分别为76．5％和67．0％,对PC3细胞呈明显抑制效应;CcK-8增殖实验显示,与对照组相比,PC-3GnT-V／1079的增殖受到明显抑制（P〈0．01）,以48h为著;流式细胞仪检测结果表明,PC-3GnT-V／1079的凋亡率明显增加（P〈0．05）。结论shRNAGnT-V能显著降低GnT-V基因的表达水平,从而有效抑制PC-3细胞增殖。并促进细胞凋亡,该GnT-V的siRNA序列可能成为治疗前列腺癌的有效靶点。     

染料木素抑制HER2阳性人乳腺癌与卵巢癌细胞增殖作用的研究

目的研究染料木素对人HER2高表达乳腺癌与卵巢癌细胞增殖的抑制作用,并探讨其作用机制。方法采用流式细胞分析技术、western blotting及细胞增殖与凋亡检测试剂盒等检测方法,对染料木素作用于HER2表达阴性的MCF-7细胞与通过稳定转染HER2而获得的MCF-7-1以及BT-474、SKOV-3等HER2阳性表达细胞的效果进行了剂量或时间反应关系的研究。结果浓度为0.1～10μg/ml的染料木素对HER2表达水平低的MCF-7细胞增殖的影响不大,而对HER2高表达的MCF-7-1、BT-474和SKOV-3细胞的增殖有显著的抑制作用(与DMSO对照组相比,P<0.01),且表现出剂量依赖性反应关系。用10μg/ml的染料木素作用12～48 h可以诱导BT-474细胞凋亡或坏死(与DMSO对照组相比,P<0.01),且表现出时间依赖性反应关系。结论染料木素能够明显抑制HER2阳性肿瘤细胞的增殖,这一作用可能是通过下调肿瘤细胞HER2信号转导而介导的。     

粉防己碱对人结肠癌细胞株HT-29增殖与凋亡的影响

目的:通过观察粉防己碱对人结肠癌细胞株HT-29增殖与凋亡的影响,初步探讨粉防己碱对结肠癌的体外抗肿瘤效应。方法:采用MTT比色法观察粉防己碱对HT-29细胞的增殖抑制效应,利用细胞DNA琼脂糖凝胶电泳及细胞凋亡荧光染色法检测粉防己碱诱导肿瘤细胞凋亡的作用,以免疫细胞化学法检测粉防己碱对Bcl-2和BAX表达水平的影响。结果:MTT比色法显示粉防己碱对人结肠癌细胞株HT-29增殖有抑制作用,其抑制效应具有剂量依赖的特点,细胞凋亡荧光染色法、琼脂糖凝胶电泳表明粉防己碱可诱导HT-29细胞凋亡,免疫细胞化学法显示粉防己碱上调BAX基因表达,下调Bcl-2基因表达。结论:粉防己碱对人结肠癌细胞株HT-29增殖的抑制效应具有剂量依赖性,并可诱导细胞凋亡,其抗肿瘤效应可能与凋亡相关基因表达的调控有关。     

4-HPR 联合顺铂对人卵巢癌细胞株 SKOV3增殖和 Akt／Bax 表达的影响

目的探讨4-HPR 联合顺铂对人卵巢癌细胞株 SKOV3增殖和 Akt/Bax 表达的影响。方法 MTT法检测单独使用4-HPR、顺铂及联合使用对SKOV3细胞增殖的影响;用流式细胞仪检测4-HPR、顺铂对SKOV3细胞周期和Akt/Bax表达的影响。结果顺铂联合不同浓度的4-HPR可以显著抑制SKOV3细胞的增殖,同单独使用顺铂相比抑制作用较强,差异显著（ P＜0.05）。顺铂联合4-HPR同使用顺铂相比可以使G0～G1期细胞比例进一步下降,S期和G2～M期细胞比例进一步上升,差异显著（ P＜0.01）。顺铂联合4-HPR的凋亡率同单独用顺铂组相比差异有统计学意义（ P＜0.01）。顺铂联合不同浓度的4-HPR时可以使SKOV3细胞Akt的表达下调和促进Bax的表达的上调,同单独使用顺铂相比差异有统计学意义（ P＜0.01）。结论顺铂联合4-HPR可以更好地抑制细胞株SKOV3增殖,使得细胞停滞在S期和G2～M期,这可能与可以促进Akt的表达下调和Bax的表达上调有关。     

青藤碱对THP-1细胞增殖、凋亡的影响

目的:观察中药单体青藤碱(SIN)对脂多糖(LPS)刺激的THP-1细胞增殖、凋亡的影响。方法:培养的THP-1细胞经LPS1mg/L刺激2h后,分为SIN高(0.3mmol/L)、中(0.15mmol/L)、低(0.075mmol/L)剂量组及空白对照组,干预24h。采用四甲基偶氮唑蓝法检测细胞的增殖情况,碘化丙啶染色流式细胞检测凋亡指数,吖啶橙(AO)/溴乙锭(EB)荧光显微镜观察细胞凋亡水平。结果:与空白对照组相比,SIN高(P<0.01)、中(P<0.05)剂量组细胞增殖明显降低,流式细胞检测SIN3个剂量组细胞凋亡率增高,AO/EB染色示SIN处理的细胞出现不同程度的核裂解和胞膜受损等凋亡现象。结论:SIN可能通过抑制单核细胞的增殖,促进其凋亡来达到免疫抑制和治疗类风湿关节炎的作用。     

靶向survivin基因的shRNA质粒表达载体的构建

目的:利用pGenesil-1质粒构建靶向survivin基因的2个短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达载体。方法:设计2对shRNA,GC比在40%～55%之间,进而应用BLAST软件进行同源性剔除,保证所得shRNA序列靶向survivin基因,分别克隆至带有U6启动子的质粒pGenesil-1中,构建质粒表达载体,转化大肠杆菌DH5α菌株扩增,提取质粒,酶切鉴定后测序分析。双酶切重组质粒进行酶切鉴定。结果:成功构建靶向survivin基因的2个shRNA质粒表达载体,经双酶切鉴定及质粒测序结果完全符合设计要求。结论:经鉴定设计的2条shRNA已成功连接于质粒上,可以应用于进一步RNA干扰试验。     

小干扰RNA下调GLI1基因的表达对MKN28细胞转移侵袭行为的影响

目的利用siRNA技术下调GLI1基因的表达,在体外研究GLI1对MKN28胃癌细胞侵袭转移能力的影响。方法脂质体法将GLI1 siRNA转染MKN28胃癌细胞,采用RT-PCR观察GLI1 siRNA转染前后GLI1在mRNA水平的变化情况。培养MKN28胃癌细胞,将细胞分为转染GLI1 siRNA组、阴性siRNA组和对照组后,分别采用Transwell小室法检测各组细胞的侵袭和转移能力。结果转染GLI1 siRNA后GLI1基因表达在24 h和48 h明显下调。侵袭和转移实验显示:GLI1 siRNA组侵袭和转移细胞数目均低于阴性siRNA组和对照组(P<0.05),而阴性siRNA组和对照组间的差异均无统计学意义。结论转染GLI1 siRNA特异下调GLI1基因表达,在体外抑制胃癌MKN28细胞的侵袭和转移,可能是胃癌靶向治疗的靶点。     

MiR-572 prompted cell proliferation of human ovarian cancer cells by suppressing PPP2R2C expression

Ovarian cancer (OC) remains one of the most common types of malignant cancer, and the molecular mechanism underlying its proliferation is still largely unclear. It is reported that microRNAs acted as important regulators of cell proliferation by regulating its targeted gene. In this study, our result showed that miR-572 was markedly upregulated in OC cell lines and clinical tissues. Results of both gain-of-function and loss-of-function experiments revealed that upregulation of miR-572 expression dramatically promoted OC cell proliferation, whereas decreased miR-572 expression significantly reduced cell proliferation. Bioinformatics analysis and luciferase reporter assays further revealed PPP2R2C, a putative tumor suppressor as a potential target of miR-572. Moreover, silencing of PPP2R2C using small interfering RNA (siRNA) counteracted the proliferation arrest by miR-572-in in OC cells. In sum, our data provide that miR-572 promoted cell proliferation in OC by targeting PPP2R2C and might serve as a therapeutic target of OC.     

EB1089对前列腺癌DU145细胞生长和凋亡的影响

目的研究EB1089对前列腺癌DU145细胞增殖、凋亡的影响,并探讨其机制。方法体外培养DU145细胞,以1、10、50、100 nmol/L的EB1089分别作用24、48、72 h,MTT法和流式细胞技术检测EB1089对DU145细胞的增殖和凋亡,Western blot检测各浓度的EB1089作用48 h后,DU145细胞Gli蛋白的表达变化。结果 EB1089可以抑制DU145细胞的增殖,诱导DU145细胞凋亡。不同浓度EB1089作用48 h后,DU145细胞Gli蛋白表达下降。结论 EB1089可能通过Hedgehog信号通路抑制DU145细胞增殖、诱导其凋亡。     

利多卡因对卵巢癌细胞增殖和侵袭能力的影响及相关分子机制研究

目的 探讨利多卡因对卵巢癌细胞增殖和侵袭能力的影响及相关分子机制.方法 对数生长期的SKOV-3细胞按随机数字表法分为3组-对照组、低浓度组与高浓度组.低浓度组与高浓度组分别用终浓度为0.1、1.0 mmol/L利多卡因处理SKOV-3细胞,对照组只用完全培养液进行培养.处理后24 h与36 h,采用CCK-8法检测细...