三氟淫羊藿素对心肌缺血再灌注损伤大鼠Akt/mTOR信号通路及自噬相关蛋白水平的影响

目的研究三氟淫羊藿素(ICTF)对大鼠心肌缺血再灌注损伤(MI/RI)的治疗作用,并探讨其是否通过丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Akt/mTOR)信号通路调节自噬起作用。方法采用结扎左冠状动脉前降支45 min,再灌注60 min的方法制作MI/RI模型,雄性SD大鼠分为假手术组、MI/RI模型组、ICTF 0.5,1.0和2.0 mg·kg~(-1)组。标准肢体Ⅱ导联心电图监测T波和ST段变化,TTC染色测定心肌梗死面积,Western印迹法检测心肌组织中微管相关蛋白2/1轻链3(LC3Ⅱ/LC3Ⅰ)比值、Akt和mTOR蛋白磷酸化水平,免疫荧光检测心肌组织LC3蛋白表达水平。结果监测心电图发现,与假手术组相比,MI/RI模型组大鼠再灌注60 min时的T波(P<0.05)和ST段(P<0.01)明显升高;与模型组相比,ICTF 1.0 mg·kg~(-1)组的T波(P<0.05)和ST段(P<0.01)显著降低。TTC染色结果表明,模型组出现明显的心肌梗死灶(P<0.01),ICTF 1.0 mg·kg~(-1)组心肌梗死面积百分数显著降低(P<0.01)。Western印迹结果显示,与假手术组比较,模型组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值显著升高(P<0.01),Beclin~(-1)蛋白磷酸化水平升高(P<0.05),Akt(P<0.01)和m TOR(P<0.05)蛋白磷酸化水平降低;与模型组相比,ICTF 1.0 mg·kg~(-1)组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显降低(P<0.01),Beclin~(-1)(P<0.01)蛋白磷酸化水平降低,Akt和m TOR蛋白磷酸化水平升高(P<0.01)。免疫荧光结果表明,与假手术组相比,模型组大鼠心肌组织中LC3蛋白表达增多(P<0.01);与模型组比较,ICTF 1.0 mg·kg~(-1)组表达减少(P<0.01)。结论 ICTF对大鼠MI/RI具有保护作用,其机制可能与调控Akt/m TOR信号通路抑制细胞过度自噬有关。     

淫羊藿苷对高糖诱导H9c2心肌细胞凋亡的抑制作用

目的 研究淫羊藿苷(ICA)对高糖诱导大鼠心肌细胞H9c2凋亡的抑制作用及其机制。方法 H9c2细胞分为细胞对照组、高糖模型组、高糖+ICA 2.5,5.0,10.0,20.0和40.0μmol·L^-1组,ICA培养1 h后更换含葡萄糖33 mmol·L^-1的培养基培养3 d。CCK-8法检测H9c2细胞存活率,Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡率,生物化学法测定细胞培养基葡萄糖消耗量和乳酸水平,DCFH-DA荧光探针法测定细胞内活性氧(ROS)含量,Mito-Tracker Red CMXRos荧光探针法测定线粒体膜电位,Western印迹法检测动力素相关蛋白1(DRP1)、线粒体分裂蛋白1(FIS1)、线粒体融合蛋白2(MFN2)、视神经萎缩症蛋白1(OPA1)和活化胱天蛋白酶3/6/7蛋白表达水平。结果 与细胞对照组比较,高糖模型组H9c2细胞存活率、线粒体膜电位、MFN2和OPA1蛋白表达水平显著降低(P<0.01),细胞凋亡率、培养基葡萄糖消耗量和乳酸水平及细胞内ROS含量、DRP1、FIS1和活化...     

8-氮鸟嘌呤通过Akt/mTORC1/ULK1诱导细胞自噬增强其在肝癌细胞中的耐药性

细胞自噬是真核生物中进化保守的对细胞内容物进行降解的生理过程,其利用溶酶体将细胞内物质降解再利用,在应激条件下可以促进癌细胞的存活.8-氮鸟嘌呤(8-azaguanine,8-AG)是一种嘌呤核苷酸生物合成的抑制剂,对多种肿瘤细胞具有抗肿瘤活性.然而,耐药性限制了8-AG作为抗癌药物的应用,其耐药性机制尚不清楚.本研究...     

白桦脂酸调节AMPK/mTOR/ULK1信号通路对冠心病大鼠血管平滑肌细胞自噬和凋亡的影响

目的 探究白桦脂酸通过调节腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/Unc-51样自噬激活激酶1(ULK1)信号通路对冠心病大鼠血管平滑肌细胞自噬和凋亡的影响。方法 原代培养冠心病大鼠血管平滑肌细胞,将其随机分为正常组(Control组)、模型组(Model组)、低浓度(20μmol/L)白桦脂酸组(BA-L组)、高浓度(40μmol/L)白桦脂酸组(BA-H组)和高浓度(40μmol/L)白桦脂酸+AMPK抑制剂(10μmol/L)Compound C组(BA-H+CC组)。CCK-8法检测大鼠血管平滑肌细胞的细胞活力。流式细胞术检测细胞凋亡。mRFP-GFP-LC3双荧光体系示踪大鼠血管平滑肌细胞的自噬小体。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)实验检测大鼠血管平滑肌细胞中AMPK、mTOR、ULK1 mRNA的表达。Western blot实验检测大鼠血管平滑肌细胞中AMPK、mTOR、ULK1、LC3、Bax、Bcl-2、Beclin-1蛋白表达水平。结果 与Control组相比,Model组血管平滑肌细胞的细胞活力(48 h、72 h)、Bcl-2蛋白...     

淫羊藿苷对脂多糖诱导成骨细胞凋亡及GRP78/PERK/CHOP通路的影响

摘 要 目的：探讨淫羊藿苷（ICA）对脂多糖（LPS）诱导成骨细胞凋亡及葡萄糖调节蛋白78/蛋白激酶R样内质网激酶/C/EBP同源蛋白（GRP78/PERK/CHOP）通路的影响。 方法: 采用大鼠骨髓基质干细胞定向诱导分化为成骨细胞的方法,将成骨细胞随机分成5组：对照组（只含成骨细胞）、LPS组（成骨细胞中加入终浓度为500 ng·ml-1 LPS）、ICA低、中、高剂量组（分别在LPS组基础上加入终浓度为1,10,100 μmol·L-1 ICA）。采用CCK 8法检测细胞增殖情况,采用对硝基苯棕榈酸酯（PNPP）法检测成骨细胞碱性磷酸酶（AKP）活性的变化情况,采用ELISA法检测成骨细胞Ⅰ型胶原蛋白表达情况,采用AnnexinV/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡情况,采用Western blot检测凋亡及GRP78/PERK/CHOP通路相关蛋白表达情况。 结果: 骨髓基质干细胞经定向诱导后,符合成骨细胞形态学表现,AKP染色呈阳性反应,Ⅰ型胶原蛋白免疫组织化学染色结果显示：细胞质染色呈棕黄色;与对照组相比,LPS组细胞48 h时的吸光度（A）值、AKP活性、Ⅰ型胶原蛋白和B淋巴细胞瘤 2基因（Bcl 2）蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）,细胞凋亡率、活化的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 3（cleaved caspase 3）、Bax、GRP78、磷酸化的PERK（p PERK）、磷酸化α亚基的真核起始因子2（p eIF2α）、CHOP蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）;与LPS组相比,ICA各剂量组细胞48 h时的A值、AKP活性、Ⅰ型胶原蛋白和Bcl 2蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）,细胞凋亡率、cleaved caspase 3、Bax、GRP78、p PERK、p eIF2α、CHOP蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）,且呈剂量依赖性（P＜0.05）。     

淫羊藿苷体外抑制SIV感染诱导的CEMx174细胞凋亡

目的探讨淫羊藿苷体外抑制猴免疫缺陷病毒(Simi-an immunodeficiency virus,SIV)复制作用和抑制SIV感染诱导的CEMx174细胞凋亡的信号转导机制。方法细胞病变和间接免疫荧光法测定了淫羊藿苷对SIV复制的抑制作用,Annexin V和Propidiumiodide(PI)双染法测定淫羊藿苷对SIV感染导致CEMx174细胞凋亡的作用,放免法测定了SIV感染CEMx174细胞内cAMP含量和依赖cAMP的蛋白激酶活性。Western blot法测定了PKA依赖的组蛋白磷酸化的水平。结果用不同浓度的淫羊藿苷处理细胞后结果表明,其半数毒性浓度为134mg·L-1,半数抑制浓度是26mg·L-1,治疗指数为5.15。淫羊藿苷对感染细胞凋亡的抑制要比正常细胞为高(P<0.05)。50mg·L-1淫羊藿苷作用病毒感染细胞15min后降低正常和感染细胞内的cAMP含量,但对感染细胞的cAMP含量影响更加明显。50mg·L-1淫羊藿苷可以显著下调感染和正常细胞的PKA活性(P<0.05)。病毒感染可以使磷酸化的组蛋白-H3升高,50 mg·L-1淫羊藿苷作用2h后,可以降低磷酸化组蛋白-H3的水平。结论淫羊藿苷体外对SIV复制有一定抑制作用,SIV-mac251感染导致的细胞凋亡是cAMP-PKA信号转导通路激活的结果,而短时间淫羊藿苷处理SIVmac251感染的CEMx174细胞可以暂时减缓SIVmac251诱导的细胞凋亡过程。     

缬沙坦对颈动脉粥样硬化大鼠AT1R/PI3K/Akt/mTOR通路及血管内皮细胞自噬的影响

目的 探讨缬沙坦对颈动脉粥样硬化大鼠血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)/磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路及血管内皮细胞自噬的影响.方法 采用高脂饲料饲喂结合颈动脉球囊损伤法制备颈动脉粥样硬化大鼠模型,随机分为模型组(生理盐水),缬沙坦低、中、高(10、20、30 ...     

丹参酮IIA通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路对食管癌细胞放疗敏感性的影响

目的 研究丹参酮II_A对人食管癌细胞放疗敏感性的影响,并基于磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/Akt/mTOR）信号通路探讨其潜在机制。方法 以人食管癌Eca-109细胞为受试细胞,分别采用不同浓度丹参酮II_A和不同放射剂量处理Eca-109细胞,48 h后MTT法检测细胞增殖活力,计算丹参酮II_A半数抑制浓度（IC₅₀）和放射的IC₅₀,分别作为后续实验丹参酮II_A浓度和放射剂量。取对数生长期Eca-109细胞,设对照组、丹参酮II_A组、放射组、丹参酮II_A＋放射组、丹参酮II_A＋放射＋PI3K抑制剂（LY294002）组。通过平板克隆实验、MTT法、流式细胞术、荧光质粒转染法检测细胞克隆形成能力、增殖活力、凋亡率和自噬状况,RT-PCR、Western blotting法检测细胞中PI3K/Akt/mTOR信号通路相关mRNA和蛋白表达。结果 丹参酮Ⅱ_A和放射对人食管癌Eca-109细胞增殖活力的抑制作用均呈现剂量相关性,丹参酮II_A IC₅₀为8.75 mmol/L,放射量IC₅₀为4.63 Gy。与对照组相比,丹参酮II_A组、放射组、丹参酮II_A＋放射组、丹参酮II_A＋放射＋LY294002组细胞克隆形成能力和增殖活力明显降低,凋亡率和自噬体数量明显升高（P＜0.05）;PI3K、Akt、mTOR mRNA和蛋白表达量明显降低（P＜0.05）;Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3、LC3-I、LC3-II蛋白表达量及Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3/Caspase-3、LC3-II/LC3-I明显升高（P＜0.05）。与丹参酮II_A组或放射组相比,丹参酮II_A＋放射组和丹参酮II_A＋放射＋LY294002组对各检测指标的调控作用明显增强（P＜0.05）。与丹参酮II_A＋放射组相比,丹参酮II_A＋放射＋LY294002组对各指标的调控作用明显增强（P＜0.05）。结论 丹参酮II_A可能通过下调PI3K/Akt/mTOR信号通路,抑制细胞增殖并促进其凋亡与自噬,进而增强人食管癌细胞放疗敏感性。     

淫羊藿次苷Ⅱ通过诱导自噬改善链脲佐菌素所致的大鼠学习记忆减退

目的探索淫羊藿次苷Ⅱ(ICSⅡ)对链脲佐菌素(STZ)所致大鼠学习记忆减退的作用及机制。方法雄性SD大鼠随机分为假手术组,模型组,ICSⅡ低、高剂量组(均n=10)。模型组和ICSⅡ组大鼠在第1日和第3日双侧侧脑室注射STZ 5μL(1.5 mg·kg~(-1))模拟散发性老年性痴呆,假手术组注入等体积柠檬酸缓冲液。第二次手术后开始给药,ICSⅡ低、高剂量组每日灌胃ICSⅡ3、10 mg·kg~(-1),假手术组和模型组给予等体积双蒸水,连续给药21 d。给药后第16日开始进行为期6 d的Morris水迷宫实验检测大鼠行为学功能。水迷宫实验结束后,通过Western blot实验技术检测大鼠海马组织中自噬基因Beclin 1、微管相关蛋白1轻链3(LC3)Ⅰ和LC3Ⅱ的蛋白表达以及β-淀粉样蛋白(Aβ1-42)的含量。结果水迷宫实验中模型组较假手术组大鼠的平均逃避潜伏期明显延长,穿越目标象限次数显著减少(P<0.05);海马组织中Aβ1-42的含量显著增加(P<0.05),Beclin 1表达明显减少(P<0.05),LC3-Ⅱ/LC3-I比值降低(P<0.05)。与模型组相比,ICSⅡ高剂量组大鼠逃避潜伏期缩短(P<0.05),穿越原平台象限次数增加(P<0.05);Aβ1-42的蛋白含量明显降低(P<0.05),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin 1蛋白表达显著增加(P<0.05)。结论自噬途径参与了STZ诱导的大鼠学习记忆减退;ICSⅡ具有抗侧脑室注射STZ诱导的认知功能损伤作用,其机制可能与诱导细胞自噬有关。     

mTOR-自噬通路对脓毒症小鼠海马小胶质细胞表型的影响

目的 探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）-自噬通路对脓毒症小鼠海马小胶质细胞表型的影响。方法 54 只雄性 ICR 小鼠,按照随机数字表法分为 3 组（n=18）：假手术组（Sham 组）、脓毒症组（CLP 组）和脓毒症+mTOR抑制剂雷帕霉素组（CLP+Ra组）。Sham组只进行开腹手术操作;CLP组采用盲肠结扎穿孔术制备脓毒症小鼠模型;CLP+Ra 组于造模前 6 h腹腔注射雷帕霉素（1.5 mg/kg）。于造模后 24 h各组取 6只,采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测海马组织肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1β、IL-10和转化生长因子（TGF）-β水平;采用免疫荧光染色法检测海马组织切片离子钙接头蛋白分子（Iba）-1/CD86和 Iba-1/CD206阳性细胞数量;采用蛋白免疫印迹法测定海马组织 mTOR磷酸化（p-mTOR）水平、自噬相关蛋白微管相关蛋白 1轻链 3Ⅱ（LC3Ⅱ）和 Beclin-1表达情况。结果 与 Sham组比较,CLP组 TNF-α、IL-1β、IL-10和 TGF-β水平升高,Iba-1/CD86和 Iba-1/CD206阳性细胞数量增加,p-mTOR水平上调,LC3Ⅱ和 Beclin-1表达下调（均 P＜0.05）。与 CLP组比较,CLP+Ra组 TNF-α和 IL-1β水平降低,IL-10和 TGF-β水平升高,Iba-1/CD86阳性细胞数量减少,Iba-1/CD206阳性细胞数量增加,p-mTOR水平下调,LC3Ⅱ和 Beclin-1表达上调（均 P＜0.05）。结论 mTOR-自噬通路通过调节小胶质细胞表型转化,影响脓毒症小鼠海马炎症反应。     

淫羊藿激活CREB/BDNF信号通路改善APP/PS1双转基因小鼠的认知功能

目的 研究淫羊藿能否通过调节环磷酸腺苷效应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein, CREB)/脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)信号通路改善APP/PS1双转基因小鼠的认知功能。方法 取7月龄雄性APP/PS1双转基因小鼠30只,按体重随机分为模型对照组和淫羊藿组,每组15只;另取15只同龄的雄性C57BL/6小鼠作为空白对照组。淫羊藿组灌胃给予3 g·kg^-1的药物溶液,空白组和模型组给予等体积0.3%CMC-Na,连续灌胃给药28 d,每天1次。筑巢试验检测小鼠日常生活能力;Morris水迷宫试验检测小鼠的学习和记忆能力;苏木素-伊红(H&E)和尼氏(Nissl)染色法观察小鼠脑组织病理学变化;采用TBA法、羟胺法检测小鼠脑组织中丙二醛(malondialdehyde, MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)的水平;免疫荧光化学法检测小鼠脑内β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein, A...     

miR-34a基于AKT/mTOR通路对骨关节炎大鼠的影响及作用机制研究

目的　探究微小核糖核酸-34a（microRNA-34A,miR-34a）基于蛋白激酶B（AKT）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路对骨关节炎大鼠的影响及作用机制。方法　研究时间为2020年2月至2021年5月,选取43只6～9周龄健康雄性SD大鼠作前瞻性研究,其中随机选取10只分为空白组,剩余33只建立骨关节炎模型。成功建模30只,随机分为模型组、上调miR-34a组、沉默miR-34a组,各10只。观察病理组织,实时荧光定量PCR（real-time PCR,RT-PCR）法检测miR-34a表达,酶联免疫吸附实验法检测白细胞介素（interleukin,IL）-1β、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、IL-4、IL-10,蛋白免疫印迹法检测磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B,pAKT）、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（phosphorylated mammalian target of rapamycin,pmTOR）表达。其中多组间比较行F检验,两组间比较行独立样本t检验。结果　空白组、模型组、上调miR-34a组、沉默miR-34a组的miR-34a表达分别为（0.94±0.08）、（2.39±0.26）、（2.12±0.23）、（1.54±0.17）,Makin评分分别为（0.35±0.05）、（4.13±0.19）、（3.02±0.16）、（1.15±0.09）分,IL-1β分别为（3.68±0.37）、（7.51±1.23）、（5.72±0.95）、（4.63±0.72）ng/L,TNF-α分别为（37.45±4.85）、（62.05±7.49）、（56.26±6.25）、（43.85±5.10）ng/L,IL-4分别为（115.75±16.81）、（50.43±9.42）、（75.82±11.94）、（93.85±13.86）pg/ml,IL-10分别为（106.49±17.51）、（60.85±10.23）、（76.81±13.07）、（91.05±15.02）pg/ml,pAKT分别为（1.00±0.01）、（1.95±0.29）、（1.71±0.26）、（1.71±0.26）,pmTOR分别为（1.00±0.01）、（1.89±0.24）、（1.56±0.25）、（1.25±0.15）。与空白组相比,模型组、上调miR-34a组、沉默miR-34a组的miR-34a表达、Makin评分、IL-1β、TNF-α、pAKT、pmTOR较高,IL-4、IL-10较低,差异均有统计学意义（F/P值分别为25.290/0.001、91.260/0.001、14.144/0.001、13.077/0.001、15.525/0.001、17.580/0.001、16.080/0.001、10.676/0.001）;与模型组相比,上调miR-34a组、沉默miR-34a组miR-34a表达、Makin评分、IL-1β、TNF-α、pAKT、pmTOR较低,IL-4、IL-10较高,差异均有统计学意义（均P<0.05）;沉默miR-34a组与上调miR-34a组相比,沉默miR-34a组miR-34a表达、Makin评分、IL-1β、TNF-α、pAKT、pmTOR较低,IL-4、IL-10较高,差异均有统计学意义（均P<0.05）。结论　沉默miR-34a对骨关节炎大鼠有干预作用,减少大鼠出现炎性反应,降低Makin评分,其作用机制与AKT/mTOR信号通路有关。     

基于PI3K/Akt/mTOR信号通路探讨阿司匹林对缺氧/复氧H9c2细胞凋亡的影响

目的:探究阿司匹林(aspirin)对缺氧/复氧(H/R) H9c2心肌细胞凋亡的影响及其与磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信号通路的关系.方法:正常培养H9c2心肌细胞16 h,作为对照组(control组);缺氧、复氧处理H9c2心肌细胞,作为H/R组;培养基中加...     

补骨脂素对绝经后大鼠骨质疏松及PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响

目的:研究补骨脂素对绝经后大鼠骨质疏松及磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路的影响。方法:将60只健康雌性SD大鼠随机分为正常组、模型组、阳性对照组(0.09 mg/kg雌二醇)和补骨脂素低、中、高剂量组(22、44、88 mg/kg),每组10只。除正常组外,其余各组大鼠均采用卵巢摘除去势法建立绝经后骨质疏松模型。术后正常饲养2个月,正常组和模型组大鼠灌胃等体积生理盐水,各药物组大鼠灌胃相应药液;灌胃体积均为0.005 mL/g,每天1次,连续98天。末次给药24 h后,测定大鼠右侧下肢股骨和椎骨的骨密度,血清中钙离子、骨钙素、Ⅰ型前胶原N端前肽(P1NP)含量和骨形态发生蛋白2(BMP2)、血管内皮生长因子(VEGF)水平,以及股骨组织中PI3K、Akt、mTOR mRNA及蛋白的表达水平。结果:与正常组比较,模型组大鼠股骨和椎骨的骨密度以及血清中钙离子、骨钙素、P1NP含量和BMP2、VEGF水平均显著降低,PI3K、Akt、mTOR mRNA及蛋白的表达水平均显著升高(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较,补骨脂素中、高剂量组和阳性对照组大鼠股骨和椎骨的骨密度以及血清中钙离子、骨钙素、P1NP含量和BMP2(补骨脂素中剂量组除外)、VEGF(补骨脂素中剂量组除外)水平均显著升高,各药物组PI3K、Akt、m TOR mRNA(补骨脂素低剂量组除外)及蛋白表达水平均显著降低(P<0.05或P<0.01),且高剂量组股骨骨密度和钙离子、BMP2水平以及PI3K蛋白表达水平均显著高于阳性对照组(P<0.05),mTOR mRNA表达水平显著低于阳性对照组(P<0.05)。结论:补骨脂素可改善绝经后大鼠的骨质疏松,其机制可能与抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。     

黄芪多糖调控AMPK-mTORC1通路对牙周膜成纤维细胞增殖、凋亡、自噬的影响

目的 探究黄芪多糖(Astragalus polysaccharide, APS)对牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts, HPLF)增殖、凋亡、自噬及磷酸腺苷蛋白激酶(AMPK)/雷帕霉素靶蛋白(mTORC1)通路的影响。方法 原代培养HPLF细胞;免疫组织化学法鉴定HPLF细胞;设置对照组、0.1 mg·mL^-1组(0.1 mg·mL^-1 APS)、0.2 mg·mL^-1组(0.2 mg·mL^-1 APS)、0.4 mg·mL^-1组(0.4 mg·mL^-1 APS),细胞增殖及毒性(CCK-8)法检测各组细胞增殖抑制率;用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率;透射电子显微镜观察各组HPLF细胞自噬情况;Western blot检测各组细胞自噬、凋亡、通路相关蛋白表达情况。结果 与对照组相比,细胞增殖抑制率、细胞凋亡率在0.1 mg·mL^-1组、0.2 mg·mL^-1     

磷酸二酯酶5抑制剂淫羊藿次苷Ⅱ通过激活BDNF/TrkB/CREB信号通路抗原代海马神经元氧糖剥夺/复氧复糖损伤作用

目的研究PDE5抑制剂淫羊藿次苷Ⅱ(ICSⅡ)对氧糖剥夺/复氧复糖(OGD/R)诱导的原代大鼠海马及皮质神经元损伤作用及其机制。方法通过OGD/R诱导原代大鼠海马及皮质神经元损伤,在体外模拟脑缺血再灌注损伤,西地那非(SIL)作为阳性药。将原代海马神经元随机分为7组:空白组、空白+ICSⅡ高浓度组、OGD/R组、OGD/R+ICSⅡ低浓度组、OGD/R+ICSⅡ中浓度组、OGD/R+ICSⅡ高浓度组和OGD/R+SIL组。采用MTT法检测细胞活力,乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测细胞损伤,TUNEL染色法及Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡。采用计算机分子虚拟对接检测ICSⅡ与磷酸二酯酶5(PDE5)蛋白催化区域结合能力。采用Western蛋白印迹法检测细胞凋亡及认知通路相关的蛋白表达情况。结果 ICSⅡ能够显著提升OGD/R诱导的原代海马神经元损伤后的细胞存活率,并降低LDH的漏出率。同时,ICSⅡ不仅能够增加环磷酸鸟苷(c GMP)水平及蛋白激酶G(PKG)活性,还能够上调脑源性营养因子(BDNF)、酪氨酸蛋白激酶B(Trk B)、c AMP反应元件结合蛋白(CREB)的蛋白表达,降低Bax/Bcl-2比值和抑制胱天蛋白酶3的活化。此外,PKG抑制剂Rp-8-Br-c GMPS以及Trk B抑制剂ANA-12可几乎完全阻遏ICSⅡ的作用。ICSⅡ不仅可同时抑制PDE5的表达及活性,还可直接结合PDE5蛋白。结论在本实验条件下,ICSⅡ作为PDE5抑制剂能够抗OGD/R诱导的原代海马神经元凋亡,其作用机制可能与调控BDNF/Trk B/CREB通路有关。     

丹酚酸A激活AKT/mTOR/4EBP1通路缓解脂多糖诱导的H9c2心肌细胞凋亡和氧化应激

目的探究丹酚酸A(Sal A)对脂多糖(LPS)诱导的氧化应激性损伤H9c2心肌细胞增殖、凋亡,以及蛋白激酶B(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/起始因子4E结合蛋白(4EBP1)通路相关蛋白表达的影响。方法用LPS诱导制备H9c2心肌细胞氧化应激性损伤模型,分别用含Sal A 5,10和20 mg·L^-1的DMEM培养基培养细胞24 h,加LPS 1 mg·L^-1继续孵育24 h。用5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(EdU)染色观察H9c2心肌细胞存活;采用流式细胞术检测H9c2心肌细胞凋亡和线粒体膜电位;用试剂盒检测细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)和超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)含量;Western印迹法检测胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶9、存活蛋白、Bax/Bcl-2,AKT、磷酸化AKT(p-AKT)、mTOR、p-mTOR、4EBP1和p-4EBP1蛋白表达水平。结果与细胞对照组比较,模型组EdU红色标记的细胞减少(P<0.05);与模型组比较,Sal A 5,10和20 mg·L^-1处理组EdU红色标记的细胞增多(P<0.05)。Sal A能降低培养液中LDH活性及细胞内MDA和GSH含量,增加胞内SOD活性(P<0.05),减少心肌细胞的凋亡率(P<0.05),降低心肌细胞线粒体膜电位的下降速度(P<0.05)。Sal A 10和20 mg·L^-1处理后,活化胱天蛋白酶3、活化胱天蛋白酶9和Bax/Bcl-2蛋白水平显著下调(P<0.05),存活蛋白水平显著上调(P<0.05);与细胞对照组比较,模型组AKT/mTOR/4EBP1磷酸化水平均显著降低(P<0.05)。与模型组比较,Sal A 10和20 mg·L^-1组AKT和mTOR磷酸化水平均显著升高(P<0.05)。结论Sal A通过激活AKT/mTOR/4EBP1通路、减少心肌细胞凋亡并降低心肌细胞线粒体膜电位的下降速度,减缓了LPS诱导的H9c2心肌细胞凋亡和氧化应激,表明Sal A对LPS造成的氧化应激损伤心肌细胞具有保护作用。     

淫羊藿苷调节Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路对高糖诱导的小胶质细胞铁死亡的影响

摘要：目的:探讨淫羊藿苷调节核转录E2相关因子2（Nrf2）/溶质载体蛋白7家族成员11（SLC7A11）/谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）通路对高糖诱导的小胶质细胞铁死亡的影响。方法:将小胶质细胞（BV2）分为对照组(5.5 mmol·L-1葡萄糖)、高糖组(35 mmol·L-1葡萄糖)、淫羊藿苷低(35 mmol·L-1葡萄糖+0.37μmol·L-1淫羊藿苷)、高(35 mmol·L-1葡萄糖+1.48μmol·L-1淫羊藿苷)剂量组、抑制剂组(35 mmol·L-1葡萄糖+1.48μmol·L-1淫羊藿苷+1μmol·L-1的Nrf2抑制剂ML385)。采用CCK-8法检测细胞增殖,进行细胞形态学观察,用超氧化物阴离子荧光探针（DHE）、氟硼二吡咯(BODIPYTM)检测细胞内活性氧（ROS）、脂质过氧化（LPO）水平,特异性荧光探针检测细胞内活性铁含量,Western Blot检测细胞Nrf2、SLC7A11、GPX4、血红素加氧酶1（HO-1）、环氧合酶2（COX2）、酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）蛋白的表达。结果:与对照组比较,高糖组的BV2细胞形态不规则,出现细胞碎片,细胞光密度(OD450)值、Nrf2、SLC7A11、GPX4、HO-1表达明显降低（P＜0.05）,ROS和LPO水平、活性铁含量、COX2、ACSL4表达显著升高（P＜0.05）;与高糖组比较,低、高剂量淫羊藿苷组的BV2细胞损伤减少,细胞OD450值、Nrf2、SLC7A11、GPX4、HO-1表达升高（P＜0.05）,ROS和LPO水平、活性铁含量、COX2、ACSL4表达降低（P＜0.05）;与高剂量淫羊藿苷组比较,抑制剂组减弱了淫羊藿苷对高糖诱导的小胶质细胞铁死亡的抑制作用。结论:淫羊藿苷通过激活Nrf2/SLC7A11/GPX4通路从而抑制高糖诱导的小胶质细胞铁死亡。     

黄芪多糖对肺癌A549细胞自噬的作用及机制研究

目的 探讨黄芪多糖（APS）对黄嘌呤氧化酶（XOD）诱导的肺癌A549细胞自噬模型及磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/Akt/mTOR）信号通路的影响及对自噬相关调节因子表达。方法 实验分为6组：正常组、模型组(20 U·L^-1 XOD处理24 h)、低、中、高3个浓度实验组(在模型组基础上分别使用100,200和400 mg·L^-1 APS进行处理)及3-MA抑制组(在模型组基础上使用2 mmol·L^-1 3-甲基腺嘌呤进行处理)。以免疫荧光法检测自噬相关蛋白,以蛋白质印迹法检测PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白,以实时荧光定量聚合酶链反应法检测mRNA的表达水平。结果 正常组、模型组、高浓度实验组及3-MA抑制组的微管相关蛋白1轻链3B（LC3B）的蛋白荧光强度分别为6 368.50±17.90,2.57×10⁴±224.03,7 443.00±19.20和8 356.50±18.52;抗坏死骨片1（P62）的蛋白荧光强度分别为2.86×10⁴     

芍药苷调控环磷酸腺苷 /蛋白激酶 A/环磷酸腺苷反应元件结合蛋白通路对脑卒中大鼠的影响

目的探讨芍药苷调控环磷酸腺苷( cAMP)/蛋白激酶 A(PKA)/环磷酸腺苷反应元件结合蛋白( CREB)通路对脑卒中大鼠的影响。方法该研究起止时间为 2019年 12月至 2020年 12月。 40只 SD大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、药苷组(灌胃 30 mg/kg芍药苷)、 H89组［腹腔注射 1 mg/kg H89(PKA抑制剂)］、芍药苷 +H89组(灌胃芍药苷后腹腔注射 H89)芍,除假手术组仅进行动脉分离,其余各组均构建缺血性脑卒中模型,模型构建成功后进行药物干预,持续给药 2周,模型组、假手术组以生理盐水代替。根据 Zea Longa评分法对各组大鼠进行神经功能缺损评分, Morris水迷宫测定大鼠记忆行为学能力,酶联免疫吸附测定( ELISA)试剂盒检测大鼠血清炎性因子水平,苏木精 -伊红( HE)染色观察大鼠脑组织病理学变化,蛋白质印迹法检测大鼠脑组织 cAMP/PKA/CREB通路相关蛋白表达。结果与假手术组相比,模型组脑组织受损严重,大鼠神经功能缺损评分、血清中炎性因子水平显著升高( P<0.05)记忆行为学能力、脑组织中 cAMP［( 0.31±0.05)比( 1.03±0.23)］、 PKA［( 0.30±