抗人膀胱癌单克隆抗体重链可变区基因的定向克隆及序列分析

利用ＰＣＲ技术，从一株分泌鼠抗人膀胱癌单抗杂交癌细胞中扩增出重链可变区基因，并经序列分析得以证实，为一步表达和制备抗人膀胱癌单链抗体及其免疫毒素提供了重要手段。     

抗人膀胱癌单克隆抗体重,轻链可变区基因体外扩增,克隆及序列分析

应用人工合成的两套引物，从分泌抗人膀胱癌特异性单抗的杂交瘤细胞ＢＤＩ－１中提取总ＤＮＡ。以之作模板，经ＰＣＲ法扩增出重、轻链可变区基因片段。将扩增产物分别插入ＰＵＣ１９质粒，筛选出阳性克隆，用链终止法进行ＤＮＡ序列测定。结果表明：重链可变区基因全长３６６ｂｐ，编码１２２个氨基酸，属于小鼠重链可变区的ＳｕｂｇｒｏｕｐＩＩ，由种系基因中的ＶＨ与Ｄ基因的Ｄｓｐ２．２及ＪＨ４基因重排而成；轻链可变区基因全长３２４ｂｐ，编码１０８个氨基酸，属于小鼠轻链可变区的ＳｕｂｇｒｏｕｐＩＶ，由种系基因中的Ｖκ与Ｊκ４基因重排而成。与已发表的抗体可变区基因序列比较，证明它们是功能性的可变区基因     

人膀胱癌相关基因cDNA片段的克隆与鉴定

目的　分离和鉴定与人原发性膀胱移行细胞癌发生发展相关的新基因。　方法　采用mRNA差异显示技术 ,以 8例原发性膀胱移行细胞癌组织及自身远离肿瘤的正常膀胱粘膜上皮为对照 ,通过基因表达的比较 ,找出差异条带进行再扩增、克隆及DNA序列分析 ,并通过Genbank数据库进行同源性检索。　结果　 (1)共分离并回收差异条带 37条。其中正常组织不表达或低表达而肿瘤组织出现表达或表达增强者 36条 ,正常组织表达而肿瘤组织失表达者 1条。 (2 )差异条带中与TBX3基因 (T box3基因 )同源 1条 ,同源性 99% ;与铜 ,锌 超氧化物歧化酶基因 (Cu ,Zn SOD基因 )同源 1条 ,同源性 99% ;与Ca2 激活氯离子通道基因家族成员 4 (cl.Ca4基因 )同源 1条 ,同源性 99% ;3条与人类已知基因或片段无明显同源 ,分别命名为YHHQ1,XHL ,LHX。　结论　Cu ,Zn SOD基因可能是新的与膀胱癌相关的癌基因。TBX3及cl.Ca4基因可能与人膀胱癌有相关性。YHHQ1可能是膀胱癌相关的候选抑癌基因 ;XHL ,LHX可能是与膀胱癌相关的候选癌基因     

抗膀胱癌单克隆抗体导向的粘附性LAK细胞体外抗膀胱癌作用的研究

为了进一步探索治疗膀胱癌的新途径，用人体脾脏组织制备粘附性淋巴因子激活的杀伤细胞（Ａ－ＬＡＫ细胞），通过生物素－亲和素系统将抗人膀胱癌单克隆抗体（ＢＤＩ－１）与Ａ－ＬＡＫ细胞偶联构建出ＢＤＩ－１－Ａ－ＬＡＫ细胞偶联物。采用４小时５１Ｃｒ释放法测定ＢＤＩ－１－Ａ－ＬＡＫ细胞偶联物体外对人膀胱癌ＢＩＵ－８７细胞的杀伤率，结果显示，扩增５天从每克人脾脏组织可制备得５．５×１０８个Ａ－ＬＡＫ细胞，ＢＤＩ－１－Ａ－ＬＡＫ细胞偶联物对ＢＩＵ－８７细胞具有较强的特异性杀伤作用。提示ＢＤＩ－１－Ａ－ＬＡＫ细胞偶联物可望用于膀胱癌导向治疗     

抗人膀胱癌单克隆抗体188Re标记及荷瘤裸鼠体内放射性分布

目的　制备放射免疫导向药物用以诊断和治疗膀胱癌。　方法　通过 2 巯基直接还原标记法将放射性核素188Re(188铼 )标记抗人膀胱癌单克隆抗体BDI 1,标记产物188Re BDI 1经尾静脉注入荷人膀胱癌裸鼠体内 ,检测其在裸鼠体内的放射性分布。　结果　188Re BDI 1的标记率为30 % ,放射化学纯度为 90 % ,免疫活性分数为 5 8.6 8%。在裸鼠体内 ,肿瘤对188Re BDI 1的摄取率在2 3h达到高峰 ,以后随时间推移 ,逐步下降。 2 3h时T/NT比值 (肿瘤与正常组织的放射性计数之比 )明显增加 ,平均T/NT为 4.42 ,最大为 16 .19(肿瘤 /肌肉 ) ,随时间推移T/NT比值有所下降 ,48h时T/NT比值仍保持在高水平 10 .41(肿瘤 /肌肉 )、70h时T/NT比值 3.41(肿瘤 /肌肉 )。结论　188Re BDI 1在裸鼠体内对膀胱癌移植瘤有靶向定位作用。188Re BDI 1有可能成为膀胱癌放射免疫显像和治疗的导向药物。     

~（131）I－抗膀胱癌单克隆抗体对荷瘤裸鼠的放射免疫治疗研究

用~（１３１）Ｉ标记的抗ＢＩＵ－８７ＭｃＡｂ对荷人膀胱癌裸鼠进行放射免疫治疗，结果显示对肿瘤有明显的抑制作用。高剂量组（１４８００ｋＢｑ组）疗效明显优于低剂量组（７４００ｋＢｑ组），其治疗后第４周对肿瘤的抑制率分别为９９％及７２％。未发现１４８００ｋＢｑ~（１３１）Ｉ－抗ＢＩＵ－８７ＭｃＡｂ对小鼠产生毒性。     

抗人膀胱癌/抗血管内皮生长因子双功能基因抗体对膀胱癌的生长抑制作用

目的　对抗人膀胱癌 /抗血管内皮生长因子 (VEGF)双功能基因抗体进行免疫定位研究并观察其对人膀胱癌生长的抑制作用。　方法　采用免疫组化和免疫电镜前染色法对 6 0例膀胱癌患者的手术切除标本进行免疫定位研究 ;构建人膀胱癌裸鼠皮下移植瘤模型并注射双功能抗体 ,观察肿瘤生长情况 ,同时检测肿瘤微血管密度 (MVD)值及肿瘤细胞凋亡指数 (AI)。　结果　 6 0例膀胱癌标本 ,抗原检测阳性 5 3例 ( 88.3% ) ;对照组 2 0例 ,抗原检测阳性 1例 ( 5 .0 % )。治疗后第 2周 ,实验组小鼠皮下种植肿瘤大小 ( 2 1.4 7± 6 .5 7)mm2 ,对照组 ( 5 9.85± 15 .4 3)mm2 ;实验组MVD 2 14 8± 10 9,对照组为 4 0 5 6± 36 7;实验组肿瘤细胞AI为 17.2 6 ,对照组为 7.0 9。组间比较 ,差异均有显著性意义。　结论　抗人膀胱癌 /抗VEGF双功能基因抗体对人膀胱癌有较好的靶向性 ,能够通过抑制肿瘤微血管形成和加速肿瘤细胞凋亡而抑制实验性人膀胱癌的生长     

抗人膀胱癌单克隆抗体的^99mTc标记及荷瘤裸鼠放射免疫显像

抗人膀胱癌单克隆抗体ＢＤＩ－１通过２－巯基乙醇直接还原法标记９９ｍＴｃ制备了９９ｍＴｃ－ＢＤＩ－１。质量控制实验结果表明，标记率为６９．９％，分离纯后标记抗体的放化纯度高于９０％。标记抗体的免疫活性分数为８１％，亲和常数为１．２２×１０－９Ｍ－１。在上述结果基础上，研究了标记抗体在荷人膀胱癌裸鼠体内的分布及放射免疫显像。９９ｍＴｃ－ＢＤＩ－１经尾静脉注射后，分别在４、１６及２２小时γ照相后断颈处死小鼠，取脏器称湿重并计数。９９ｍＴｃ－ＢＤＩ－１注射后２２小时肿瘤清晰显示，肿瘤对标记抗体的吸收率为２０．７％ＩＤ／ｇ；平均Ｔ／ＮＴ为１０．５２，最小Ｔ／ＮＴ为２．９０（肿瘤／肾脏）；最大Ｔ／ＮＴ为２０．７（肿瘤／小肠或肌）。上述研究结果为进一步临床应用奠定基础     

抗膀胱癌单克隆抗体导向的粘附性LAK细胞体外抗膀胱癌作…

为了进一步探索治疗膀胱癌的新途径，用人体脾脏组织制备粘附性淋巴因子激活的杀伤细胞，通过生物素－亲和素系统将抗人膀胱癌单克隆抗体与Ａ－ＬＡＫ细胞偶联构建出ＢＤＩ－１－Ａ－ＬＡＫ细胞偶联物。采用４小时＾５１Ｃｒ释放法测定ＢＤＩ－１－Ａ－ＬＡＫ细胞偶联物体对外人膀胱癌ＢＩＵ－８７细胞的杀伤率。     

用体外基因扩增技术探讨膀胱癌病毒病因

以体外基因扩增技术－聚合酶链反应，对６８例膀胱癌标本，２０例膀胱粘膜及８例正常人血淋巴细胞进行人乳头瘤病毒基因检测。新鲜标本ＨＰＶ－１６阳性率为５２．８％：Ｔａ～１为３６％，Ｔ２～３为７１．４％，ＧⅢ为６９．２％。ＨＰＶ－１８阳性率为４．４％。对照标本均为阴性。提示ＨＰＶ－１６在膀胱癌病因中有一定影响。     

癌基因c—erbB2在膀胱移行细胞癌中的扩增与过表达

应用原位杂交和免疫组化对９３例膀胱移行细胞癌中癌基因ｃｅｒｂＢ２进行研究。８例（８６％）显示ｃｅｒｂＢ２的基因扩增，扩增与肿瘤病理分级呈正相关（Ｐ＜００５）。２４例（２５８％）显示ｃｅｒｂＢ２的蛋白过表达，过表达与肿瘤病理分级（Ｐ＜００１）、临床分期（Ｐ＜００５）及复发（Ｐ＜００５）均呈正相关。提示在膀胱移行细胞癌中，ｃｅｒｂＢ２的过表达比扩增具有更重要的临床意义。     

Immunoscintigraphy with iodine-131-labelled monoclonal antibody AUA1 in patients with transitional cell carcinoma of the bladder

The monoclonal antibody AUA1, labelled with 2 or 3 mCi iodine-131, was administered intravesically to 11 patients with known or suspected bladder carcinoma and was kept in the bladder for 1 h. All patients underwent immunoscintigraphy of the bladder at 2 h and three patients also at 20 h after instillation. Conventional histological and immunohistochemical examinations were performed on tissue samples from tumour and normal areas taken during cystoscopy, carried out 24-h after the instillation. Transitional cell carcinoma of the bladder was present in nine patients whereas dysplastic and normal urothelium was found in the remaining two patients, respectively. Six out of nine tumours were successfully imaged at the 2-h scan. Normal urothelium showed no uptake while dysplastic urothelium was positive on imaging. Successful detection was correlated with size and grade of tumour in almost all cases. Tumors with a diameter of 1 cm or less were not detected. Four out of five grade II tumours and two out of three grade III tumours were detected with this method. The method is a promising one although further studies using more suitable isotopes and/or monoclonal antibodies are required to increase its sensitivity.     

膀胱肿瘤表皮生长因子受体基因扩增及其表达的研究

为了探讨膀胱肿瘤表皮生长因子受体（ＥＧＦｒ）过表达的分子生物学行为，采用核酸分子杂交、免疫组织化学技术研究了１３例膀胱移行细胞癌ＥＧＦｒ基因扩增，ｍＲＮＡ和受体表达状况，并相互进行了比较。结果表明：１３例膀胱肿瘤中ＥＧＦｒ基因未见扩增，５例ｍＲＭ过表达，７例ＥＧＦｒ阳性，但二者表达的量并无相关性。提示在膀胱肿瘤中ＥＧＦｒ基因扩增并不普遍，而其ｍＲＮＡ及受体过表达则较常见，推断可能系ＥＧＦｒ基因转录和翻译调控机制异常引起。     

Intravesical administration of tumor-associated monoclonal antibody AUA1 in transitional cell carcinoma of the bladder: a study of biodistribution

Summary Forty-five patients known or suspected to have transitional cell carcinoma of the urinary bladder underwent intravesical administration of either AUA1 tumor-associated monoclonal antibody or 11.4.1. nonspecific monoclonal antibody. Antibodies were radiolabeled with iodine-131, diluted in 50 ml normal saline and remained in the bladder for up to 1 h. During cystoscopy or transurethral resection of the tumor, tissue samples were taken from normal and malignant areas and were counted for radioactivity in a gamma counter. Blood samples were also measured for radioactivity. Mean uptake of AUA1 at 2, 20, 40 and 60 h after administration (expressed as 10³ x percentage of injected dose/gram of tissue) was: 1.77±3.2, 1.28=1.67, 0.72±0.94 and 0, respectively in the tumor and 0.79±0.83, 0.14±0.34, 0.033±0.06, and 0 in normal tissue. Mean uptake of 11.4.1 at 2 and 20 h was: 0.47±0.42 and 0.018±0.015, respectively, in tumor and 0.2±0.19 and 0.013±0.002 in normal samples. No remarkable radioactivity was found in blood samples. Conventional and immunoperoxidase staining were also performed. Mean uptake of AUA1 by the tumor increased as the degree of tumor differentiation decreased. Our findings indicate that intravesical administration of AUA1 results in selective immunolocalization of AUA1 in intermediate and high-grade transitional cell carcinoma. This may allow the development of a new method for bladder carcinoma treatment or prophylaxis against recurrence.     

三氧化二砷抗膀胱癌作用机制的实验研究

目的 观察三氧化二砷(As2O3)对膀胱癌T24细胞株生长、Caspase-3基因表达以及裸鼠移植瘤体积及质量变化的影响. 方法 以不同浓度的As2O3加入对数生长期的T24细胞并设立对照组,分别培养24、48、72 h,噻唑盐比色法检测膀胱癌细胞生长抑制情况,荧光染色观察细胞核形态变化,流式细胞术检测As2O3对细胞凋亡率的影响,蛋白质印迹法检测As2O3对Caspase-3蛋白表达的影响;将对数生长期T24细胞接种于30只裸鼠背部皮下,3周成瘤后随机分为As2O3腹腔注射组、皮下注射组及对照组,用药2周后处死裸鼠测量药物作用前后裸鼠瘤体积及质量变化. 结果 随着As2O3浓度增加及时间延长,T24细胞生长抑制率由(25.8±1.1)%增加至(86.6±1.6)%,其中各实验组与对照组比较、实验组各时间段比较、各实验组与前一组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.05);随着As2O3作用时间延长,荧光显微镜下可见细胞核内荧光增强,细胞核呈新月形改变等凋亡形态学变化; T24细胞凋亡率由29.6%增加至60.6%;Caspase-3表达分别为对照组的1.15、1.98及2.76倍,差异具有统计学意义(P＜0.05);As2O3腹腔注射组及皮下注射组鼠瘤体积分别为(2612.9±77.7)及(1908.2±102.3)mm3,瘤重分别为(2.0±0.9)及(0.7±0.7)g,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),皮下注射组与腹腔注射组间差异亦有统计学意义(P＜0.05). 结论 As2O3对膀胱癌T24细胞生长和裸鼠移植瘤均有抑制作用,其抗癌机制可能与增加Caspase-3蛋白表达有关.     

UNME/K1: an IgG2a monoclonal antibody specific to cytokeratin of human urinary bladder squamous cell carcinoma

Summary The main distinctive feature of carcinoma in schistosomal bladder is keratinized squamous cell carcinoma. Keratins/cytokeratins constitute a multigeneic family of structurally related polypeptide markers for the malignant state of epithelial cells. A monoclonal antibody (UNME/K1) regognizing keratins associated with squamous cell carcinoma of the human urinary bladder was generated at the Urology and Nephrology Center, Mansoura, Egypt (UNME), by fusion of spleenocytes from a BALB/c mouse immunized with a keratin extract (K1) of human squamous cell carcinoma and P3X63Ag8/U1 syngeneic myeloma cells. UNME/K1 was purified by a protein-A affinity column and was of the IgG2a type, as determined by immunoelectrophoresis and gel diffusion techniques. When tested against keratins of different types of urinary bladder tumors using enzym linked immunosorbent assay (ELISA), UNME/K1 reacted only with the high molecular weight keratin of squamous cell carcinoma and showed selectivity towards specific histopathological grades of tumors.     

p53单抗M126在膀胱移行细胞癌中的表达及其意义

目的探讨Ｍ１２６与膀胱移行细胞癌的组织学分级和病理分期之间的关系。方法用ＰＣＲ扩增编码ｐ５３Ｎ端１８０个氨基酸的ＤＮＡ片断并将其克隆在谷胱苷肽转移酶（ＧＳＴ）的表达质粒ＰＧＥＸ２Ｔ中。用重组质粒转化大肠杆菌，诱导产生ｐ５３ＧＳＴ融合蛋白，免疫小鼠，制备Ｍ１２６单抗。用Ｍ１２６对６０例膀胱移行细胞癌石蜡切片进行免疫组化染色，结果４６例（７７％）表达融合蛋白，平均阳性细胞指数为（３４５±２９．０）％，并与肿瘤的组织学分级和病理分期相关（Ｐ＜０００１，Ｐ＜００５）。与进口单抗ＰＡｂ１８０１相比较，Ｍ１２６识别不同的抗原表位，染色强度和阳性细胞指数均明显增高，而且对不经微波修复的抗原也有很好的反应性。结论作为第一株国产抗ｐ５３单抗，Ｍ１２６将在肿瘤ｐ５３表达和突变的研究中发挥重要的作用     

抗人膀胱癌单克隆抗体BDI-1的扩增和鉴定

目的 制备纯化的抗人膀胱癌单克隆抗体BDI-1。方法 给BALB／C小鼠腹腔注射BDI-1杂交瘤细胞，收集的腹水过Protein G-agaros亲和层析柱即得到人膀胱癌BDI-1单克隆抗体。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法、间接免疫荧光法、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法和点印迹法鉴定单克隆抗体。结果 腹水可以得到1．0～1．5g／L的高效价（10^6）的纯化抗体。结论 该方法可以扩增高效价的单克隆抗体。     

P53,Ras基因突变及HPV感染与膀胱癌的关系

应用分子生物学方法检测３２例膀胱移行上皮癌中Ｐ５３、Ｋ－ｒａｓ、ＨＰＶ基因，发现有３４．４％的膀胱癌Ｐ５３基因突变，２１．９％膀胱癌Ｋ－ｒａｓ基因突变，６．３％膀胱癌ＨＰＶ阳性。说明膀胱移行上皮癌的发生与Ｐ５３、Ｒａｓ基因突变及ＨＰＶ感染有关。膀胱癌的发生是多种基因的变化通过多种途径引起的。