反义寡核苷酸抗肝炎病毒的研究

反义寡核苷酸指合成的２０个碱基左右的一小段核苷酸，按照Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ碱基配对原则，与特定的靶序列杂交，从而抑制基因表达，研究表明，反义寡核苷酸具有明显抗肿瘤，抗病毒及抗炎作用，已被作为一类新型药物进行开发研究，本文简要综述了反义寡核苷酸抗ＨＢＶ及抗ＨＣＶ的作用。     

反义寡核苷酸抗肝炎病毒的研究

反义寡核苷酸指合成的20个碱基左右的一小段核苷酸,按照Watson-Crick碱基配对原则,与特定的靶序列杂交,从而抑制基因表达。研究表明,反义寡核苷酸具有明显抗肿瘤、抗病毒及抗炎作用,已被作为一类新型药物进行开发研究。本文简要综述了反义寡核苷酸抗HBV及抗HCV的作用。     

反义寡核苷酸抗乙型肝炎病毒的研究进展

反义寡核苷酸(ASODN)是近十年来迅速发展起来的一种新的生物技术。它为乙型肝炎病毒(HBV)治疗提供了一种新的基因治疗途径。本文就ASODN抗HBV的研究进展:ASODN抗HBV的反义与非反义作用机制研究;ASODN的化学修饰;针对HBV各基因区关键位点的ASODN抗HBV效果评价以及利用联合或串联ASODN和靶向技术抗HBV作用的研究分三部分进行综述。     

反义寡核苷酸抗乙型肝炎病毒的研究进展

反义寡核苷酸(ASODN)是近十年来迅速发展起来的一种新的生物技术。它为乙型肝炎病毒(HBV)治疗提供了一种新的基因治疗途径。本文就ASODN抗HBV的研究进展：ASODN抗HBV的反义与非反义作用机制研究；ASODN的化学修饰；针对HBV各基因区关键位点的ASODN抗HBV效果评价以及利用联合或串联ASODN和靶向技术抗HBV作用的研究分三部分进行综述。     

乙肝病毒S基因区反义寡核苷酸对表面抗原表达的抑制作用

目前研究表明,反义寡核昔酸（ASON）在体外能有效抑制乙型肝炎病毒（HBV）基因表达的作用。本文采用卜氰乙基亚磷酸酯法,在HBVmRNAsywl亚型,S基因起始码部位,人工合成了一段16聚硫代ASON。用酶联免疫吸附法检测了作用于2．2．15细胞培养上清液乙肝表面抗原（HBSAg）的产生情况,并观察该段ASON对HBV基因HBSAg表达的抑制作用。一、材料与方法1．2．2．15细胞的培养：2．2．15细胞能转录、翻译HBV基因并产生HBsAg、HBeAg、HBVDNA以及HBV颗粒。采用RPMI1640培养液,含380mg／LG418（Sisma产品）,15％新鲜小牛血清…     

反义RNA和反义硫代寡核苷酸抗HBV转基因小鼠病毒疗效的比较

目的　比较人工合成的反义硫代寡核苷酸 (asODN )和反义RNA真核表达质粒 (PCEP4-ac)在乙型肝炎(HBV)病毒转基因小鼠体内的抗病毒作用。　方法　设计合成针对HBV -pre -c/c基因的反义硫代寡核苷酸 5‘ -CAT GCCCCAAAGCCAC -3’。构建HBV -c区反义RNA真核表达质粒 (PCEP4-ac) ,并以半乳糖 -多聚赖氨酸 (Gal15 -PLL)作肝靶向载体。将 2 0只HBV转基因小鼠分为反义寡核苷酸、反义RNA真核质粒表达、生理盐水组。靶向反义硫代寡核苷酸以每只体重 15 0ug剂量 ,反义RNA真核质粒每只 10 0ug剂量 ,尾静脉注射给药 ,对照组用同样体积生理盐水同样方法给药。　结果　注射asODN和PCEP4-aC后 7d血清HBsAg已有所下降 (P <0 .0 5 ) ;14d时显著下降 (P <0 .0 1) ,且血清HBV -DNA转阴率分别为 66.7% ( 4 /6)和 62 .5 % ( 5 /8) ,而生理盐水组无明显变化。　结论　反义硫代寡核苷酸和反义RNA真核表达质粒均能在乙肝转基因小鼠体内抑制HBV复制和表达 ,且两者在抑制作用上无明显差异性。     

反义寡核苷酸体外抗乙型肝炎病毒研究

目的 探讨反义寡核苷酸的体外抗病毒作用,为基因水平上防治乙型肝炎病毒（HBV）感染及HBV相关肝细胞癌的基因治疗提供实验依据。方法 用PCR方法分别合成了互补于HBV X基因的翻译起始区、DR2区、ENⅡ区的反义寡核苷酸（AsON)及无关序列,其中针对ENⅡ设计的AsON,目前尚未见互补于该区段反义寡核苷酸的报道。以HBV DNA转染的HepG2．2．15细胞为靶细胞,ELISA法检测AsON作用前后细胞上清中的HBsAg和HBeAg分泌情况。结果 当AsON的最佳作用浓度为10μmol/L时,3种反义寡核苷酸对HBsAg和HBeAg抑制率分别为;57％、60％、52％和56％、45％、56％,AsON对HBV抗原的凶制作用具双峰现象。无关序列无明显抑制作用（＜12％）。利用锥虫蓝染色、四甲基偶氮唑盐比色试验观察到当AsON作用浓度为40μmol/L时,对细胞代谢无毒副作用。结论反义寡核苷酸封闭HBV X基因区的关键区段,可有效抑制HBV抗原的分泌。     

SELDI技术检测反义寡核苷酸作用前后肝癌细胞培养液的差异蛋白

目的利用针对人端粒酶RNA(hTR)的反义寡核苷酸(ASODN)和正义寡核苷酸(NODN)作用于人肝癌细胞SMMC-7721,比较ASODN和NODN作用后细胞培养液蛋白的变化。方法利用SELDI技术检测差异蛋白的表达变化。对照组为未加任何处理因素的SMMC-7721细胞。结果SELDI技术检测发现,ASODN作用组有40个差异蛋白分子低表达,3个差异蛋白分子高表达。NODN作用组有37个差异蛋白分子低表达,6个差异蛋白分子高表达。所有差异蛋白分子量均小于10 000 Da。ASODN作用组中有3个低表达蛋白在NODN作用组高表达,分子量分别为3 011.99 Da、3 048.28 Da和3 248.75 Da。结论ASODN和NODN作用SMMC-7721细胞后细胞培养液中所表达的差异蛋白十分相似。     

Chk1反义寡核苷酸影响胶质瘤放疗敏感性的研究

目的：观察转染Chk1 反义寡核苷酸（ASON） 后,对照射后U251 细胞株中Chk1 表达、细胞周期及细胞凋亡的影响.方法：采用脂质体转染法,Chkl 的正义、反义寡核苷酸对U251 细胞株进行Chkl 转染.以放射线照射后,测定其细胞周期和凋亡率变化,比较Chkl 转染正义链和反义链对细胞放射敏感性的不同.用Western Blot 法检测Chk1 蛋白,Real time PCR 检测Chk1 mRNA 表达.结果：转染Chk1 反义寡核苷酸后,能明显下调Chk1 蛋白和mRNA 的表达,显著增强放射线诱导的肿瘤细胞凋亡,并消除细胞周期阻滞.结论：反义核酸技术灭活Chk1 基因显著增强放疗诱导的U251 细胞凋亡,为增敏胶质瘤的放射治疗提供了理论依据.     

PTEN反义寡核苷酸对食管癌EC9706细胞4EBP1、 eIF4E表达的影响

目的:探讨PTEN反义寡核苷酸(ASODN)抑制PTEN后对EC9706细胞4EBP1、eIF4E表达的影响.方法:利用阳离子脂质体介导PTEN的ASODN、无义寡核苷酸(N-ODN)转染EC9706细胞,终浓度为3μmol/L、6μmol/L、12μmol/L的ASODN为实验组,终浓度12μmol/L的N-ODN为无关对照组,不进行转染的为细胞对照组.运用免疫细胞化学检测浓度为3μmol/L、6μmol/L、12μmol/L作用24h、48h、72h后EC9706细胞4EBP1、eIF4E的表达.结果:PTEN的ASODN转染EC9706细胞后随浓度和时间增加4EBP1表达降低而eIF4E表达增强,在同一时间不同浓度和同一浓度不同时间差异均有统计学意义(P＜0.05);与对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.05),12μmol/LASODN作用72h效应最强.结论:PTEN反义寡核苷酸抑制PTEN后下调食管癌EC9706细胞4EBP1的表达,上调eIF4E的表达.     

抗病毒药物和干扰素的研制和应用进展

传染性病毒性疾病的抗病毒药物的发展渐趋缓侵,其主要原因是:许多病毒学家最初认为,药物虽能抑制病毒复制,但对正常细胞亦有毒性;另外,在临床症状出现时,病毒复制已达到极期,机体已遭损害;许多化合物曾在细胞培养和动物体内进行抗病毒活性评价。首次报导具有抗人类病毒活性的药物是甲吲塞腙抗天花。虽然应用有效的疫苗最终消灭了天花,但不幸的是,疫苗并不能对所有临床上重要的病毒感染均有效,故研制人工合成的或天然的抗病毒药物仍然需要。     

抗病毒药物联合应用的策略与问题

近年来,随着抗病毒治疗的不断进展,联合抗病毒治疗已成为治疗中的一个重要方案,并且较单一药物治疗显示了一定的优越性。本文就联合抗病毒治疗的性、理论依据、方法及存在问题作了综述。     

血管内皮生长因子反义寡核苷酸对大鼠异位子宫内膜的抑制作用

目的探讨血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）反义寡核苷酸（antisense ODNs）对大鼠异位子宫内膜的抑制作用。方法建立大鼠右侧壁腹膜子宫内膜异位症模型，4周后将建模成功的大鼠共计32只随机平均分为A，B，C，D4组（每组8只），腹腔内分别注射VEGF反义、正义、错义寡核苷酸2000μmol／100μl Hank’s液及生理盐水100μl，隔日1次，共4周。治疗完成2周后处死大鼠，计算药物对异位内膜的抑制率，取卵巢、在位内膜及异位内膜进行组织学检查，并测定血清雌二醇（B）、孕酮（P）水平。结果A组异位内膜体积显著缩小（P〈0.05），异位内膜抑制率显著高于其他3组（P〈0.05）；其他3组之间差异无显著意义（P〉0．05）。A组异位内膜腺体及腺上皮呈明显萎缩相，血清E2，P水平与其他3组相比，有下降趋势，但差异无显著意义（P〉0.05）。结论腹腔注射VEGF反义寡核苷酸，可以抑制大鼠异位子宫内膜的生长，使异位内膜萎缩，而对卵巢功能无明显影响。     

反义寡核苷酸治疗Duchenne型肌营养不良的研究进展

Duchenne型肌营养不良(DMD)是由抗肌萎缩蛋白基因Dystrophin发生移码突变导致的儿童遗传性致死性肌病。反义寡核苷酸(AON)靶向外显子中的剪接调控序列可以诱导Dystrophin基因的相应外显子跳读,以恢复dystrophin mRNA阅读框,是目前新的DMD治疗方法。该治疗方法的有效性已在患者来源的肌细胞及动物模型中得到证实。目前,AON靶向治疗DMD已经进入药物临床试验阶段。笔者拟对DMD的分子致病机制、AON治疗DMD的作用机制及其临床试验新进展进行综述,为AON在DMD治疗中的临床应用提供理论依据。     

神经肽Y5受体反义脱氧寡核苷酸的减重降脂作用

目的 :　探计神经肽 Y5反义脱氧寡核苷酸对高营养饮食诱导的肥胖大鼠模型的拮抗作用。方法 :　建立高营养饮食诱导的肥胖大鼠模型 ,行侧脑室内插管 ,观察肥胖大鼠注射神经肽 Y5受体反义脱氧寡核苷酸、错义脱氧寡核苷酸及生理盐水后体重和进食量的变化。结果 :　注射神经肽 Y5受体反义脱氧寡核苷酸的肥胖大鼠 ,体重和进食量明显减少 ,与注射前比较有显著性差异 ( P<0 .0 1 ) ;注射错义脱氧寡核苷酸和生理盐水对照组这两项指标未见明显下降 ( P>0 .0 5 )。结论 :　侧脑室注射神经肽 Y5受体反义寡核苷酸对营养性肥胖大鼠有明显的抑制进食和减轻体重的效应。     

Survivin反义寡核苷酸增加白血病细胞K562对化疗敏感性的观察

目的探讨Sttrvivin反义寡核苷酸（ASODN）对白血病细胞K．562对阿霉素（ADM）敏感性的影响。方法采用Sur-vivinASODN及其对照序列，脂质体转染K562细胞，MTT法观察细胞增殖；RT—PCR、Western blot观察Survivin mRNA和蛋白表达；荧光分光光度计检测Caspase-3的活性。结果ASODN＋ADM联合作用的细胞抑制率与单独应用ADM或ASODN的细胞抑制率相比呈明显增高；经转染ASODN的K562细胞分别出现Survivin mRNA和蛋白表达降低；Caspase-3的活性增加。结论Survivin ASODN能通过抑制Survivin表达，增加Caspase-3的活性而增强白血病细胞K562对ADM的敏感性。     

C-myc反义寡核苷酸对人胆管癌细胞增殖和侵袭力的影响

目的 探讨C-myc反义寡核苷酸(ASODN)对人胆管癌QBC939细胞增殖和侵袭力的影响.方法 合成C-mycASODN,并将其转染QBC939细胞;四甲基噻唑蓝(MTT)实验检测C-myc ASODN抑制QBC939细胞增殖的影响;Transwell法检测C-myc ASODN抑制QBC939细胞侵袭力的影响.结果 ASODN组细胞的存活率低于空白对照组(P<0.05);ASODN组较空白对照组的细胞穿透数目下降(P<0.01);空载体组细胞的存活率及细胞穿透数目较空白对照组差异无统计学意义(P>0.05).结论 C-myc ASODN能抑制QBC939细胞的增殖和侵袭力.     

抗病毒的新途径:反义寡核苷酸的应用

反义寡核苷酸用于调控基因表达已经成为国内外学者研究的一个热门课题。本文就反义寡核苷酸对有关抗人免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、流感病毒和水泡性口炎病毒等的研究现状作一概述。     

反义寡核苷酸作用后肝癌细胞端粒酶活性的变化及差异蛋白的表达

目的利用针对端粒酶RNA的反义寡核苷酸(ASODN)和正义寡核苷酸(NODN)作用于人肝癌细胞SMMC-7721,比较ASODN和NODN作用后癌细胞端粒酶活性及相关蛋白的变化。方法利用实时荧光定量端粒重复序列扩增法(FQ-TRAP法),检测ASODN和NODN作用后肿瘤细胞端粒酶活性变化;蛋白质芯片-飞行时间质谱仪,检测ASODN和NODN作用后特异蛋白质的变化。对照组为未加任何处理因素的SMMC-7721细胞。结果FQ-TRAP法检测CT值,A-SODN组为35.2±2.3,NODN组为26.1±3.5,对照组为18.2±0.7。蛋白质芯片-飞行时间质谱仪检测发现,ASODN组有19个差异蛋白分子高表达,13个差异蛋白分子低表达。NODN组有20个差异蛋白分子高表达,12个差异蛋白分子低表达。所有差异蛋白的分子量分布在3 000 D~10 000 D之间。结论ASODN和NODN均能抑制肝癌细胞端粒酶活性,两者作用SMMC-7721细胞后所表达的差异蛋白十分相似。     

利用反义技术进行抗病毒基因治疗

国外利用反义技术进行抗病毒基因治疗的研究进展迅速,尤其在抗HIV研究中取得了突破性进展。本文就近年国内外利用反义技术进行抗病毒基因治疗的研究进展作简要回顾。