BDNF、EGFP基因修饰大鼠胚胎腹侧中脑神经干细胞的建立

目的建立脑源性神经营养因子（BDNF）、增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因修饰大鼠胚胎腹侧中脑神经干细胞（mNSCs）。方法以FuGENEHD转染试剂介导质粒pcDNA3-BDNF、pEGFPN1共转染第三代E14大鼠胚胎mNSCs。荧光显微镜观察EGFP表达情况；免疫细胞化学方法和Western blot鉴定BDNF的表达；体外诱导分化后免疫细胞化学鉴定其分化能力。结果基因转染12h后EGFP开始表达：免疫细胞化学、Western blot结果表明BDNF能在细胞中正确表达；体外诱导分化研究表明BDNF、EGFP基因修饰不影响大鼠胚胎mNSCs的增殖与分化。结论成功建立了BDNF、EGFP基因修饰大鼠胚胎mNSCs，可为进一步开展帕金森病的细胞移植治疗研究奠定基础。     

SPIO、GFP双标BDNF基因修饰中脑神经干细胞的研究

目的建立超顺磁氧化铁（SPIO）、绿色荧光蛋白（GFP）双标脑源性神经营养因子（BDNF）基因修饰中脑神经干细胞。方法以质粒pcDNA3-BDNF、pEGFPN1共转染第3代大鼠胚胎中脑神经干细胞,并用SPIO标记。荧光显微镜检测GFP的表达;免疫细胞化学、Westernblot鉴定BDNF的表达;普鲁士蓝染色、透射电镜鉴定SPIO标记。结果 GFP在基因转染12h后开始表达,24h明显增加,48h达顶峰。免疫细胞化学、Westernblot表明：细胞成功表达BDNF。普鲁士蓝染色显示：SPIO标记的中脑神经干细胞内有大量蓝染铁颗粒,细胞标记率达100%。透射电镜显示：SPIO颗粒位于吞饮小泡和细胞质内。结论成功建立SPIO、GFP双标BDNF基因修饰中脑神经干细胞,为进一步开展帕金森病的细胞移植治疗研究奠定基础。     

EGFP基因修饰大鼠胚胎中脑神经干细胞的建立

目的建立增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因修饰大鼠胚胎中脑神经干细胞。方法以质粒pEGFPNl转染培养第三代的大鼠胚胎中脑神经干细胞（mNSCs）,经G418筛选后,分别进行nestin免疫细胞化学鉴定和诱导分化后ρ-Ⅲ-／ubulin、GFAP、CNPase免疫细胞化学鉴定。结果EGFP在基因转染12h后开始表达,24h后明显增加,48h达到高峰,经G418筛选1月后有阳性克隆形成,EGFP基因修饰不影响大鼠胚胎mNSCs的增殖与分化。结论成功建立EGFP基因修饰大鼠胚胎mNSCs,为进一步开展帕金森病的细胞移植治疗研究奠定基础。     

GDNF基因修饰大鼠胚胎中脑神经干细胞的建立

目的 建立脑源性神经营养因子(GDNF)基因修饰大鼠胚胎中脑神经干细胞.方法以RT-PCR扩增GDNF基因编码序列,将其克隆至质粒pEGFPN1构建重组质粒pEGFPN1一GDNF,经酶切鉴定及序列分析后,以FuGENE HD转染试剂介导转染大鼠胚胎中脑神经干细胞.免疫细胞化学、western blot鉴定GDNF的表达,诱导分化后免疫细胞化学鉴定其分化能力.结果 RT-PCR产物为650bp的特异片段,重组质粒pEGFPN1-GDNF经酶切产生650bp和4.7kb的片段,序列分析结果与文献报道一致.免疫细胞化学、western blot表明GDNF基因修饰细胞能正确表达GDNF且基因修饰不影响其增殖与分化.结论建立GDNF基因修饰大鼠胚胎中脑神经干细胞,为进一步应用其开展帕金森病的细胞移植治疗研究奠定基础.     

荧光蛋白、超顺磁氧化铁双标胎鼠神经干细胞建立

目的 建市绿色荧光蛋白(EGFP)、超顺磁氧化铁(SPIO)双标大鼠胚胎中脑神经干细胞.方法 以质粒pEGFPN1转染大鼠胚胎中脑神经干细胞后用SPIO标记.荧光显微镜观察EGFP表达情况;普鲁士蓝染色、透射电镜鉴定SPIO标记;体外诱导分化,免疫细胞化学鉴定其分化能力.结果 基因转染12 h后EGFP开始表达;普鲁十蓝染色显示SPIO标记满意,透射电镜显示SPIO位于吞饮小泡和胞质内;体外诱导分化研究表明EGFP、SPIO双标不影响其增殖与分化.结论 成功建立了EGFP、SPIO双标大鼠胚胎中脑神经干细胞.     

大鼠胚胎腹侧中脑神经干细胞的分离培养与鉴定

目的探讨大鼠胚胎腹侧中脑神经干细胞分离、培养及鉴定的方法。方法解剖分离E14d大鼠胚胎腹侧中脑组织，经机械吹打制成单细胞悬液，接种于无血清培养基中培养，观察其增殖、分化并进行Nestin免疫细胞化学鉴定和诱导分化后β-Ⅲ-tubulin、GFAP、CNPase免疫细胞化学鉴定。结果原代培养7d后，可形成大量悬浮生长Nestin免疫阳性的神经球，经诱导分化后细胞呈GFAP、CNPase或β-Ⅲ-tubulin免疫阳性。结论建立大鼠胚胎腹侧中脑神经干细胞分离培养与鉴定的方法，为进一步开展帕金森病的细胞移植治疗研究奠定基础。     

pcDNA3-hNGFb真核表达载体的构建及其表达

目的构建人神经生长因子β（NGF-β）基因真核表达载体并观察其在L929细胞内的表达。方法以RT-PCR从人脑组织总RNA中扩增NGF-βcDNA,将其克隆到真核表达载体pcD-NA3中,经酶切鉴定和序列分析后,以Lipofectamine2000介导转染L929细胞,应用免疫细胞化学和western blot鉴定NGF-β在细胞内的表达。结果RT-PCR产物为750bp的特异片段,重组质粒pcDNA3-hNGFb酶切后产生750bp和5.2kb的片段,DNA测序证实750bp片段的碱基序列与人NGF-βcDNA完全一致。将其转染L929细胞后,免疫细胞化学、western blot结果表明NGF-β及其前体proNGF-β能在真核细胞中正确表达。结论成功构建了重组真核表达质粒pcDNA3-hNGFb,为后续的研究奠定基础。     

大鼠胚胎NSCs与人胚NSCs的比较

目的 探讨体外培养的大鼠胚胎神经干细胞（NSCs）及人胚NSCs的生长增殖特点。方法 取孕15d的大鼠，采用胰酶消化法获取海马区细胞，以106个／ml的细胞密度接种到无血清NSCs培养基中培养，分离纯化至第5代后，以10％胎牛血清（FBS）和2％多聚赖氨酸诱导分化，免疫细胞化学鉴定。同样方法分离、培养人胚海马区细胞。结果 取大鼠胚胎NSCs和人胚NSCs的细胞球及诱导分化后的细胞作免疫细胞化学染色鉴定，细胞分别呈巢蛋白（nestin）、微管蛋白（β—tubulin）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫细胞化学反应阳性。结论 大鼠胚胎海马区与人胚海马区均有NSCs存在，离体培养时能分裂增殖，并能被诱导分化，且两者形态相似，但是其生长速度、体积大小有差异。     

pEGFP-C2基因因转染恒河猴骨髓源神经干细胞的实验研究

目的 探讨恒河猴骨髓基质源神经干细胞进行基因修饰的可行性。方法 分离恒河猴骨髓基质细胞(BMSCs)，体外培养，bFGF诱导增殖，细胞生长至神经干细胞期时以Nucleofector^TM核转染仪行pEGFP—C2转染，倒置荧光显微镜观察基因表达情况，并检测细胞的活力。另外，对同期培养的未转染细胞进行神经干细胞特异性抗原-nestin和CD133抗原的免疫细胞化学检测。结果 分离得到的BMSCs能在体外培养液中进行增殖和分化．而在bFGF诱导的情况下．细胞的增殖更为明显；转染pEGFP—C2的细胞于转染后24h后即表达强绿色荧光蛋白，转染率达30％以上，且细胞的活力基本不受影响；免疫细胞化学检测可见有nestin和CD133抗原在同期培养的未转染细胞内表达。结论 灵长类骨髓基质细胞具有向神经干细胞分化、增殖的能力，bFGF能促进细胞的增殖，在神经干细胞培养条件下，可发育分化成神经干细胞；在神经干细胞阶段，应用电转染技术进行神经干细胞基因修饰是可行的，可应用于骨髓基质源神经干细胞的基因治疗领域。     

白细胞介素1β体外诱导鼠胚胎中脑神经干细胞的分化*

目的：在神经干细胞移植治疗帕金森病过程中，有效的神经干细胞体外增殖与多巴胺能神经元的大量定向诱导分化尤为关键。以白细胞介素1β为诱导剂，观察鼠胚胎中脑神经干细胞向多巴胺能神经元的分化。 方法：实验于2005-04/12在武汉大学医学院实验中心结构生物学实验室完成。①动物：清洁级孕12 d昆明鼠胚胎，由武汉大学医学院实验动物中心提供，动物质量合格证号为昆字2005，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法：分离胎鼠脑膜，取中脑组织，胰蛋白酶消化，离心过滤后机械法传代。取传代培养5~7 d的神经球，按（20~30）个/cm2接种，白细胞介素1β组加入含200 ng/L白细胞介素1β、体积分数为0.1胎牛血清的DMEM/F12培养基进行诱导分化，空白对照组单纯加入体积分数为0.1胎牛血清的DMEM/F12培养基予以自然分化。③实验评估：诱导10~12 d，待80%细胞从神经球迁移出来并分化为单细胞时行免疫细胞化学鉴定，流式细胞术检测酪氨酸羟化酶阳性细胞率。 结果：①免疫细胞化学鉴定：神经球细胞表达巢蛋白抗原，能分化为神经元特异性烯醇化酶、胶原纤维酸性蛋白阳性细胞。白细胞介素1β组可见酪氨酸羟化酶阳性细胞，胞体较大，圆形和椭圆形居多，酪氨酸羟化酶位于胞质及突起中，胞核无表达，突起呈酪氨酸羟化酶阳性神经元典型的串珠样形态。空白对照组酪氨酸羟化酶阳性神经元在数量、细胞成熟形态上均未达到白细胞介素1β组水平。②中脑神经干细胞向多巴胺能神经元分化的阳性率：白细胞介素1β组酪氨酸羟化酶阳性细胞率明显高于空白对照组（P < 0.01）。 结论：白细胞介素1β可明显促进中脑神经干细胞分化为数量足够、形态及功能成熟的多巴胺能神经元。     

新生大鼠海马区及室管膜下区神经干细胞分离、培养和分化特性

目的建立大鼠神经干细胞（NSCs）分离、培养方法，观察其生长、增殖和分化特点。方法利用无血清培养技术，从新生大鼠海马、室管膜下区分离NSCs，进行体外扩增培养、传代观察。采用荧光免疫细胞化学检测技术，观察鉴定NSCs及其分化结果。结果分离获取的细胞具有自我更新和增殖能力，原代及传代培养均可形成细胞克隆，克隆中的细胞巢蛋白（nestin）表达阳性，显微镜下观察见典型的干细胞特征，诱导后可分化神经元和星形胶质细胞。结论上法分离培养的细胞为具有自我更新和增殖能力的NSCs，可诱导分化为终末神经细胞。     

GFP^＋-大鼠胚胎脊髓源神经干细胞的培养、分化和Neuregulin-1的表达

目的:从GFP -大鼠胚胎脊髓分离和培养神经干细胞(NSC),观察NSC的分化功能和Neuregulin-1的表达。方法:从孕16d的GFP -大鼠胚胎脊髓中分离、培养神经干细胞,用免疫组织化学方法观察神经球的Neuregulin-1表达及鉴定分化的细胞类型。结果:从大鼠胚胎脊髓能分离、培养出NSC。神经球能表达Neuregin-1和Nestin,并能进一步分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结论:从GFP -大鼠胚胎脊髓能分离和培养出NSC,该NSC具有分化为用于治疗中枢神经疾病的多种神经细胞的潜能。     

SPIO、EGFP双标GDNF基因修饰中脑神经干细胞移植治疗帕金森病

目的探讨超顺磁氧化铁(SPIO)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)双标胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因修饰中脑神经干细胞(mNSCs)移植对帕金森病(PD)大鼠的治疗作用。方法将PD大鼠随机分为对照组、GFP基因修饰mNSCs移植组和GDNF基因修饰mNSCs移植组,将相应细胞移植到PD大鼠纹状体。阿朴吗啡(APO)诱导PD大鼠旋转行为评估细胞移植的治疗作用。磁共振成像、免疫荧光组织化学研究移植细胞的存活、迁移和分化。结果GDNF基因修饰mNSCs移植能显著改善APO诱导PD大鼠的异常旋转行为;大多数移植细胞停留于移植原位,移植8w后,GDNF基因修饰mNSCs移植组有更多的细胞存活并分化为多巴胺神经元。结论MR I成像可对体内移植的SPIO标记细胞进行活体示踪。GDNF基因修饰胚胎mNSCs移植可显著改善PD大鼠的运动障碍,其分子机制有待进一步研究。     

大鼠胎脑皮质神经干细胞体外培养及诱导分化的实验研究

目的 从孕龄15d SD胚胎鼠脑皮质中分离并培养神经干细胞（neural stem cells。NSCs），观察其生长、增殖及分化。方法 采用包含碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和表皮细胞生长因子（EGF）的无血清培养及单细胞克隆技术，对胚胎鼠脑皮质神经干细胞进行原代、传代培养及诱导其分化。用Nestin染色鉴定神经干细胞特性，用免疫组化方法（β-Ⅲ-tubulin、GFAP染色）检测神经干细胞分化为神经元及神经胶质细胞状况。结果 从孕龄15dSD胚胎鼠脑皮质中分离的组织，经原代及传代培养均可形成细胞克隆．切具有增殖能力。原代及传代培养细胞呈Nestin（神经上皮干细胞蛋白）表达阳性．诱导分化后的细胞表达神经元细胞、星形胶质细胞的特异性抗原。结论 本实验分离、培养的孕龄15dSD胚胎鼠脑皮质细胞Nestin表达阳性．分化后表达神经元和星形胶质细胞的标记物，是大鼠的神经干细胞，并具有多向分化潜能。     

体外培养及冻存对大鼠胚胎神经干细胞生物学特性的影响

目的体外培养、冻存、移植大鼠胚胎神经干细胞（NSCs），观察细胞生物学特性有无改变。方法取孕15d的大鼠海马区细胞，体外培养；以20％牛血清白蛋白（BSA）加10％二甲基亚砜（DMSO）作冷冻保护剂，于液氮中冻存；复苏后计数活细胞数，免疫细胞化学鉴定其分化状态；移植入C6大鼠胶质瘤模型观察其存活情况。结果第1-4代NSCs复苏后神经干细胞存活率在40％-63％之间，差异无显著性意义。冻存复苏后的NSCs能够增殖、传代，移植入胶质瘤模型体内能够大量存活。结论大鼠胚胎NSCs能够在体外增殖、分化。并且冻存复苏不影响其生物学特点和细胞活性。     

SD大鼠胚胎神经干细胞分离、培养及鉴定

目的 体外培养并鉴定神经干细胞，为相关实验研究奠定基础。方法 分离SD大鼠胎鼠的间脑，加入神经生长因子EGF和bFGF在神经干细胞条件培养基中克隆培养。用免疫细胞化学方法鉴定分离的神经干细胞。结果 分离培养的细胞具有不断增殖的能力，表达神经巢蛋白（nestin），并能经过诱导分化为神经元和神经胶质细胞。结论 成功建立了神经干细胞的分离培养方法，可用于进一步的实验研究。     

神经干细胞转染酪氨酸羟化酶基因后的分化

目的 探讨神经干细胞（NSCs）转梁酪氨酸羟化酶（TH）基因后的分化。方法 从胚胎16天Wistar大鼠室管膜前下周围区分离、增殖、鉴定NSCs；将TH基因和缺陷性逆转录病毒载体N2A构建成真核表达质粒，以电穿孔将其转入PA317包装细胞内；收集PA317包装产生的逆转录病毒颗粒，感染体外培养的NSCs，经G418筛选，获得成功转染TH基因的NSCs克隆；分别以0.4ng/ml bFGF和5％胎牛血清诱导转染及未转染TH基因的NSCs分化，比较TH基因转染及不同诱导方式对NSCs分化的影响，同时在分化细胞内检测TH的表达。结果 以0.4ng/ml bFGF诱导可使95％以上的NSCs分化为神经元，而5％FBS诱导则大多分化为神经胶质细胞，无论是否转染TH基因，神经元及神经胶质细胞的分化比例不成生改变；TH基因转染后能在神经干细胞的子代细胞内高效、稳定表达。结论 TH基因转染不影响NSCs的分化潜能，TH能在神经干细胞的子代细胞中有效表达0.4ng/ml bFGF诱导可以促使NSCs分化为神经元。     

多巴胺神经元联合中脑神经干细胞移植治疗帕金森病

目的探讨多巴胺神经元联合中脑神经干细胞移植治疗帕金森病大鼠的作用效果。方法体外分离大鼠胚胎腹侧中脑神经干细胞并行增强型绿色荧光蛋白(EGFP)修饰。分离大鼠胚胎多巴胺神经元,并用CM-Di I染料标记。构建经典的6-羟多巴胺毁损帕金森病大鼠模型。采用立体定向注射技术,将细胞移植到帕金森病大鼠纹状体区,阿朴吗啡(APO)腹腔注射诱导其偏侧旋转,评估细胞移植后运动障碍改善情况。采用免疫荧光组织化学鉴定移植细胞的定植存活、迁移及分化。结果细胞移植能显著改善帕金森病大鼠的运动障碍,以多巴胺神经元联合中脑神经干细胞移植(联合移植组)治疗最为显著,有更多的神经干细胞分化为多巴胺神经元。绝大多数移植细胞停留在移植部位,仅极少数向周围脑区迁移。结论多巴胺神经元联合神经干细胞移植治疗帕金森病大鼠可显著改善其运动障碍,其具体相关分子机制还有待进一步研究。     

大鼠胚胎神经干细胞的培养与鉴定

目的体外培养大鼠胚胎神经干细胞(NSCs),观察其生长、增殖特点。方法取孕15d的大鼠,采用机械分离法获取海马区细胞,以106个细胞/m l的密度接种到无血清NSCs培养基中培养,分离纯化至第5代。以10%胎牛血清(FBS)和2%多聚赖氨酸诱导分化,免疫细胞化学鉴定。结果取NSCs的细胞球及诱导分化后的细胞作免疫细胞化学染色鉴定,细胞分别呈小鼠抗巢蛋白(nestin)、小鼠抗微管蛋白(-βtubu lin)、豚鼠抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及小鼠抗O4免疫化学反应阳性。结论大鼠胚胎脑海马区有NSCs存在,离体培养时能分裂增殖,并能被诱导分化。     

免疫磁珠法分离、培养人脑胶质瘤干细胞

目的建立免疫磁珠法分离，并培养人脑胶质瘤干细胞的方法。方法将术中取得的脑胶质瘤标本，通过剪切、消化和吹打成单细胞悬液，筛网过滤，免疫磁珠分选试剂盒分选出CD133^＋细胞，用神经干细胞无血清培养法培养出具有单细胞克隆能力的细胞球，取第3代进行诱导分化，分化前后用免疫细胞荧光化学方法鉴定肿瘤干细胞及分化后细胞。结果免疫磁珠分选出的CD133^＋细胞，可悬浮生长并形成神经干细胞样细胞球，有较强的增殖能力，干细胞标志物巢蛋白（nestin）阳性，分化后细胞表达神经元小管相关蛋白β-3（β-tubulin3）和星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白质（GFAP）特异性抗原，而巢蛋白、CD133^＋阴性，并具有肿瘤的核型。结论免疫磁珠分选法可避免原代培养中众多细胞混杂生长的发生，能够从大量肿瘤细胞中分离出只占极少比例的肿瘤干细胞，细胞结合磁珠后在体外可以长期培养和传代，进一步证实了肿瘤干细胞的存在，并为胶质瘤干细胞的研究奠定基础。