正反p33ING1b对人类胰腺癌细胞SW1990生长的影响

目的:探讨p33ING1b和wtp53体外对胰腺癌细胞生物学活性的影响.方法:脂质体法将正义和反义p33ING1b以及wtp53单转染和共转染胰腺癌细胞SW1990;Western印迹法检测p33ING1b和wtp53蛋白表达水平;流式细胞术检测细胞周期改变情况;特殊染色观察细胞凋亡情况.结果:转染p33ING1b组和共转染p33ING1b和wtp53组,两者蛋白水平明显较反义组和空转组高(P<0.05);共转组SW1990细胞生长周期较其他各组缩短;转染p33ING1b组和共转染p33ING1b和wtp53组,两者凋亡细胞数目较反义组和空转组多.结论:p33ING1b对细胞可能存在正性调控作用,这种作用可能主要通过p53来发挥作用的.     

稳定高效表达p21~(WAF1/CIP1)的HCT/8-WAF1细胞株的建立

目的 :建立高效、稳定表达 p2 1 WAF1/ CIP1大肠癌细胞株 HCT/8- WAF1。方法 :应用阳离子脂质体分别将带有目的基因 WAF1的 pc DNA3及空白 pc DNA3质粒转染大肠癌细胞株 HCT/8,经G41 8进行阳性筛选 ,将筛选的阳性细胞连续传代培养 ,应用免疫荧光技术监测 p2 1 WAF1/ CIP1的表达。结果 :经 G41 8筛选后 ,空白对照细胞全部死亡 ,转染目的基因及空质粒组的细胞存活 ,可连续传代培养 30代以上 ,并选择 HCT/8作对照 ;免疫荧光技术监测 p2 1 WAF1/ CIP1表达结果显示转染目的基因的 HCT/8细胞 p2 1 WAF1/ CIP1表达阳性细胞率 ( 89.96% )显著高于转染空质粒组 ( 8.0 2 % )和空白对照组 ( 3.39% ) ( F=1 6 60 8.99,P<0 .0 0 1 ) ;各代间差异无显著性 ( F=2 .1 71 ,P>0 .0 5 )。结论 :HCT/8- WAF1是一株高效、稳定表达 p2 1 WAF1/ CIP1的大肠癌细胞株     

共转染p53和反义p21~(WAF_1/CIP_1)基因对肾癌细胞凋亡调控作用的实验研究

目的 :探讨 p5 3基因在 GRC- 1肾癌细胞系中的作用途径和 p2 1 WAF1 /CIP1 在 wt-p5 3介导的细胞凋亡中的作用。方法 :使用脂质体共转染方法将 wt- p5 3与反义 p2 1 WAF1 /CIP1基因导入 GRC- 1肾癌细胞系中 ,对所获转染细胞进行细胞周期分析和阿霉素诱导细胞凋亡试验。结果 :在 wt- p5 3基因与反义 p2 1 WAF1 /CIP1 基因共转染后 GRC- 1肾癌细胞中 ,wt- p5 3基因的自发凋亡现象消失、亚致死量的阿霉素诱导下存活细胞数的增加。结论 :在 GRC- 1肾癌细胞中 ,wt- p5 3基因介导的细胞凋亡至少部分是通过 p2 1 WAF1 /CIP1 基因发挥作用。p2 1 WAF1 /CIP1基因可能作为一个与细胞凋亡的相关基因调控肾癌细胞的生与死     

乙型肝炎病毒X蛋白和p14ARF依赖性、非依赖性途径对肝癌细胞生长的影响

目的 探讨乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)是否通过p14ARF途径影响肝癌细胞生长及其作用机制.方法 将HBx及p14ARF单转染及共转染含野生型p53但不表达p14ARF脚的肝癌细胞株HepG2.实验分为pcDNA3、pcDNA3HBx、pcDNA3p14ARF、pcDNA3HBx+pcDNA3p14ARF4组.通过流式细胞仪比较各转染组HepG2细胞凋亡、细胞周期的变化情况.用含p53结合位点p21WAF1胴启动子荧光素酶活性检测和Western blotting观察各转染组细胞p14ARF、MDM2、p53、p21WAF1蛋白表达水平的变化.结果 HBx及p14ARF脚单转染及共转染含野生型p53但无p14\ARF表达的HepG2细胞,单转染HBx及p14ARF组其细胞凋亡率(14.11%、13.72%)、G0/G1期阻滞细胞数(63.62%、61.75%)、p21WAF1启动子荧光素酶活性(1.25±0.05、1.09±o.06)及p53、p21 WAF1蛋白的表达较对照组(10.66%、57.42%、0.77±0.03)明显升高,而共转染组与单转染p14ARF组相比其p14ARF蛋白表达及上述各项指标(18.61%、66.74%、3.53±0.43)又进一步升高.结论 HBx通过依赖及非依赖p14ARF途径诱导p53表达从而导致激活p21WAF1,进而引起细胞周期G0/G1期的阻滞及细胞凋亡的增加.     

p33ING1b真核表达质粒构建及其对胃癌细胞株生长抑制凋亡的作用

目的：构建pCDNA3/p33^ING1b真核表达质粒,探讨其对胃癌细胞株的生长抑制、凋亡的作用,探索新型的肿瘤治疗措施与方法. 方法： 构建pCDNA3/p33^ING1b真核表达质粒,将p33^ING1b转染至人胃癌细胞SGC-7901,研究其对胃癌细胞产生的作用. 结果： 重组pCDNA3/p33^ING1b真核表达质粒构建成功,经p33^ING1b转染的人胃癌细胞株SGC-7901生长速度减慢,融合时间变长,周期S期变短,G0/G1期延长,凋亡增加. 结论： 重组pCDNA3/P33ING1b质粒能在胃癌细胞SGC-7901细胞内表达,且能抑制胃癌细胞SGC-7901的生长并促进其凋亡.     

胃癌组织中p33~(ING1)、p53基因蛋白的表达及其临床意义

目的　探讨 p33ING1基因蛋白在胃癌中表达的临床意义及其相互关系。方法　应用Envision免疫组化法检测71例胃癌、12例胃粘膜不典型增生患者p33ING1、p5 3基因蛋白的表达 ,并与正常胃粘膜及慢性胃炎粘膜 18例对照。结果　粘膜不典型增生组及对照组中 p33ING1均阳性表达 (10 0 % ) ,而胃癌中表达 6 2 .0 % (4 4/ 71) ,明显下降 ,与前两组之间差异显著 (P <0 .0 1) ;胃癌中 p33ING1表达与肿瘤的浸润、淋巴结的转移及分化有关 (P <0 .0 1) ;p5 3表达与肿瘤大小、浸润、淋巴结转移有关 (P <0 .0 1)。结论　p33ING1是抑癌基因 ,在胃癌中表达下降 ,对胃癌发生、发展可能起重要作用 ,p33ING1和 p5 3在胃癌中表达有相关性 (P <0 .0 5 )。p33ING1与 p5 3野生型基因互相协同、依赖 ,抑制细胞生长 ,促进凋亡。检测胃癌患者p33ING1的水平 ,对p5 3介导的基因治疗有重要意义。     

野生型p53基因转染对卵巢癌细胞株端粒酶活性的影响

目的 :探讨野生型 p5 3(wt- p5 3)基因转染对卵巢癌细胞端粒酶活性的影响。方法 :利用脂质体介导 ,将含有人全长 wt- p5 3基因 c DNA的真核表达载体质粒 p CEP4 / p5 3和空载体质粒 p CEP4分别转染人卵巢浆液性乳头状囊腺癌 SKOV3细胞株 ,分别命名为 SKOV3- p CEP4 / p5 3细胞 (C组 )、SKOV3- p CEP4细胞 (B组 ) ,另设 SKOV3细胞为空白对照组 (A组 ) ,观察 3组细胞周期和端粒酶活性变化。结果 :外源性 wt- p5 3基因在 C组细胞中获表达 ,而 A、B组细胞中无 wt- p5 3基因的表达。流式细胞仪检测示 C组细胞 G0 ～ G1 期百分比 (5 7.79% )及凋亡细胞率 (13.91% )均高于 B组 (46 .0 2 %、2 .0 8% )和 A组 (43.6 2 %、0 ) ,差异有显著性 (P <0 .0 1) ,A、B、C3组细胞中端粒酶活性均呈阳性 ,但 3组细胞端粒酶活性无显著性差异 (P =0 .6 5 )。结论 :wt- P5 3基因转染可介导 SKOV3细胞 G0 ～ G1 期停滞和诱导细胞凋亡 ,但对 SKOV3细胞内端粒酶活性无影响     

逆转录病毒介导的p53基因对食管癌细胞株的生长抑制作用

目的 :观察人类野生型 p5 3(wtp5 3)基因对人食管癌细胞系的抑制作用。　 方法 :用逆转录病毒为载体 ,将外源性wtp5 3基因导入人食管癌细胞系ECA10 9,通过体外及小鼠体内实验研究转入基因的表达及其对肿瘤的抑制作用。　结果 :p5 3在转染细胞ECA10 9/p5 3中表达水平提高。外源性wtp5 3基因的导入和表达能使ECA10 9细胞的生长速度减低 ,软琼脂集落形成能力下降 ,G0 G1期细胞比例增加、S期细胞比例降低 ,调亡指数升高 ,裸鼠体内成瘤能力明显下降。　结论 :逆转录病毒载体介导的外源性wtp5 3基因能够抑制人食管癌细胞生长     

MDM2癌基因对野生型p53基因诱发凋亡的抑制作用

目的 　研究 MDM2癌基因与野生型 p5 3基因在细胞凋亡发生中的相互关系。方法　 构建了一个表达人野生型 ( wt) p5 3逆转录病毒载体 ,经 PA31 7细胞包装后转染人胰腺癌细胞 ( PC- 2 ) ,建成 PC- 2 /swtp5 3转化细胞系。再用含 MDM2基因的p CMV- MDM2载体转染 PC- 2 /swtp5 3细胞 ,获得双重转染细胞系 PC- 2 /swtp5 3/p CMV- MDM2。用流式细胞技术 ,原位检测分析和 DNA凝胶电泳分析细胞凋亡。结果　 恢复 wtp5 3表达的胰腺癌细胞系 ( PC- 2 /swtp5 3)细胞凋亡明显增多 ( >1 2 % ) ,而双重转染的细胞系 ( PC- 2 /swtp5 3/p CMV- MDM2 )则凋亡细胞数明显下降 ( 3.2 % )。结论　 MDM2癌基因可抑制由野生型 p5 3基因诱发的细胞凋亡。     

PCDNA3/p33ING1、wt-p53转染对胃癌细胞株SGC-7901生长抑制及凋亡的影响

目的 研究p33^ING1基因与p53基因间的协同功能对胃癌细胞生长抑制和细胞凋亡的影响。方法 构建PCD—NA3／p33^ING1真核表达质粒（正义，反义）与wt—p53质粒，将其单、共转染至胃癌细胞株SGC-7901；应用流式细胞仪检测细胞生长周期曲线比例；TUNEL法、MG-P-MY法染色观察SGC-7901的凋亡情况。结果 p33^ING1单转染和wt-p53共转染的SGC-7901胃癌细胞株较反义组和转染空载体组细胞生长速度减慢。细胞周期G0／G1期延长，S期变短（P〈0．05），细胞调亡数增加（P〈0．05）。结论 p33 ING1具有抑癌功能及生物活性．与p53基因共同抑制胃癌细胞的生长，诱导细胞的凋亡，使细胞周期阻滞。二者呈协同依赖关系。     

反义p21WAF1/CIP1基因转染对肾癌细胞凋亡抑制作用的影响

目的 探讨p21^WAF1/CIP1基因在顺铂诱导的GRC-1肾癌细胞凋亡过程中的作用。方法 使用脂质体转染方法将正义p21^WAF1/CIP1基因及反义p21^WAF1/CIP1基因基因分别导入GRC-1肾癌细胞系中，对所获转染细胞进行形态学观察和流式细胞仪检测。结果 在正义p21^WAF1/CIP1基因基因转染后GRC-1肾癌细胞中，顺铂诱导细胞凋亡的作用增强；在反义p21^WAF1/CIP1基因基因转染后GRC-1肾癌细胞中，顺铂诱导细胞凋亡的作用受到抑制。结论 在GRC-1肾癌细胞中，顺铂诱导的细胞凋亡至少部分是通过p21^WAF1/CIP1基因基因发挥作用。p21^WAF1/CIP1基因基因作为一个与细胞凋亡的相关基因可能参与肾癌细胞凋亡的调控。     

外源性p21WAF1/CIP1基因转染对人胶质瘤细胞生长和细胞周期的影响

目的：探讨外源性p21^WAF1／CIP1基因对胶质瘤细胞生长和细胞周期的影响．方法：采用脂质体介导法将p21^WAF1／CIP1基因质粒转导人人胶质瘤细胞系SHG44细胞，然后用电镜、流式细胞仪等技术对细胞形态、生长及细胞周期进行观察。结果：酶切电泳和斑点杂交显示p21^WAF1／CIP1基因成功的转染至SHG44细胞。转染p21^WAF1／CIP1基因的细胞光镜及电镜下可见凋亡产生；生长速度明显慢于亲代细胞，其倍增时间约是对照细胞的二倍；细胞周期发生明显改变，G1期明显增多，S期明显减少．结论：外源性p21^WAF1／CIP1基因对SHG44细胞的生长和细胞周期有明显的抑制作用，并可诱导细胞凋亡产生。     

重组核心蛋白聚糖转染对HepG2细胞p21WAF1/CIP1表达的影响

目的：将已构建完成的分泌型核心蛋白聚糖真核表达载体转染到HepG2细胞中并检测核心蛋白聚糖及p21^WAF1/CIP1的表达,探讨核心蛋白聚糖抗肿瘤作用的机制。方法：HepG2细胞分为转染pcDNA3.1-DCN载体的转染组和转染pcDNA3.1空载体的对照组,脂质体介导核心蛋白聚糖真核表达载体及质粒pcDNA3.1载体分别转染到HepG2细胞中,经G418筛选建立稳定转染的细胞株,采用RT-PCR法检测核心蛋白聚糖和p21^WAF1/CIP1 mRNA表达;Western blotting法检测核心蛋白聚糖和p21^WAF1/CIP1蛋白质的表达;免疫组化法检测核心蛋白聚糖蛋白质的表达。结果：RT-PCR检测转染组细胞核心蛋白聚糖及p21^WAF1/CIP1 mRNA表达的灰度比值均高于对照组 (P<0.05),Western blotting检测核心蛋白聚糖及p21^WAF1/CIP1 蛋白质表达的灰度比值也高于对照组 (P<0.05),免疫组化检测转染组细胞核心蛋白聚糖蛋白质表达的阳性细胞计数高于对照组 (P<0.05)。结论：成功建立了稳定转染核心蛋白聚糖的HepG2细胞株,并证实核心蛋白聚糖能够提高p21^WAF1/CIP1mRNA和蛋白质的表达。     

MDM2、p53和p21WAF1/CIP1蛋白在胃癌中的表达及意义

目的：探讨MDM2在胃癌中的表达情况以及MDM2、p53和p21^WAF1/CIP1在胃癌发生发展中的作用。方法：应用免疫组化SABC法检测94例胃癌MDM2、p53和p21^WAF1/CIP1蛋白的表达情况，并对三者之间的关系及其与胃癌临床病理特征的关系进行统计分析。结果：94例胃癌中未发现有MDM2的表达。p53及p21^WAF1/CIP1的阳性表达率分别为56.38%（53／94）和41.49%（39／94），阳性表达位于癌细胞核。在癌旁不典型增生灶中，p53有3例，p21^WAF1/CIP1有5例阳生，癌旁正常黏膜均为阴性。p53和p21^WAF1/CIP1两者的阳性表达率之间无显著相关性。在性别、年龄、部位、浸润深度、局产淋巴结转移及组织学类型等临床病理指标中，p53或p21^WAF1/CIP1的阳性表达率的差异均无统计学意义。结论：MDM2在胃癌的发展中不起重要作用，而在胃癌发展中起主要作用的是抑癌基因p53的突变。p21^WAF1/CIP、在胃癌中可能是以不依赖p53的途径增高，说明癌细胞增生已不受G1期检查点的控制。     

人肺腺癌细胞系GLC-82中p21WAF1和p53基因的过表达

目的 探讨p21^WAF1和p53基因过表达对人肺腺癌细胞生长和细胞凋亡的影响。方法 用带有p21cDNA的真核表达载体pCEP和带有p53的腺病毒表达载体pAdCMV,分别通过基因转染和腺病毒感染,使其在人肺腺癌细胞系(GLC—82)中过表达;通过流式细胞仪、透射电镜和原位末端分析(TUNEL)观察细胞的生长和凋亡情况。结果 p21过表达的细胞系G1期细胞增加,细胞生长抑制,克隆形成率下降,电镜下未见特征性凋亡小体,原位细胞凋亡分析未见凋亡信号;p53腺病毒感染的肿瘤细胞增殖明显抑制并出现死亡,原值细胞凋亡检测到凋亡信号。结论 P21和p53基因的过表达能够抑制人肺腺癌细胞的生长,其中p53能够诱发细胞凋亡,因此这两种基因在肿瘤基因治疗上有着广泛的应用前景。     

Inhibiting effect of murine double minute-2 oncogene on apoptosis induced by retroviral-mediated wild-type p53

OBJECTIVE To investigate the effects of wild-type p53 (wtp53) on inducing apoptosis by restoring wtp53 expression in pancreatic adenocarcinoma cell line (PC-2) which contains mutant p53, and the interaction between murine double minute-2 (MDM2) and wtp53 in pancreatic adenocarcinoma.

METHODS A recombinant retroviral vector expressing wild-type p53 was constructed and packaged by packaging cell line PA317 cells using calcium phosphate coprecipitation method. The supernatant of the packaged cells PA317 was used to transfect the pancreatic carcinoma cell line (PC-2), then a transformed cell line PC-2/swtp53 was established. The recombinant vector pCMV-MDM2 was transduced into PC-2/swtp53 cell line by lipofectin-mediated method, a double transfected cell line (PC-2/swtp53/pCMV-MDM2) was formed. To determine the integration and expression of exogenous wtp53 gene in the transfected cells, polymerase chain reaction (PCR), Western blot and immunoprecipitation analyses were performed. Apoptosis was analyzed by means of flow cytometry, in situ terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) analysis and DNA agarose gel electrophoresis.

RESULTS Transduction with the retroviral vector resulted in integration and expression of wtp53 gene in host cells. The apoptotic cells in PC-2/swtp53 and PC-2/swtp53/pCMV-neo cell lines were 12.1%-12.9%, while the double transfected cell line, PC-2/swtp53/pCMV-MDM2, showed less (3.2%) apoptotic cells than its parent cell lines.

CONCLUSIONS Restoration of expression of wild-type p53 with a retroviral vector can increase programmed cell death of pancreatic adenocarcinoma cells (PC-2) containing mutant p53. The overexpression of MDM2 protein has a negative regulating role in wtp53-induced apoptosis in PC-2 cell.

     

野生型p53基因对胰腺癌细胞的抑制作用

目的：观察人类野生型p53（wtp53）基因对人胰腺癌细胞的抑制作用。方法：用逆转录病毒为载体将外源性wtp53基因导入人胰腺癌细胞系PC－2，通过体外及小鼠体内实验研究转入基因的表达及对肿瘤的抑制作用，结果：p53在转染细胞PC－2／p53中表达水平提高，外源性wtp53基因的导入和表达能使PC－2细胞的生长速率减低，软琼脂集落形成能力下降，G0＋G1期细胞比例增加，凋亡指数升高，裸鼠体内成瘤能力明显下降，结论：逆转录病毒载体介导的外源性野生型P53能抑制人胰腺癌细胞生长。     

p21WAF1/CIP1基因的生物学功能及其与肿瘤发生的关系

p21WAF1/CIP1基因是在1993年由不同的实验室用不同的方法克隆出来的.Harper JW等[1]运用酵母双杂交的方法发现一种可与细胞周期依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)相互作用的蛋白,并经蛋白测序和PCR 的方法将其克隆,命名为CDK相互作用蛋白1(cyclin-dependent kinase interacting protein 1,CIP1).