胞液型磷脂酶A2cDNA与载体PRC/CMV连接及表达

目的选择适当的表达载体,启动胞液型磷脂酶A2(cytosolic phospholipase A2,简称cPLA2)cDNA的表达,为进一步研究各种因素对该酶活性的影响奠定基础.方法从cPLA2-PMT2重组体中获得人cPLA2cDNA片段,使之与酶切线性化的PRC/CMV载体平末端连接,并转染鼠巨噬细胞,筛选、扩增阳性细胞,提取RNA,Northern杂交法检测cPLA2 mRNA.结果应用cPLA2-PRC/CMV重组体转染鼠巨噬细胞后,经过North-em杂交检测到cPLA2cDNA的表达.结论 cPLA2-PRC/CMV是一有效的表达系统.     

sPLA2cDNA表达载体的选择和亚克隆

目的：选择适当的载体，启动Ｃａ＾２＋依赖分泌型磷脂酶Ａ２（ｓＰＬＡ２）ｃＤＮＡ的表达，为进一步研究各种因素对该酶活性的影响奠定基础。方法：首先从ｓＰＬＡ２－ｐＧＥＭ７重组体（这一重组体不能在转染的真核细胞中表达）获得人ｓＰＬＡ２ｃＤＮＡ，克隆该片断进入中间载体ＢＳＳＫ（使ｓＰＬＡ２ｃＤＮＡ两端出现ＸｂａＩ、Ｈｉｎｄ３酶切位点），选择ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｓＰＬＡ２－ＢＳＳＫ重组体进行扩增，双酶消化上     

分泌型磷脂酶A2与冠心病的关系

目的探讨分泌型磷脂酶A2（sPLA2）与冠心病的关系。方法选取心内科住院患者262例,正常者89例（对照组）,稳定型心绞痛患者63例（SAP组）,急性冠脉综合征患者110例（ACS组）。经桡动脉途径行冠状动脉造影计算各组研究对象的冠状动脉病变积分（CAS）,并采用ELISA法检测其血清sPLA2,比较分析组间差异以及sPLA2与CAS、冠心病相关因素等的关系。结果ACS组sPLA2均显著高于SAP组及对照组（均P〈0．01）,而且SAP组sPLA2也显著高于对照组（P〈0．01）。sPLA2与HDL-C呈负相关（P〈0．01）,与CAS呈正相关（P〈0．01）,但sPLA2与年龄、BMI、LDL—C无明显相关性（P〉0．05）。Cox回归分析结果示,sPLA2是冠心病的独立危险因素（P〈0．01）,但高血压、糖尿病、吸烟等未显示出其独立危险因素的作用（P〉005）。结论sPLA2可以作为冠状动脉粥样斑块不稳定的一个预测指标,其水平升高提示病情较重、预后不良。     

定向克隆构建RAB5A基因真核细胞表达载体

目的 探讨ＲＡＢ５Ａ作为蛋白质人胞信号传导调控者在肿瘤转移中的作用及影响。方法 采用双酶切、定向克隆技术建立了人ＲＡＢ５Ａ基因真核细胞表达载体ｐｃＤＮＡ３．１（－）０ＲＡＢ５Ａ。结果 测定分析证实了ＲＡＢ５Ａ基因正向插入ｐｃＤＮＡ３．１（－表达载体,免疫组化分析表明转染了ｐｃＤＮＡ３．１（－）－ＲＡＢ５Ａ表达载体的ＡＧＺＹ８３－ａ细胞系细胞内的荧光亮度明显强于转染前,蛋白电泳显示近２３ＫＤ的蛋白质     

大鼠心血管系统中Ⅱ型磷脂酶A2 mRNA表达及cDNA克隆

目的：探讨Ⅱ型磷脂酶A2（PLA2）mRNA在正常大鼠心血管系统中的分布情况,研究其基因和氨基酸顺序结构的特征,了解与心血管疾病有密切关系的PLA2。方法：从大鼠血、心肌、主动脉弓、下腔静脉近心段、腹主动脉和下腔静脉腹腔段的组织匀浆中提取总RNA,合成第一链cDNA,利用PCR扩增大鼠Ⅱ型PLA2 mRNA,并对大鼠腹主动脉的PLA2 cDNA进行克隆和序列分析。结果：在所检测的几个心血管系统组织中均能测到Ⅱ型PLA2 mRNA,大鼠腹主动脉的DNA和氨基酸结构与其他组织来源的PLA2有高度同源性。结论：Ⅱ型PLA2广泛存在心血管系统中,Ⅱ型PLA2 mRNA在血液和主动脉弓中的表达较高,提示这可能是一种有益的选择性表达,发挥着潜在的宿主防御细菌感染功能。     

ⅡA分泌型磷脂酶A_2与动脉粥样硬化的相关性研究

ⅡA分泌型磷脂酶A2(sPLA2-ⅡA)是磷脂酶超家族中的一员,主要是通过介导炎性反应,产生大量脂类介质参与动脉粥样硬化(AS)的发生发展过程,其表达受白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α等炎性因子的调节。sPLA2-ⅡA可能是通过有丝分裂原激活蛋白激酶等相关信号通路导致AS的发生。在血管平滑肌细胞表面存在sPLA2-ⅡA致AS作用的受体,阻断这些受体后,致AS的炎性因子表达减少。这些研究可能为AS诊疗提供新的思路。     

成人特发性膜性肾病与分泌型磷脂酶A2-ⅠB及抗磷脂酶A2受体抗体的相关性研究

目的探讨成人特发性膜性肾病(IMN)与分泌型磷脂酶A2-ⅠB(s PLA2-ⅠB)、抗磷脂酶A2受体抗体(Anti-PLA2R AB)的相关性。方法选取2013年7—12月武汉大学人民医院、福建医科大学附属第一医院经肾活检证实的成人IMN、继发性膜性肾病(SMN)患者共30例,其中IMN 20例、SMN 10例,另选取同时期体检健康的志愿者5例为对照组。根据24 h尿蛋白总量分为低蛋白尿组7例、中蛋白尿组11例、高蛋白尿组17例。酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清s PLA2-ⅠB水平;免疫组化法检测肾脏s PLA2-ⅠB表达;间接免疫荧光法检测血清Anti-PLA2R AB表达。结果 IMN组和SMN组血清s PLA2-ⅠB水平高于对照组(P<0.05);IMN组与SMN组血清s PLA2-ⅠB水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。IMN和SMN患者血清s PLA2-ⅠB水平与年龄、24 h尿蛋白总量呈正相关(r值分别为0.475和0.581,P值分别为0.008和0.002),与血清总蛋白、清蛋白呈负相关(r值分别为-0.487和-0.473,P值分别为0.009和0.011);多元线性回归分析结果显示,年龄、24 h尿蛋白总量与血清s PLA2-ⅠB水平呈独立正相关(P<0.05)。高蛋白尿组血清s PLA2-ⅠB水平、s PLA2-ⅠB阳性区域面积占肾小球区域面积比例高于低蛋白尿组和中蛋白尿组,中蛋白尿组血清s PLA2-ⅠB水平、s PLA2-ⅠB阳性区域面积占肾小球区域面积比例高于低蛋白尿组(P<0.05)。IMN组Anti-PLA2R AB表达阳性率60%(12/20)高于SMN组的20%(2/10)(P=0.039)。结论年龄、24 h尿蛋白总量与血清s PLA2-ⅠB水平呈独立正相关,血清s PLA2-ⅠB水平可能与IMN病情有一定相关性;IMN患者血清Anti-PLA2R AB阳性率高于SMN患者,提示Anti-PLA2R AB可能是IMN的特异性抗体,且有助于IMN与SMN的鉴别诊断。     

ⅡA分泌型磷脂酶A2与缺血性脑卒中的相关性研究

ⅡA分泌型磷脂酶A2(ⅡA-sPLA2)是来源于正常动脉壁平滑肌细胞的一种既能分解磷脂、又在血液循环和动脉壁均有促动脉粥样硬化(AS)作用的磷脂酶,可修饰及水解脂蛋白,产生大量脂质介质及引发一系列慢性炎症反应,最终使细胞内脂类蓄积,导致AS.抑制ⅡA-sPLA2活性可能有抗AS的效应.在缺血性卒中的发病风险及预防性治疗上,ⅡA-sPLA2是一个新的有待研究的因子,本文就ⅡA-sPLA2与缺血性脑卒中的关系进行综述.     

磷脂酶A2-ⅡA在直肠癌中的表达及临床意义

目的:探讨磷脂酶A2-ⅡA(PLA2-ⅡA)在直肠癌患者中的表达和临床意义.方法:采用免疫组化检测45例直肠癌标本、34例基本正常的直肠黏膜、32例直肠腺瘤组织中PLA2-ⅡA的表达水平,并观察PLA2-ⅡA表达水平与临床病理特征之间的关系.结果:直肠癌组PLA2-ⅡA表达水平明显高于直肠腺瘤组、正常组,差异有统计学意义(P＜0.05);直肠腺瘤组PLA2-ⅡA表达水平高于正常组,但差异无统计学意义(P=0.677);PLA2-ⅡA阳性表达水平随着肿瘤浸润程度加重、分化程度降低、TNM分期升高、脉管侵犯而明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:PLA2-ⅡA在直肠癌癌组织中高表达,与肿瘤浸润程度、分化程度、TNM分期、脉管是否侵犯、神经束是否侵犯有关,其可能在直肠癌的发生、发展中起重要的作用.     

弓形虫主要表面抗原基因克隆及在大肠杆菌中的表达

为在大肠杆菌中表达弓形虫主要表面抗原（ＳＡＧ１）,进一步研究其生物学功能。将ＳＡＧ１基因重组于ｐＧＥＭＥＸ－１融合型表达载体上,转化大肠杆菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）,得到含重组表达质粒ｐＧＥＭＥＸ－１／ＳＡＧ１的工程菌。结果表明ＩＰＴＧ诱导表达后,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测证实含有ＳＡＧ１蛋白。提示ｐＧＥＭＥＸ－１大肠杆菌系统可以表达具有免疫活性的ＳＡＧ１蛋白。     

HPV58E6基因的克隆及体外表达

目的克隆并体外表达HPV58E6,为E6致癌作用和疫苗的研究奠定基础.方法通过PCR方法从HPV58全基因克隆中扩增出HPV58E6基因片段,利用基因重组技术,将其克隆至真核表达质粒pcDNA3的T7启动子下游,体外转录成mRNA后,在源自网织红细胞的翻译缓冲液中表达生物素标记的HPV58E6蛋白,化学发光法检测,X光胶片曝光显影鉴定.结果酶切电泳证实质粒构建正确,SDS-PAGE电泳显示在相当于HPV58E6分子量约18.8kD的位置出现条带,X光胶片亦在相应位置出现印迹条带.结论成功表达了含有生物素标记的HPV58E6蛋白,为其致癌作用和治疗的研究奠定基础.     

斑马鱼促性腺激素释放激素基因的克隆与表达

目的克隆斑马鱼促性腺激素释放激素（GnRH）基因,构建重组质粒pQE30－GnRH并获得表达蛋白。方珐从斑马鱼脑组织提取总RNA,应用RT～PCR方法获得斑马鱼GnRHcD—NA。将该cDNA插入质粒pQE30中,并使其在大肠杆菌RB791中表达。经IPTG诱导后SDS—PAGE电泳检测蛋白的表达情况。结果斑马鱼GnRHcDNA长为207bp,编码的GnRH前体为69个氨基酸残基。与鲤鱼、鲫鱼、拟鲤、黑头软口鲦等淡水鲤科鱼类的氨基酸序列同源性比较,分别为74．4％,69．8％,73．3％和73．3％。电泳结果显示一新的分子量约为14．4kDa的特异蛋白带。结论本研究所克隆的斑马鱼GnRH基因属于GnRH－Ⅱ。构建斑马鱼GnRH原核表达质粒不仅获得大量的GnRH蛋白,还可对该蛋白做进一步分离纯化以及生物活性方面的研究。     

大鼠β-防御素-2的cDNA克隆及其在气管组织的固有表达

目的　研究大鼠β-防御素基因表达调控分子机制。方法　采用RT -PCR技术在Wistar大鼠气管组织的总RNA中扩增其特异cDNA片段 ,然后进行克隆扩增、限制性内切酶谱分析和DNA序列测定。结果　在大鼠气管组织扩增出长度为 2 1 7bp的cDNA片段 ,其RT -PCR产物经测序分析证明是大鼠β-防御素 - 2cDNA。结论　大鼠β -防御素 - 2基因在气管组织呈固有表达 ,认为与呼吸系统的抗微生物防御机制密切相关。     

转录激活因子AP-2β基因的克隆、表达及其抗体的制备

目的：克隆、表达与纯化出AP—2β蛋白质，并用所表达的蛋白质制备出抗AP—2β的抗体。方法：将AP—2β基因插入到表达载体pGEX—4T—1谷胱苷肽—S—转移酶基因下游，所得克隆经测序，以确定其阅读框码的正确性，然后用正确的克隆质粒转化E．coli BL21，用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，而后用谷胱苷肤琼脂糖—4B纯化所表达的融合蛋白质。通过凝胶迁移率变动分析实验(EMSA)测得蛋白质的生物学活性，所得蛋白质用于制备抗体。结果：得到一条大约78KD的蛋白质，并且成功的制备了抗体，所得蛋白质和抗体均具有很好的生物学活性。结论：我们成功的表达出转录激活因子AP—2β并制备出抗AP—2β的抗体，为一下步对AP—2β的功能进行研究打下了良好的基础。     

流行性乙型脑炎病毒E蛋白基因在大肠杆菌中的克隆与表达

目的;获得JEV E蛋白基因,构建重组表达载体并在E.coli中高效表达.方法:参照GeneBank中的日本乙型脑炎病毒SA14-14株序列设计一对特异性引物,采用RT-PCR法扩增E基因全长,克隆至PUCm-T载体,经测序证实后克隆至原核表达载体pET32a中,转化入BL21(DE3),IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析.结果:限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,扩增出了JEV E蛋白基因全长1500bp,成功构建了重组质粒pET-32a/JEV E,SDS-PAGE分析显示目的蛋白主要以包涵体的形式在大肠杆菌中获得表达,表达量占总菌体蛋白的35%.结论:在大肠杆菌中成功表达了JEV E蛋白,为ELISA早期诊断试剂盒的研制和E蛋白基因结构与功能的分析奠定了基础.     

HPV16L1ORF的基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的获得足够量的人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1融合蛋白及含HPV16L1ORF序列的基因重组体。方法通过PCR扩增获得HPV16L1基因片段,将此片段插入原核细胞表达载体pGEMEX-1,构建相应的重组表达质粒pGEMEX-L1,将此质粒转化大肠杆菌JMl09(DE3),得到的转化子经IPTG诱导表达后进行菌体蛋白的Western blotting免疫印迹分析。结果HPV16L1基因重组体构建成功,克隆的目的基因片段在大肠杆菌中产生的融合表达产物在Western blotting检测中具有和抗HPV16L1阳性血清反应的抗原性。结论HPV16L1基因片段可在大肠杆菌中得到有效表达,表达产物可与相应的抗血清发生阳性反应。     

88Arg IL-2的克隆构建及原核表达

目的 构建^88ArgIL-2的重组克隆,并在大肠杆菌中表达。方法 根据天然IL-2的基因序列设计含目的突变位点的引物,经PCR定点诱变技术获得^88ArgIL-2的重组克隆,插入原核表达质粒pGEX4T-2中．经IPTG诱导在大肠杆菌DH5α中表达^88ArgIL-2与GST的融合蛋白。结果 所表达的蛋白相对分子质量约为42000。Western blot检测结果表明,该蛋白具有与亲本IL-2相同的抗原性。MTT比色结果表明,^88ArgIL-2可促使IL-2依赖细胞株CTLL-2生长,具有与亲本IL-2相近的生物学活性。结论 成功构建了^88ArgIL-2的重组克隆,在原核表达系统中高效表达出融合蛋白,并且具有生物学活性。     

The cloning of Na+/Ca2+exchaanger Gene and its expression in brain ischemia

ＴＨＥＣＬＯＮＩＮＧＯＦＮａ￣＋／Ｃａ￣（２＋）ＥＸＣＨＡＮＧＥＲＧＥＮＥＡＮＤＩＴＳＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮＩＮＢＲＡＩＮＩＳＣＨＥＭＩＡＴａｎｇＪｉａｎ汤健，ＷａｎｇＹｕ王瑜，ＺｋａｎｇＣｈｅｎｈｕｉ张晨晖，Ｅ．ＣｏｓｔａＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣａｒ...     

原发性乳腺癌中p16和c-erbB-2蛋白表达的意义

我们采用免疫组化技术,检测５０例原发性朱癌Ｐ１６和ｃ－ｅｒｂＢ－２蛋白表达情况。结果显示：１７例（３４．００％）Ｐ１６基因表达阳性,２４例（４８．００％）ｃ－ｅｒｂＢ２－基因蛋白表达阳性。Ｐ１６蛋白表达与乳腺癌的临床病理因素及预后无明显相关性。ｃ－ｅｒｂＢ２－基因表达在有淋巴结转移的乳腺较多见（Ｐ＝０．０２３７）,且５年生存率低于一组（Ｐ＝０．０１６９）。Ｐ１６和ｃ－ｅｒｂＢ－２蛋白表达之间不存在