磷脂酸磷酸酶2域1A在不同结直肠癌细胞中的表达

目的探讨磷脂酸磷酸酶2域1A(PPAPDC1A)在人结直肠癌细胞中的表达及意义。方法取结直肠癌细胞系高转移潜能细胞LOVO、SW620和低转移潜能细胞SW480、RKO、HCT116、DLD-1进行常规培养,待细胞生长至对数生长期时,采用实时荧光定量聚合酶链反应检测不同结直肠癌细胞中PPAPDC1A mRNA表达,Western blot检测不同结直肠癌细胞中PPAPDC1A蛋白表达。结果 6种人结直肠癌细胞中PPAPDC1A mRNA和蛋白表达比较差异均有统计学意义(F=41.213、344.116,P<0.05)。高转移潜能细胞LOVO、SW620中PPAPDC1A mRNA和蛋白表达显著高于DLD-1、HCT116、RKO、SW480细胞(P<0.05);高转移潜能细胞LOVO中PPAPDC1A蛋白表达显著高于SW620细胞(P<0.05);DLD-1细胞中PPAPDC1A蛋白表达显著高于HCT116、RKO、SW480细胞(P<0.05);低转移潜能细胞HCT116中PPAPDC1A蛋白表达显著高于RKO、SW480细胞(P<0.05);RKO细胞中PPAPDC1A蛋白表达显著高于SW480细胞(P<0.05)。高转移潜能细胞LOVO与SW620细胞中PPAPDC1A mRNA表达比较差异无统计学意义(P>0.05);SW480、RKO、HCT116、DLD-1细胞中PPAPDC1A mRNA表达两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 PPAPDC1A在结直肠癌细胞系中存在差异性表达,其可能与结直肠癌的侵袭和转移有关。     

低氧应激对人肝癌细胞AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9表达的影响

目的 探讨低氧应激对人肝癌细胞(HepG-2细胞)甲胎蛋白(AFP)、血管内皮生长因子(VEGF)、金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)-1、基质金属蛋白酶(MMP)-9表达的影响.方法 低氧(5% O2、5% CO2、90% N2)和常氧培养HepG-2细胞.逆转录-多聚酶链式反应技术测定HepG-2细胞AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9 mRNA的表达.酶联免疫吸附法测定HepG-2细胞培养上清VEGF、TIMP-1、MMP-9蛋白含量,放射免疫测定法测定HepG-2细胞培养上清AFP蛋白含量.结果 低氧组AFP、VEGF、MMP-9mRNA和蛋白表达量显著高于常氧组;TIMP-1 mRNA和蛋白表达量显著低于常氧组(P＜0.01).结论 低氧应激上调人HepG-2细胞AFP、VEGF、MMP-9基因表达,下调TIMP -1基因表达.     

低氧依赖低氧诱导因子-1α增强卵巢癌细胞SKOV3中乙酰肝素酶的表达及其侵袭力

目的研究低氧条件下卵巢癌细胞株SKOV3中乙酰肝素酶(HPA)的表达及其侵袭力的变化,探讨低氧诱导因子-1α(HIF-1α)与SKOV3细胞侵袭力变化的关系。方法将SKOV3细胞分为常氧组、低氧组和低氧加雷帕霉素组。低氧组细胞在5%CO2 1%O2的条件下培养;在低氧培养前30min,向低氧加雷帕霉素组细胞培养基中加入终浓度为10ng/ml的雷帕霉素。分别于低氧培养12、24、36h收集细胞,采用Western bloting和RT-PCR方法检测HIF-1α和HPA的表达,基质凝胶侵袭实验检测细胞侵袭力。结果低氧条件下,HIF-1α的蛋白表达显著高于常氧组(P<0.05),而HIF-1αmRNA的表达不随氧浓度的降低而改变。低氧组HPAmRNA和蛋白质的表达量均显著高于常氧组(P<0.05)。雷帕霉素能抑制低氧导致的HPA mRNA和蛋白质表达的升高,HPA mRNA和蛋白质的表达均显著低于低氧组(P<0.05)。低氧组细胞的侵袭力显著高于常氧组(P<0.05)。SKOV3细胞HPA的表达与细胞侵袭力呈正相关(r=0.9863,P<0.01)。结论低氧可能依赖HIF-1α途径显著增强SKOV3细胞HPA的表达及其细胞的侵袭力。     

低氧诱导高迁移率组蛋白B1对人胰腺癌细胞凋亡抵抗和迁移的作用研究

目的 观察低氧诱导人胰腺癌细胞系(SW1990)分泌高迁移率组蛋白B1(HMGB1)作用,并探讨胞外HMGB1在胰腺癌细胞凋亡抵抗及转移中的作用.方法 取对数生长期SW1990细胞分别给予以下处理:(1)常氧+PBS;(2)低氧+PBS;(3)低氧+HMGB1(100μg/L);(4)低氧+HMGB1(100μg/L)+EP(胞外HMGB1特异性抑制剂).细胞处理72 h后,ELISA检测(1)及(2)2组细胞培养上清中HMGB1表达的差异;AnnexinV/PI流式细胞术检测(2)、(3)、(4)各组细胞的凋亡率;Transwell迁移实验检测(2)、(3)、(4)各组细胞迁移能力差异;Western-blotting检测(2)、(3)、(4)各组细胞凋亡相关蛋白(Bcl-2)及迁移相关蛋白(E-cadherin、MMP-9)表达的差异.结果 ELISA结果显示低氧条件下,细胞培养上清中HMGB1表达含量升高,是常氧条件下的5倍;AnnexinV/PI流式细胞术检测以上3组细胞的凋亡率分别为:(23.47±2.20)%、(6.57±1.20)%、(20.03±1.89)%;低氧+HMGB1处理组细胞凋亡比率明显低于其他2组,差异有统计学意义(P<0.05);Transwell迁移实验中各组穿至下室的细胞数分别平均为(161.3±16.0)、(399.7±13.0)、(184.3±16.0)个,差异有统计学意义(P<0.05),提示低氧条件下HMGB1能明显促进人胰腺癌SW1990细胞的迁移;Western-blotting结果显示HMGB1处理组Bcl-2及MMP-9表达增高,E-cadherin表达降低,差异有统计学意义(P<0.05).结论 低氧可以促进肿瘤细胞释放HMGB1,从而促进人胰腺癌SW1990凋亡抵抗与迁移.     

持续应用腺苷对大鼠低氧肺动脉高压的作用

目的 采用皮下微量注射泵持续注射腺苷14d,观察腺苷对低氧所致肺动脉高压的影响及作用机制.方法 将SD大鼠分成常氧组、低氧组和腺苷处理组,于低氧[氧浓度(10.0±0.5)%]第7天皮下植人胶囊渗透压泵.腺苷组在低氧处理同时注射腺苷(100μg·kg-1·min-1);另两组泵内含等量生理盐水,持续14 do测尾动脉压力和肺动脉压力,取血浆检测肾素活性(RA)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、内皮素-1(ET-1)、NO水平.取肺动脉作免疫组化检测iNOS蛋白表达.结果 (1)低氧致肺动脉压力高于常氧组(P(0.01),而腺苷处理后肺动脉压力低于低氧组(P<0.01);(2)低氧组血浆ET-1水平明显高于常氧组(P<0.01),腺苷治疗组低于低氧组(P<0.01);低氧组血浆NO水平明显低于常氧组(P<0.01).腺苷治疗组高于低氧组(P<0.01);低氧组肺动脉血管iNOS蛋白表达高于常氧组,腺苷处理组肺动脉血管iNOS蛋白表达明显高于低氧组和常氧组(P<0.01);(3)低氧组血浆RA和AngⅡ水平明显高于常氧组(P<0.01),腺苷治疗组则明显低于低氧组(P<0.01).结论 外周持续腺苷给药可降低慢性低氧所致肺动脉高压,其机制与抑制体内肾素血管紧张素系统、内皮素水平,促进肺动脉iNOS表达和增高血浆NO水平有关.     

长期低氧对骨肉瘤细胞增殖与分化的影响

目的 观察长期低氧对骨肉瘤细胞增殖、分化及骨肉瘤干细胞自我更新能力的影响.方法 采用噻吩蓝(MTT)比色法观察低氧对骨肉瘤细胞系MG63增殖的影响.后续试验分为两组:第1组为低氧处理组,将MG63细胞在低氧环境下培养1周后进行实验;第2组为常氧对照组.应用实时定量聚合酶链反应(real-time PCR)检测两组骨肉瘤细胞的成骨分化基因(Runx2和OC)、胚胎干细胞标志基因Oct3/4、原癌基因c-Myc及低氧诱导因子(HIF)-1a、2a的表达.采用无血清悬浮球培养法观察并比较两组细胞肉瘤球数目和体积的差异.采用免疫组织化学染色法检测两组细胞中HIF-1a和HIF-2a蛋白的表达.结果 培养第6、9天,低氧处理组的光密度(D)值为0.128±0.020、0.700±0.060,分别显著高于常氧对照组的0.073±0.050、0.480±0.120(P值均＜0.05).低氧处理组MG63细胞骨肉瘤球的数目为(24±10.97)个,显著高于常氧对照组的(1 3±3.95)个(P＜0.05);低氧处理组MG63骨肉瘤球的体积显著大于常氧对照组.与常氧对照组比较,低氧处理组细胞的成骨标志基因Runx2和OC均显著下调(P值均＜0.05),胚胎干细胞标志基因Oct3/4和原癌基因c-Myc表达均显著上调(P值均＜0.05),HIF-2α表达显著上调(P＜0.05);免疫组织化学染色检测到MG63细胞中有HIF-1a和HIF-2a蛋白表达.结论 长期低氧可促进骨肉瘤细胞MG63的增殖,抑制其成骨分化,并促进骨肉瘤球的自我更新能力,增强其干细胞特性.HIF-2a蛋白可能在这些过程中发挥关键作用.     

缺氧应激对HepG-2增殖活性和HIF-1α、MMP-2表达的影响

目的研究缺氧应激对人肝癌细胞HepG-2增殖和缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、基质金属蛋白-2(MMP-2)表达的影响。方法将缺氧(5%O2、5%CO2、90%N2)和常氧环境中培养的HepG-2细胞,在相差显微镜下观察细胞形态变化;用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定细胞增殖活性;用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法测定常氧组和缺氧4、12、24h组HepG-2细胞HIF-1αmRNA和MMP-2mRNA的表达量;用双抗体夹心酶联免疫吸附实验(ELISA)法测定常氧和缺氧12、24h组细胞培养上清MMP-2蛋白含量。结果同时相缺氧组HepG-2细胞增殖活性与常氧组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。常氧下HepG-2细胞不表达HIF-1αmRNA,缺氧4h时HIF-1αmRNA表达量最高,随后下降(P<0.01),但仍高于常氧组;缺氧4h时MMP-2mRNA表达量最高,随后下降,但仍高于常氧组(P<0.01);缺氧组HIF-1αmRNA和MMP-2mRNA呈高度正相关关系。缺氧24h组HepG-2细胞培养上清液中的MMP-2蛋白含量与常氧24h组含量比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论缺氧应激(5%O2)促进人肝癌细胞HepG-2的增殖作用并上调HIF-1α和MMP-2的表达量。     

低氧环境对创面修复主要效应细胞表达MMP-9的作用

目的 探讨低氧(2％O2)对创面修复主要效应细胞(表皮细胞及真皮成纤维细胞)表达MMP-9的影响.方法 常规培养人表皮细胞及人真皮成纤维细胞,分为常氧组和低氧组(设低氧培养3h和6h两个组),采用Western blot、明胶酶谱法和荧光定量PCR法检测人表皮细胞和真皮成纤维细胞MMP-9细胞蛋白表达、MMP-9细胞外分泌和MMP-9转录水平变化.结果 常氧培养的表皮细胞中,MMP-9呈一定程度的基础表达和细胞外分泌.与常氧组比较,低氧能明显促进表皮细胞MMP-9的蛋白表达(6h时增强约20％,P＜0.01)和MMP-9的细胞外分泌[(44.03±3.00)vs(60.64±3.77),P＜0.01].常氧与低氧条件下真皮成纤维细胞极少表达和分泌MMP-9.荧光实时定量PCR结果显示,低氧培养条件下表皮细胞MMP-9 mRNA水平显著增高,常氧对照组为(1.67±0.69),低氧6h组为(5.47 ±0.51),两者比较差异有统计学意义(P =0.002).结论 低氧刺激能显著诱导表皮细胞,而非真皮成纤维细胞,表达和分泌MMP-9,这一作用可能与低氧刺激促进MMP-9的转录有关.     

冬虫夏草水提取物对慢性低氧大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖及癌基因c-fos、c-jun表达的影响

目的 探讨冬虫夏草水提取物对慢性低氧大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖的影响及其可能的作用机制.方法 用MTT法测定不同浓度冬虫夏草水提取物对慢性低氧大鼠PASMCs增殖的影响,用流式细胞仪分析冬虫夏草水提取物对慢性低氧大鼠PASMCs细胞周期的影响,用免疫细胞化学染色法测定冬虫夏草水提取物对慢性低氧大鼠PASMCs增殖细胞核抗原(PCNA)和癌基因c-fos、c-jun表达的影响.结果 低氧对照组大鼠PASMCs吸光度(A)值明显高于常氧对照组,差异有统计学意义(P<0.01),1、10、100 mg/mL冬虫夏草组A值呈明显下降趋势,差异均有统计学意义(P<0.05);低氧对照组S+G2M 期细胞比例明显高于常氧对照组,差异有统计学意义(P<0.01),冬虫夏草组S+G2M期细胞比例明显低于低氧对照组,但高于常氧对照组,差异均有统计学意义(P<0.01);冬虫夏草组PCNA阳性表达率明显低于低氧对照组,但高于常氧对照组,差异均有统计学意义(P<0.01);冬虫夏草组细胞c-fos和c-jun 蛋白阳性染色平均积分光密度值(AIOD)明显低于低氧对照组,但高于常氧对照组,差异均有统计学意义(P<0.01).结论 冬虫夏草水提取物呈浓度依赖性抑制慢性低氧导致的大鼠PASMCs增殖,其抑制作用可能是通过减少细胞内c-fos、c-jun基因和PCNA的表达、降低S期和G2/M期细胞比例来实现的.     

Kiss-1高表达抑制结肠癌侵袭与转移能力的影响

目的　探讨Kiss-1高表达对结肠癌SW480细胞侵袭与转移能力的影响,初步明确Kiss-1基因对基质金属蛋白酶-9（matrix　metalloproteinase-9,MMP-9）和MMP-2表达的影响。　方法　用脂质体转染方法将质粒pEGFP-N1-Kiss-1及pEGFP-N1空载体质粒瞬时导入结肠癌SW480细胞,细胞随机分三组：空白对照组、阴性对照组、实验组。应用Transwell实验检测结肠癌细胞的侵袭能力、Western-blot和Real-time　PCR分别从蛋白和mRNA水平检测Kiss-1表达对MMP-9、MMP-2表达的影响。　结果　成功将pEGFP-N1-Kiss-1重组质粒瞬时导入结肠癌SW480细胞。Transwell实验检测出实验组较阴性对照组和空白对照组能明显降低SW480细胞侵袭能力的作用（P<0.05）。Western　blot和Real-time　PCR检测出实验组Kiss-1　蛋白和mRNA表达水平较阴性对照组或空白对照组显著增加,而实验组MMP-9、MMP-2蛋白和mRNA表达水平显著降低,其差异均具有统计学意义（P<0.05）。　结论　Kiss-1抑制MMP-9和MMP-2的表达,其调控机制可能与抑制结肠癌的侵袭和转移能力有关。     

氢质子磁共振频谱活体检测结肠癌耐药性的初步探讨

目的 探索1H-MRS活体检测结肠癌耐药性的可能性。方法 5只耐药(耐5-FU)与5只不耐药人类结肠癌SW480荷瘤裸鼠于肿瘤直径大于1.5cm时行1H-MRS检查,随后处死荷瘤鼠,切下肿瘤检测其PKC、P-gp、MRP1蛋白表达(Western Blot),观察肿瘤凋亡(TUNNEL法)。分析结肠癌耐药性与1H-MRS检测代谢物、肿瘤耐药基因表达、肿瘤凋亡的相关性。结果不耐药组人类结肠癌SW480裸鼠肿瘤的cho、lac、Lip及m I峰/cr面积比较耐药组人类结肠癌SW480/5-FU裸鼠增加,差别有统计学差异(P0.05)。耐药组PKC、P-gp、MRP1蛋白表达明显高于不耐药组,差别有统计学差异(P0.05)。在TUNNEL检测切片上,两组肿瘤组织均可见肿瘤细胞凋亡,两者差别无统计意义(P0.05)。肿瘤代谢物cho、Lac、Lip、m I/cr与肿瘤耐药性呈正相关性;cho面积与肿瘤PKC表达光密度呈正相关,与肿瘤Pgp表达光密度呈正相关。结论 肿瘤代谢物cho、lac、Lip的改变有可能有助于利用1H-MRS活体检测结肠癌耐药性改变。     

重组人白细胞介素17A对结肠癌细胞生长的影响及其作用机制

目的：探讨重组人白细胞介素17A （IL-17A）对结肠癌细胞生长的影响,并阐明其作用机制。方法：将结肠癌SW480细胞分为对照组和实验组,对照组细胞未经处理,实验组细胞加入50 μg·L^-1重组人IL-17A。采用CKK-8法检测2组SW480细胞增殖活性,采用ELISA法检测2组细胞中IL-17A水平,Western blotting法检测2组SW480细胞中信号传导及转录激活因子3（STAT3）和磷酸化信号传导及转录激活因子3（p-STAT3）蛋白表达水平。结果：与对照组比较,实验组细胞增殖活性明显升高（P<0.05）。与对照组比较,实验组SW480细胞中IL-17A水平、STAT3和p-STAT3蛋白表达水平明显升高（P<0.01）。结论：重组人IL-17A可刺激结肠癌细胞SW480细胞的生长,其作用机制可能与激活STAT3信号通路有关。     

环氧化酶2基因异常表达与大肠癌转移的关系

目的 研究环氧化酶2在人大肠癌细胞系及大肠癌组织中的异常表达与意义。方法 培养不同转移能力的人大肠癌细胞系SW480和SW620细胞，收集50例大肠癌石蜡组织，50例淋巴结转移性大肠癌石蜡组织：分别用免疫组织化学、Real-time PCR的方法研究环氧化酶2在不同转移能力人大肠癌细胞系及原发人大肠癌组织和大肠淋巴结转移组织中的表达。结果 环氧化酶2蛋白在SW480和SW620细胞株中均阳性表达；环氧化酶2mRNA在SW620比SW480细胞中表达增高，表达量的平均倍比关系为2．268。环氧化酶2蛋白在淋巴结转移癌组的异常表达高于原发大肠癌石蜡组织，相关性具有统计学意义（P〈0．05）。结论 环氧化酶2异常表达可能与大肠癌淋巴结转移相关。     

四溴苯三唑对人结肠癌SW480细胞凋亡的诱导作用及其机制

目的：探讨4,5,6,7-四溴苯三唑（TBB）对人结肠癌SW480细胞的促凋亡作用,并初步探讨其可能的作用机制。方法：选取处于对数生长期的人结肠癌SW480细胞,将其分为对照组（给予0 μmol·L^-1TBB）和实验组（给予1、3、10、30和100 μmol·L^-1TBB）。采用MTT比色法检测SW480细胞存活率,采用Annexin Ⅴ-FITC/PI双染法及流式细胞术检测SW480细胞凋亡率及细胞中活性氧（ROS）水平,采用Western blotting法检测细胞中抗凋亡蛋白p-Akt、Bcl-2和促凋亡蛋白Bad、pro-caspase-9及cleaved-caspase-3表达水平。结果：MTT法检测,与对照组比较,实验组SW480细胞存活率明显降低（P<0.05）,且呈浓度依赖性;Annexin Ⅴ-FITC/PI双染法及流式细胞术检测,随着处理时间的增加,与对照组比较,TBB作用3、6、12和24 h时SW480细胞凋亡率明显高于作用0 h时（P<0.05）;流式细胞术检测,TBB作用3、6、12和24 h时结肠癌SW480细胞中ROS水平高于作用0 h时（P<0.05）;Western blotting法检测,SW480细胞中抗凋亡蛋白p-Akt和Bcl-2表达水平逐渐降低,促凋亡蛋白Bad和cleaved-caspase-3表达水平逐渐升高,pro-caspase-9蛋白表达水平逐渐降低,与对照组（0 h）比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论：TBB对体外培养的人结肠癌SW480细胞有明显的杀伤作用,可诱导细胞凋亡,其机制可能与抑制Akt活性或促进细胞中ROS产生有关。     

抑制EZH2基因表达的shRNA载体的构建及其作用

目的 构建zeste基因增强子同源物2(EZH2)靶向的小发夹RNA(shRNA)重组表达载体,探讨抑制EZH2基因表达后其在结直肠癌细胞中的作用。方法 根据EZH2cDNA序列设计具有短发夹结构的两条DNA序列,与载体pGFP-V-RS构建重组表达载体,鉴定后转染至SW480细胞。将其随机分为阴性对照组和基因沉默组,RT-PCR和蛋白质印迹法检测抑制效果,MTT法检测细胞增殖情况。结果 成功构建了抑制EZH2基因表达的干扰质粒。阴性对照组EZH2 mRNA 的表达是基因沉默组的5.8倍(P<0.01),基因沉默组EZH2的蛋白明显低于阴性对照组(P<0.05)。与阴性对照组相比,基因沉默组细胞生长受到明显抑制(P<0.05)。结论 EZH2靶向shRNA 重组表达载体构建成功,并能显著抑制EZH2基因的表达,为进一步研究EZH2基因在肿瘤中的作用机制提供了基础。     

靶向热休克蛋白-27基因沉默对5-氟尿嘧啶诱导SW480细胞凋亡的影响及机制

目的：通过RNA干扰抑制热休克蛋白-27（HSP27）基因的表达,探讨沉默该基因对5-氟尿嘧啶（5-FU）诱导大肠癌SW480细胞凋亡的影响及机制。方法：将细胞分为正常对照组（Normal组）、阴性siRNA转染组（NC组）、HSP27-siRNA转染组（siRNA组）、单纯5-FU组（5-FU组）、5-FU+阴性siRNA转染组（NC+5-FU组）、5-FU+HSP27-siRNA转染组（siRNA+5-FU组）,通过脂质体LipofectamineTM 2000将HSP27-siRNA导入SW480细胞,CCK-8法检测靶向HSP27的siRNA和5-FU对SW480细胞增殖的抑制作用,流式细胞技术观察转染后细胞在5-FU作用下的早期凋亡情况,Western blot方法检测凋亡相关蛋白Active-casepase-3、Active-caspase-9及细胞色素C（Cytc）的表达。结果：CCK-8法检测结果显示siRNA+5-FU组细胞增殖抑制率明显高于同期siRNA组和5-FU组,表明联合应用抑制率明显升高（P＜0.05）。流式细胞仪检测结果表明siRNA组和5-FU组均可诱导SW480细胞凋亡,两者联合应用细胞早期凋亡率明显升高,与Normal组及NC组比较,差异均有统计学意义（均P＜0.05）;Western blot检测结果显示siRNA+5-FU组Active-casepase-3、Active-caspase-9、Cytc蛋白相对表达水平均高于siRNA组和5-FU组,差异均有统计学意义（均P＜0.05）。结论：靶向HSP27-siRNA能有效抑制大肠癌SW480细胞HSP27蛋白的表达,上调Active-casepase-3、Active-caspase-9、Cytc蛋白的表达,增强5-FU诱导SW480细胞凋亡,逆转肿瘤细胞对5-FU的耐药。     

PS-341对人大肠癌细胞LoVo,SW480中NF-κB、uPA表达的影响及其与侵袭力的关系

目的 观察人大肠癌细胞LoVo、SW480中真核细胞转录因子-κB(NF-κB)、尿激酶型血浆纤溶酶原激活因子(uPA)的表达差异及硼替佐米(bortezomib,PS-341)对其表达的影响及其与侵袭力的关系.方法 实验分为4组:对照组(无血清)、血清组(10%FCS)、PS-341组[10%FCS +PS-341(...