尿道粘膜上皮细胞的分离培养和鉴定

目的：为采用组织工程技术构建尿道粘膜组织提供实验依据。方法：取雄性新西兰幼兔尿道粘膜组织小块,酶消化成单细胞悬液,接种后静置培养、传代。动态观察细胞形态变化及生长增殖情况。细胞进行常规组化染色、免疫组化染色及流式细胞仪检查,并观察超微结构。结果：整个上皮细胞生长期内无成纤维细胞混杂生长,均为单一的上皮细胞,并证实为二倍体细胞。细胞可传11－13代,成活50－60d。结论：新西兰幼兔尿道粘膜上皮细胞可在体外培养,在一定时间内保持增殖能力。     

膀胱黏膜上皮细胞体外培养的实验研究

目的探索组织工程化尿道黏膜类似组织体外培养条件.方法取雄性大耳白兔幼兔的膀胱壁组织,分别用Ⅱ型胶原酶和Dispase Ⅱ处理后,胰蛋白酶消化获得单细胞悬液,接种后用含有或不含有表皮生长因子的培养液培养并传代,动态观察细胞形态变化及生长增殖的不同情况,并对细胞进行超微结构观察.结果用Ⅱ型胶原酶处理的标本在有表皮生长因子存在的情况下,细胞生长良好,混杂少量的成纤维细胞,在体外可传10代以上,成活30天以上.结论Ⅱ型胶原酶处理的幼兔膀胱黏膜上皮细胞纯度较高,可在体外培养一定时间并保持增殖能力,表皮生长因子是必要条件.     

膀胱黏膜上皮细胞体外培养的实验研究

目的 探索组织工程化尿道黏膜类似组织体外培养条件。方法取雄性大耳白兔幼兔的膀胱壁组织，分别用Ⅱ型胶原酶和DispaseⅡ处理后，胰蛋白酶消化获得单细胞悬液，接种后用含有或不含有表皮生长因子的培养液培养并传代，动态观察细胞形态变化及生长增殖的不同情况．并对细胞进行超微结构观察。结果用Ⅱ型胶原酶处理的标本在有表皮生长因子存在的情况下，细胞生长良好，混杂少量的成纤维细胞，在体外可传10代以上，成活30天以上。结论Ⅱ型胶原酶处理的幼兔膀胱黏膜上皮细胞纯度较高，可在体外培养一定时间并保持增殖能力．表皮生长因子是必要条件。     

兔包皮上皮细胞的分离培养和鉴定

目的:收集兔的小块包皮组织,分离培养上皮细胞,并传代增殖,为组织工程化尿道构建提供细胞来源.方法:取雄性家兔包皮小块组织,酶消化成单细胞悬液,接种后静置培养、传代.并定期观察细胞形态变化及生长增殖情况,免疫组化染色,细胞计数及MTT测定以判断细胞增殖能力.结果:分离消化后的上皮细胞生长良好,经免疫组化测定为正常上皮细胞,并传代3代,细胞数量达到植入生物支架并生长的需要.结论:家兔的包皮上皮细胞可在体外培养增殖并传代,并达到相应细胞数量.     

转化生长因子β1对体外培养尿道细胞的生物学作用研究

目的 观察转化生长因子β1(TGF-β1)对尿道黏膜上皮细胞及成纤维细胞的生长调节作用及在诱导靶细胞结缔组织生长因子(CTGF)的表达中的作用.方法 体外培养尿道黏膜上皮细胞及成纤维细胞并鉴定.取第4代细胞分别设立对照组(以不含TGF-β1的细胞培养液培养)和实验组(分别以TGF-β11、2、4、8 μg/L的细胞培养液培养),24 h后分别以MTT比色试验和细胞计数法检测细胞活力,RT-PCR检测细胞内CTGF mRNA的表达.结果 与对照组相比较,实验组尿道黏膜上皮细胞数量和吸光度值随TGF-β1浓度升高而降低(P＜0.05),成纤维细胞数量和吸光度值随TGF-βl浓度升高而升高(P＜0.05);CTGF mRNA在实验组上皮细胞和成纤维细胞中均有表达,且表达水平随TGF-βl浓度升高而增加(P＜0.05).结论 TGF-β1可抑制尿道黏膜上皮细胞生长,促进成纤维细胞生长,并能诱导尿道黏膜上皮细胞及成纤维细胞表达CTGF mRNA.     

尿道移行上皮细胞与生物可降解尿道支架体外复合培养的研究

目的:研究体外培养的兔尿道上皮细胞在生物可降解性网状尿道支架上的贴附和生长增殖情况,观察其对尿道上皮细胞形态和功能的影响,利用组织工程技术培养种植细胞的尿道内支架.方法:应用机械分离与酶消化法分离培养兔尿道移行上皮细胞,并在体外行原代培养与扩增后制成细胞悬液,接种在网状尿道支架上,形成尿道移行上皮细胞-支架复合物.应用免疫组织化学、荧光染色法鉴定尿道上皮细胞及其活性,并用倒置显微镜、扫描电镜观察尿道上皮细胞在支架表面吸附与生长状态.结果:网状尿道支架具有良好的生物相容性,能使尿道移行上皮细胞增殖,不影响其活性.尿道移行上皮细胞在尿道支架上贴附生长良好,1～2天后完全贴壁,3～7天细胞生长增殖活跃,支架网眼内充满上皮细胞;长期培养仍保持尿道移行上皮细胞特性,扫描电镜可见上皮细胞与网状支架紧密贴附,适度伸展并有基质分泌.结论:网状尿道支架适合尿道移行上皮细胞黏附生长,可作为尿道组织工程的细胞载体,利用组织工程方法可获得适于移植尿道细胞的组织工程化尿道.     

尿道移行上皮细胞与生物可降解尿道支架体外复合培养的研究

目的：研究体外培养的兔尿道上皮细胞在生物可降解性网状尿道支架上的贴附和生长增殖情况,观察其对尿道上皮细胞形态和功能的影响,利用组织工程技术培养种植细胞的尿道内支架。方法：应用机械分离与酶消化法分离培养兔尿道移行上皮细胞,并在体外行原代培养与扩增后制成细胞悬液接种在网状尿道支架上,形成尿道移行上皮细胞-支架复合物。采用免疫组织化学、荧光染色法鉴定尿道上皮细胞及其活性;采用倒置显微镜、扫描电镜观察尿道上皮细胞在支架表面吸附与生长状态。结果：网状尿道支架具有良好的生物相容性,能使尿道移行上皮细胞增殖,不影响其活性。尿道移行上皮细胞在尿道支架上贴附生长良好,1～2天后完全贴壁,3～7天细胞生长增殖活跃,支架网眼内充满上皮细胞,长期培养仍保持尿道移行上皮细胞特性,扫描电镜可见上皮细胞与网状支架贴附紧密,适度伸展并有基质分泌。结论：网状尿道支架适合尿道移行上皮细胞黏附生长．可作为尿道组织工程的细胞载体,利用组织工程方法可获得适于移植尿道细胞的组织工程化尿道。     

新西兰兔尿道海绵体平滑肌细胞的原代培养及鉴定

目的 为构建新西兰兔组织工程尿道提供种子细胞。方法 取新西兰兔阴茎头，用含10％胎牛血清的高糖DMEM作体外原代培养，并行免疫组织化学法鉴定。结果经10～14d培养后，培养瓶底铺满梭状细胞，免疫组织化学法鉴定确认为兔尿道海绵体平滑肌细胞。结论兔阴茎头平滑肌细胞可在体外条件下生长传代、扩增，可作为构建组织工程尿道的种子细胞。     

组织工程舌黏膜构建的研究

目的 探讨舌黏膜细胞的体外培养方法,及其作为种子细胞与同种异体膀胱脱细胞移植物(BAMG)复合构建组织工程化黏膜的方法.方法 分离并获取雄性新西兰大耳白兔舌黏膜细胞进行培养,定期观察细胞形态变化及生长增殖情况.对体外培养的舌黏膜细胞进行广谱角蛋白抗体(AE1/AE3)免疫荧光染色鉴定;流式细胞仪检测第2代培养细胞的AE1/AE3阳性细胞百分比;细胞计数及噻唑蓝(MTT)比色法测定以判断细胞增殖能力.取同种异体兔膀胱经脱细胞处理制成BAMG,随机取小块组织行HE和Masson染色观察脱细胞效果,然后将第2代体外培养的舌黏膜细胞种植于BAMG上,通过HE染色及扫描电镜观察口腔黏膜细胞与BAMG的复合情况.结果 舌黏膜细胞形态均一有较强的增殖能力可传代至4～5代,传至第4代时开始出现老化,细胞贴壁及增殖能力均明显减弱.免疫荧光染色显示近100%体外培养的舌黏膜细胞AE1/AE3免疫荧光染色阳性.流式细胞仪检测结果表明第2代舌黏膜细胞AE1/AE3阳性细胞百分比大于96%.舌黏膜细胞传至第3代时可获得细胞数量在2×107以上.HE和扫描电镜观察均显示舌黏膜细胞和BAMG复合良好.结论 兔舌黏膜细胞可在体外成功培养、扩增;兔舌黏膜细胞与同种异体BAMG复合后生长良好.     

原位定量检测体外培养的尿道黏膜上皮细胞活性

目的解决在不透明载体上观察细胞生长状况的难题。方法取雄性新西兰幼兔1只,进行尿道黏膜上皮细胞的原代培养并传至第3代。将其接种于胶原-壳聚糖复合材料上,体外培养3、7、14和21d后,行6-羧基二乙酸甲酯荧光素与碘化丙啶荧光双染,并应用激光共聚焦细胞仪检测。结果尿道黏膜上皮细胞在胶原-壳聚糖复合材料载体上生长,增殖良好。培养3、7d,活细胞荧光强度值为(1.09±0.13)×108、(2.04±0.13)×108,培养14、21d活细胞荧光强度值分别为(0.55±0.09)×108、(0.47±0.03)×108,与培养3、7d比较差异均有统计学意义(P<0.05)。各时间点死细胞荧光强度值差异无统计学意义(P>0.05)。结论利用激光共聚焦细胞仪对不同波长荧光强度分别进行定量分析,可以在原位定量快速检测尿道黏膜上皮细胞活性,动态观察组织工程组织生长情况,解决无法在不透明载体上观察细胞生长状况的难题。     

兔骨髓间充质干细胞的分离培养及其生物学性状的研究

目的：分离培养兔骨髓间充质干细胞，对其生物学性状进行观察。方法：用密度梯度离心法与贴壁培养法相结合，分离兔骨髓间充质干细胞，进行体外培养扩增，绘制其生长曲线，用倒置显微镜、细胞爬片、扫描电镜、透射电镜观察细胞的生物学性状。结果：密度梯度离心后，活细胞比例在95％以上，贴壁培养的细胞呈纺锤形，细胞增殖力强，平均倍增时问为32h，细胞的增殖能力随传代次数的增加而有所下降。结论：密度梯度离心与贴壁培养相结合可以提高细胞分离效率。体外培养的兔骨髓问充质干细胞生长稳定，增殖力强，可以作为组织工程的种子细胞。     

In vitro fabrication of bioartificial mucosa for reconstruction of oral mucosa: basic research and clinical application.

Bioartificial mucosa can be fabricated with living cells in vitro and used for mucosal grafting. In this report, we describe our culturing methods for preparation of bioartificial mucosa and its morphological characteristics. Bioartificial mucosa has bilayered components, namely, mucosal epithelium and submucosal tissue. Submucosal tissue was composed of fibroblasts and type I collagen lattice. Mucosal epithelium was formed by an epithelial segment grafted on the submucosal tissue surface. Between epithelial and submucosal tissues, basement membrane was observed under a transmission electron microscope. In animal experiments, the bioartificial mucosa was well vascularized and survived completely without immunological rejections. Based on the findings from these animal experiments, we applied this bioartificial mucosa to humans and succeeded in reconstructing their mucosal defects. We also present an overview of the problems relevant to the use of such methods.     

成骨细胞与生物衍生材料联合培养的实验研究

目的：探讨冻干脱钙骨基质（FDBM）作为组织工程骨支架的可行性。方法：取兔颅骨外膜的成骨细胞，经传代培养后作为种子细胞与FDBM于体外联合培养，通过对复合物相差显微镜、光镜及扫描电镜等观察，了解细胞在材料中的生长情况。结果：经系统处理后的FDBM呈现不规则的网－孔结构，其孔隙直径为100－400μm ,孔隙率为70％。体外复合培养8小时，成骨细胞即开始贴附于FDBM网架上；复合培养7天，分布于支架材料上的成骨细胞迅速分化增殖，分泌细胞外基质并形成钙结节。结论：FDBM可作为构建组织工程骨的一种较好支架材料。     

Isolation and in vitro cultivation of human urothelial cells from bladder washings of adult patients and children.

To acquire urothelial cells for in vitro engineering of urothelium, biopsy specimens were taken from the urological tract. In clinical practice the number of cells harvested by biopsy are limited and the procedure requires general anaesthesia in children. The purpose of this study was to find out if bladder washings from adult patients as well as children contained enough proliferative and colony-forming uroepithelial cells to regenerate urethral mucosa in vitro, and if the cells could be stored by freezing. Bladder washings from nine children and eight adult patients were collected from patients who were having procedures that required an indwelling catheter. All cultures grew colonies of cells with a morphological appearance typical for epithelial cell growth. The cultures could be expanded to confluent, stratified sheets, and cells that stained for pancytokeratin, indicating an epithelial origin. Cells stored in -150 degrees C could be cultured and expanded in vitro. No differences were seen between cells from adults and children. Bladder washing is a non-invasive way to obtain many autologous urothelial cells. The method is reproducible and well tolerated by children. The possibility of culturing cells obtained in this way into stratified grafts provides a unique way of reconstructing the urogenital tract by "tissue engineering".     

骨髓基质成骨细胞复合支架材料构建组织工程性肌骨瓣的实验研究

目的探索用羟基磷灰石/磷酸三钙(HA/TCP)的支架材料与成骨细胞复合构成组织工程性肌骨瓣修复骨缺损的能力。方法自2004年12月至2005年5月,于新西兰大耳白兔髂后上棘抽取骨髓基质干细胞并诱导分化为成骨细胞,然后与HA/TCP结合,共培养2周,通过相差显微镜、扫描电镜观察体外细胞生长情况,最后将复合物埋入兔的背阔肌下构成组织工程性肌骨瓣。术后6周进行大体解剖观察,HE染色,研究组织工程性肌骨瓣的生长情况。结果扫描电镜显示支架材料表面和孔隙内均有成骨细胞生长,有良好的增殖活动性和稳定细胞表型,材料中心区未见细胞生长,植入体内6周后取材见内植物有新骨形成,多位于内植物表面,可见成骨细胞、骨细胞、髓腔样结构、板层样骨基质等正常骨组织结构。结论骨髓来源的成骨细胞可用作骨组织工程的种子细胞,此种组织工程性肌骨瓣生长良好,可成功构建组织工程化骨。     

成骨细胞株与强韧化纳米人工骨支架联合培养实验研究

目的 :观察成骨细胞株 ( 3T3 E1)在新型纳米氧化锆强韧化高孔隙率人工骨支架 (下文简称人工骨支架 )材料上生长情况。方法 :成骨细胞株 ( 3T3 -E1)与人工骨支架联合培养 ,通过光镜观察和细胞计数的方法了解成骨细胞与支架结合能力 ,扫描电镜观察细胞生长的情况。结果 :新型强韧化纳米人工骨材料与建株成骨细胞有良好的结合能力 ,成骨细胞株 ( 3T3 E1)在人工骨材料上生长良好。结论 :纳米骨支架是较理想的骨组织工程支架材料 ,成骨细胞复合支架用于骨缺损的修复 ,具有广阔的临床应用前景。     

珍珠层/聚乳酸人工骨的生物相容性研究

目的：研究珍珠层／聚乳酸人工骨在体内外的生物相容性。方法：将珍珠层／聚乳酸人工骨在体外与兔成骨细胞复合培养作实验组，以脱钙骨／聚乳酸人工骨作对照，行MTT法、组织学和扫描电镜检测，观察成骨细胞在材料表面的粘附、生长和增殖情况；将同种异体成骨细胞—珍珠层／聚乳酸人工骨复合植入体内，观察机体对细胞与材料的排斥反应。结果：肌法显示随培养时间的延长，细胞在材料表面不断增殖；组织学及电镜显示，在体外细胞于材料表面及孔隙中附着、生长良好，存在接触抑制现象；细胞与材料复合植入体内，珍珠层／聚乳酸组的炎性反应明显比对照组轻。结论：珍珠层／聚乳酸人工骨在体内外有良好的生物相容性。     

新型双相陶瓷材料复合成骨细胞构建人工骨及其体内成骨的观察

目的 观察骨髓来源的成骨细胞与新型双相陶瓷材料复合培养后细胞生长状况及其体内异位成骨能力。方法 将来源于兔骨髓的成骨细胞与新法制备的HA/TCP共培养2周,通过相差显微镜、扫描电镜观察体外细胞生长情况;然后将复合物自体异位植入体内,6周后观察体内成骨情况。结果 扫描电镜显示材料表面和孔隙内均有成骨细胞生长,有良好增殖活动性和稳定细胞表型,材料中心区未见细胞生长;植入体内6周后取材见内植物有新骨形成、多位于内植物表面,可见成骨细胞、骨细胞、髓腔样结构、板层样骨基质等正常骨组织结构。结论 新型双相陶瓷支架可用作组织工程骨的细胞外基质材料,骨髓来源的成骨细胞可用作骨组织工程的种子细胞。