表皮干细胞抽提物重编程脂肪干细胞表达表皮细胞表型的实验研究

目的研究富集的表皮干细胞（Keratinocyte enriched with epidermal stem cells,KSC）抽提物对重编程人脂肪干细胞（Adipose derived stem cells,ASCs）表达表皮细胞表型的影响。方法常规方法收集表皮细胞（Keratinocyte,KC）后,应用Ⅳ型胶原差速贴壁法分别收集KSC与富集后剩余的表皮细胞（Keratinocyte enriched with epidermal stem cellsleft,KCL）,鉴定K19和P63的阳性表达率,Gimsa染色法测定KC、KSC、KCL的克隆形成率,分别制备KC、KSC、KCL的细胞抽提物,作用于链球菌溶血素-O（SLO）通透处理过的原代ASCs,分别应用流式细胞仪与Western-blot测定重编程后ASCs中广谱角蛋白（Pan cytokeratin,P-CK）与ASCs的BRG1表达变化。结果 KSC与KC、KCL来源的细胞抽提物重编程ASCs的CK及BRG1表达率,均有明显统计学差异（P〈0.01）。结论脂肪干细胞在表皮细胞抽提物的诱导作用下能表达表皮细胞表型,且对表皮细胞优化处理后的KSC有更加显著的重编程作用。     

人表皮细胞抽提物重编程脂肪干细胞的实验研究

目的观察人表皮细胞抽提物重编程人脂肪干细胞(hADSCs),使其向表皮细胞转化。方法超声乳化人表皮细胞,离心后获得抽提液冻存备用。培养2～3代hADSCs,链球菌溶血素O(SLO)处理后加入表皮细胞抽提液。7 d时观察hADSCs形态学、角蛋白K1/10及K19基因的变化及细胞膜K1/10及K19蛋白表达的变化。结果 SLO处理hADSCs后,可使hADSCs的通透率明显增加,达70%左右。加入表皮细胞抽提液后的hADSCs变为表皮细胞特有的铺路石样形态,并表达表皮细胞特有的K1/10及K19基因及膜蛋白。结论表皮细胞抽提液可以重编程hADSCs,使其向表皮细胞转化。     

左旋精氨酸对不对称二甲基精氨酸与一氧化氮水平的影响

目的 观察先天性心脏病合并中、重度肺动脉高压(PAH)行心内直视修补术患者静滴左旋精氨酸(L-Arg)对不对称二甲基精氨酸(ADMA)和一氧化氮(NO)水平的影响.方法 20例入院时肺动脉收缩压(PASP)＞50 mm Hg拟在心肺转流(CPB)下行心内修补术患者,随机分为L-Arg治疗组(Ⅰ组)和对照组(Ⅱ组),每组10例.Ⅰ组术前加用L-Arg静滴;Ⅱ组术前接受常规治疗.所有患者在治疗前(T1)、麻醉诱导前(T2)、停CPB时(T3)、CPB结束后12 h(T4)、24 h(T5)及72 h(T5)各采集桡动脉血,测定ADMA和NO的浓度.治疗前、术前、术后第1天及第3天各测一次PASP.结果 Ⅰ组和Ⅱ组T1时NO、ADMA及PASP差异无统计学意义.与T1时比较,Ⅰ组T2、T4～T6时NO浓度升高、T2～T6时ADMA浓度降低(P＜0.05);Ⅱ组T3～T6时NO浓度降低、T4～T6时Ⅰ组ADMA浓度明显升高(P＜0.05).T2、T4～T6时Ⅰ组NO浓度高于Ⅱ组、ADMA浓度低于Ⅱ组(P＜0.05);Ⅰ组PASP术前、术后第1天、第3天均低于Ⅱ组(P＜0.05).结论 CPB可致ADMA浓度增高、NO浓度降低.静注L-Arg可提高NO的浓度,降低ADMA浓度,而且对降低PAH患者行心内修补术后肺动脉压力有积极意义.     

Brg1在细胞重编程中作用的研究进展

Brg1是染色质重塑复合物的重要组成成分,参与染色质重塑过程,同时可以大大提高细胞重编程的效率。本文就Brg1介导的染色质重塑复合物在细胞增殖和分化过程中的作用进行综述。     

诱导性多能干细胞的研究进展和前景展望

组织工程是应用工程学及生命科学原理和方法,实现组织保存、修复、功能维持和提高作用的生物学替代物的科学,目的是实现组织器官的功能修复。干细胞不仅可用于再生医学、组织工程,还可应用于生物生长发育机制的研究、药物筛选、基因治疗等领域。因核移植技术以及提取胚胎干细胞面临着材料不易获取、免疫排斥和伦理学争议,其研究发展受限。     

一氧化氮合酶对增生性瘢痕影响意义的研究

目的观察一氧化氮合酶（Nitrogen oxide synthetase，NOS）在增生性瘢痕与正常皮肤组织及细胞中的表达特征及其差别．并通过应用NO供体或NOS抑制剂对培养的瘢痕成纤维细胞进行体外药物干扰，探索NO、NOS在增生性瘢痕形成中的作用。方法取临床增生性瘢犍下．术病人的瘢痕组织及周围少许正常皮肤，体外培养获得皮肤和穰痕成纤维细胞．通过免疫细胞化学及RT—PCR方法比较两种组织及细胞中NOS的表达及分布的差异。分别以100～500μM的NO供体硝普钠（Sodium nitroprusside，SNP）、NOS抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲酯（L—Arginine methyl，L-NAME）作用于瘢痕成纤维细胞，观察细胞增殖的变化；并用免疫细胞化学和RT—PCR方法比较作用前后成纤维细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的变化。结果免疫组化检测及RT—PCR方法检测显示增生性瘢痕组织及细胞中NOS表达相对于皮肤组织及成纤维细胞中明显减少（p〈0．05）。瘢痕细胞经SNP作用后，细胞增殖显著降低。免疫细胞化学方法和RT-PCR方法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原结果显示，从SNP200μM组开始Ⅰ、Ⅲ型胶原表达显著降低（p〈0．05）。经L—NAME200μM作用后，Ⅰ、Ⅲ型胶原表达显著增加（p〈0．05）。结论增生性瘢痕组织及细胞中NOS含量较正常皮肤组织及细胞明显减少，NO供体SNP对体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞增殖以及胶原表达起到抑制作用，NOS抑制剂L—NAME对其胶原表达则起到促进作用，结果提示NOS表达降低可能与瘢痕增生密切相关，因此改变NO的产生及NOS的活性可望调控瘢痕成纤维细胞的生物学行为．     

人骨髓间充质干细胞向心肌样细胞诱导分化的研究进展

一般认为，成熟的心肌细胞是终末分化细胞，缺乏再生能力。有研究表明，少数成体心肌细胞在终末分化之后还具有分裂能力，但由于数量极少，不能达到修复损伤心肌的目的。因此，心肌损伤后只能由成纤维细胞增生形成瘢痕而修复，但只有增加心肌细胞或心肌样细胞的数量才能改善此类病人的心功能。目前，心血管外科临床应用的心血管修复材料都缺乏收缩性和生长潜能，并有钙化和血栓生成的危险。寻找理想的心血管材料一直是先心外科基础研究的热点之一，心肌组织工程则提供了一种全新的思路和治疗策略。理想的种子细胞是能否获得工程化功能心肌的要素之一。近年来，利用骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSCs）进行细胞移植或作为种子细胞的研究广泛开展，     

大鼠骨髓间充质干细胞与成纤维细胞差异蛋白质组学研究

目的：进行大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）与成纤维细胞（FBs）细胞的蛋白质组学研究，寻找出重要的差异蛋白质。方法：采用二维电泳的方法（2DE）分别分离两种细胞的蛋白质，用PDQuest软件分析蛋白表达差异，并采用质谱（MALDI-TOF-MS）进行鉴定。结果：发现了MSCs和FBs之间存在差异表达的15种蛋白质，其中4种蛋白质差异显著且与细胞功能密切相关，即SM22-α、鸟嘌呤脱氨基酶（Guanine deaminose，GD）、膜联蛋白（Annexin A5）、过氧化物岐化酶-2（superoxide dismutase 2，SOD-2）。MSCs的SM22-α和Annexin A5的表达分别比FBs低26倍和8倍，而MSCs的GD和SOD-2表达分别比FBs高16倍和21倍。结论：与大鼠FBs相比，MSCs存在更多防止细胞损伤相关的蛋白质和更少的与细胞衰老过程密切相关的蛋白质，具有高分化潜能，更适合于作为组织工程种子细胞。     

饲养层分泌碱性成纤维生长因子与支持人胚胎干细胞生长

目的 初步探讨人源性和鼠源性饲养层细胞分泌的碱性成纤维生长因子(bFGF)对人胚胎干细胞(hESCs)未分化生长的影响. 方法 人源性和鼠源性成纤维细胞制备成饲养层(人源性饲养层不加bFGF,鼠源性饲养层加4ng/ml bFGF),同期接种同一株hESCs,对比hESCs的贴壁率、克隆生长率及未分化率,比较它们支持hESCs生长的差异;通过酶联免疫吸附实验(ELISA)方法,快速检测评估人源性和鼠源性饲养层细胞自身分泌的bFGF. 结果 人包皮和鼠源性饲养层培养hESCs的贴壁率和克隆生长率之间无显著差异(P＞0.05),但是鼠源性支持三代hESCs的未分化率均高于人源性饲养层(P＜0.05).鼠源性饲养层不能分泌任何可测量到的bFGF,而人源性饲养层细胞均能分泌bFGF. 结论 饲养层细胞自身分泌的bFGF能支持hESCs的贴壁和增殖生长,但不同饲养层支持hESCs生长的最适宜bFGF浓度和抑制hESCs分化的作用机制,还有待于进一步研究.     

重组人内皮型一氧化氮合酶基因转染对增生性瘢痕成纤维细胞的影响

目的 了解重组人内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因转染人增生性瘢痕成纤维细胞(HSFb)的可行性,以及转染后一氧化氮(NO)的生成和Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成情况. 方法体外构建人eNOS真核表达载体.取体外培养的人HSFb进行转染实验,根据细胞培养液中所加质粒不同分为pcDNA3.0空载体组、pcDNA3.0-eNOS转染组.另设未转染组,细胞按常规培养.采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞eNOS及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达.硝酸还原酶法测定NO含量. 结果细胞转染后eNOS显著表达,pcDNA3.0-eNOS转染组eNOS mRNA相对表达量为5.92±0.21,明显高于pcDNA3.0空载体组(0.98±0.13,P<0.05);pcDNA3.0-eNOS转染组Ⅰ型胶原mRNA相对表达量为0.76±0.15,Ⅲ型胶原mRNA相对表达量为0.79±0.08,均明显低于pcDNA3.0空载体组(0.98±0.15、1.02±0.12,P<0.05).pcDNA3.0-eNOS转染组NO含量为(36.1±0.8)μmol/L,明显高于pcDNA3.0空载体组(28.4±1.0)μmol/L和未转染组[(27.7±1.3)μmol/L,P<0.01]. 结论 HSFb可作为eNOS基因转染的靶细胞,转染的细胞能表达eNOS并产生NO,并且对细胞的胶原合成功能有抑制作用.     

Inhibition of Endogenous Nitric Oxide Synthase Potentiates Nitrovasodilators in Experimental Pulmonary Hypertension

Background: The role of endogenous nitric oxide (NO) in the regulation of pulmonary vascular tone is complex. Inhibition of endogenous NO synthase, potentially through upregulation of guanylyl cyclase, results in an increase in potency of nitrovasodilators in the systemic circulation. This study considered whether inhibition of endogenous NO synthase would increase the potency of nitrovasodilators, but not of cyclic adenosine monophosphate-dependent vasodilators, in the pulmonary vasculature.

Methods: We used the isolated buffer-perfused rabbit lung. Preparations were randomized to receive either pretreatment with NG -nitro-L-arginine methyl ester (or L-NAME, an inhibitor of endogenous NO synthase) or no pretreatment. Stable pulmonary hypertension was then produced by infusing the thromboxane A2 analog U46619. The dose-response characteristics of two nitrovasodilators, sodium nitroprusside and nitroglycerin, and two nonnitrovasodilators, prostaglandin E1 and 5'-N-ethylcarboxamidoadenosine, were studied.

Results: Inhibition of endogenous NO synthase caused no significant changes in baseline pulmonary artery pressure but did significantly reduce the U46619 infusion rate required to produce pulmonary hypertension. Pretreatment with L-NAME (vs. no L-NAME) resulted in significantly lower values of the log median effective dose with sodium nitroprusside and nitroglycerin. In contrast, pretreatment with L-NAME resulted in no changes in the dose-response characteristics of the cyclic adenosine monophosphate-mediated, NO-independent vasodilators prostaglandin E1 and 5'-N-ethylcarboxamidoadenosine.     

一氧化氮合酶抑制剂对肝硬变鼠肝内阻力的影响

目的:探讨一氧化氮合酶(NOS)抑制剂对肝硬变大鼠肝内阻力的影响。方法:采用肝硬变大鼠原位肝脏灌注模型,观察NOS抑制剂硝基精氨酸(L-NNA)及一氧化氮(NO)合成底物L-精氨酸(L-arg)对大鼠门静脉去甲肾上腺素(NE)反应的影响。结果:应用L-NNA后,正常及肝硬变动物门静脉压力均较单用NE时显著升高,肝硬变动物门静脉压力的升高程度明显小于正常动物。L-arg可以消除L-NNA的作用。结论:NO参与正常及肝硬变动物门静脉压力的调节。肝硬变时,肝内NO合成减少,使肝内阻力进一步升高。     

一氧化氮、一氧化氮合酶与伴精索静脉曲张不育患者精液参数的关系

目的:探讨一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)与伴精索静脉曲张(VC)不育患者精液参数之间的关系。方法:根据体格检查和彩色多普勒超声检查选择伴VC的不育患者(组1,n=53),其中临床型和亚临床型分别为21例和32例;同时选择非VC少弱精子症患者(组2,n=29)和正常生育者(组3,n=28)作对照组。采用硝酸还原法分别测定外周血和精浆中NO含量和NOS活性。用计算机辅助精液分析仪测定VC组患者精子密度、活动精子(a+b级精子)和快速前向运动精子百分率。结果:①组1外周血清NO含量和NOS活性与组2及组3相比差异无显著性(P>0.05),但精浆中NO含量和NOS活性组1明显高于其他两组,差异有显著性(P<0.01和P<0.05)。②组1中,随着曲张的精索静脉内径的增加,外周血清和精浆中NO含量和NOS活性均有所上升,但只有精浆中临床型和亚临床型之间相比差异有显著性(P<0.05)。③组1中,随着精子密度和精子活力的下降,外周血清和精浆中NO含量和NOS活性均有上升趋势,且精子密度≥20×106/ml和≤10×106/ml之间,精子活力≥50%和≤25%之间差异有显著性(P均<0.05)。结论:在VC诊断中精浆中NO含量和NOS活性测定较外周血清中更有意义。早期测定精浆NO含量和NOS活性对VC的诊断和治疗具有重要的临床价值。     

Roles of Neuronal Nitric Oxide Synthase and Inducible Nitric Oxide Synthase in Intestinal Transplantation of Rats

Objective

The study was designed to evaluate the role of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) and inducible nitric oxide synthase (iNOS) in ischemia-reperfusion injury (IRI) and acute rejection (AR) in rat intestinal transplantation, by administration of nitric oxide inhibitor N^G-nitro-L-arginine methyl ester (LNAME).

Materials and methods

Rats that underwent orthotopic intestinal transplantation were assigned to 2 sets of groups: (1) iso-geneic group (Lewis-Lewis), L-NAME 0 mg/kg/d group (1-1), 4 mg/kg/d (group 1-2), or 8 mg/kg/d (group 1-3) injected intraperitoneally or (2) allogeneic group (Dark Agouti-Lewis), L-NAME 0 mg/kg/d (group 2-1) or 8 mg/kg/d (group 2-2) injected intraperitoneally. We examined survival times, light microscopy as well as maltose absorption tests. The nNOS and iNOS activities were measured by immunohistochemical methods.

Results

Histologic examination showed inhibited iNOS activity compared with group l-l, and Park scores decreased significantly in group 1-2 at 30 minutes after reperfusion (1.42 ± 0.38 vs 2.58 ± 0.49, P < .01). Both iNOS and nNOS activities were inhibited and Park scores increased significantly in group 1-3 from 30 minutes to day 3 after reperfusion (P < .0l). nNOS activity decreased and iNOS activity increased among group 2-1 during AR. Compared with group 2-1, iNOS activity was inhibited, progression of AR delayed, and survival significantly prolonged in group 2-2 (10.17 ± 0.98 vs 6.83 ± 0.75, P < .01).

Conclusion

This study suggested that decreased nNOS and increased iNOS activity both contributed to IRI and AR. More importantly, nNOS more importantly than iNOS activity was closely related to graft structure and function.     

一氧化氮合酶抑制剂对吗啡依赖大鼠睾丸细胞凋亡的影响

目的 :了解一氧化氮合酶 (NOS)抑制剂NG 硝基 左旋 精氨酸 (L NNA)对吗啡依赖纳洛酮催促戒断大鼠睾丸发育及其功能的影响 ,研究其对大鼠睾丸生精细胞凋亡的影响及其可能机制。　方法 :选用Wistar大鼠 4 8只 ,随机均分为对照组、戒断组和治疗组。以剂量递增法皮下注射吗啡建立吗啡成瘾大鼠模型 ,用纳洛酮催促戒断 ,测定戒断症状。采用放射免疫分析、原位缺口平移 (ISNT)和还原型尼克酰胺二磷酸腺苷脱氢酶 (NADPH d)组织化学等技术 ,观察大鼠睾丸钙调素 (CaM)含量、睾丸超氧化物歧化酶 (SOD)活性、还原型谷光甘肽过氧化物酶 (GSHPx)活性和睾丸凋亡细胞及其NOS阳性细胞的变化。　结果 :与对照组相比 ,吗啡依赖纳洛酮催促戒断组躯体运动神经功能和植物神经功能亢进 ,大鼠睾丸CaM含量减少 ,睾丸SOD、GSHPx活性降低 ,睾丸生精细胞凋亡和NOS阳性细胞数目明显增多 (P <0 .0 5或P <0 .0 1)。但L NNA对吗啡依赖大鼠的戒断症状及其睾丸NOS阳性细胞和凋亡细胞有明显的抑制作用 ,并可明显增加大鼠睾丸CaM ,SOD ,GSHPx的含量和活性。　结论 :吗啡依赖大鼠睾丸细胞凋亡明显增加 ,这种变化可能与睾丸NOS增加和CaM含量减少、睾丸SOD和GSHPx活性降低有关 ,但L NNA对其睾丸细胞凋亡及其相关生化指标有明显的保护作用。     

Cardiac and Regional Hemodynamic Interactions between Halothane and Nitric Oxide Synthase Activity in Dogs

Background: In vitro, halothane appears to affect the role played by nitric oxide in the regulation of vascular tone and cardiac function. In vivo, the results of the interactions between halothane and the nitric oxide pathway remain controversial. The authors investigated the effects of halothane on the cardiac and regional hemodynamic properties of N-methyl-L-arginine (NMA), a specific nitric oxide synthase inhibitor, in dogs.

Methods: Twenty-five dogs were chronically instrumented. Aortic pressure, the first derivative of left ventricular pressure, cardiac output, heart rate, and carotid, coronary, mesenteric, hepatic, portal and renal blood flows were continuously recorded. N-methyl-L-arginine was infused intravenously at 20 mg/kg over 1 min in awake dogs (n = 11) and in 1.2% halothane-anesthetized dogs (n = 10). As a control group, the remaining four dogs were studied awake and during 1.2% halothane for 2 h in the absence of NMA.

Results: In awake dogs, NMA produced a sustained pressor response (34%) and systemic vasoconstriction (40%) associated with a decrease in cardiac output (16%). Regional circulation changes included an immediate and transient increase in carotid (43%) and coronary (237%) blood flows and a subsequent decrease in carotid blood flow (25%). Hepatic and mesenteric blood flows also decreased, by 43% and 16%, respectively. Except for the coronary circulation, regional vascular resistance increased significantly. Halothane did not affect the pressor response to NMA but did blunt the cardiac output changes. Consequently, the systemic vasoconstriction after nitric oxide synthase inhibition was of shorter duration and of lesser magnitude during halothane anesthesia. Halothane also blunted the carotid, mesenteric, and renal vasoconstriction induced by NMA. Finally, in 1.2% halothane-anesthetized dogs, NMA induced a coronary vasoconstriction.