共转染抑癌基因p16、p53对白血病细胞株HL-60及K562的抑制作用

人类髓系白血病细胞株ＨＬ 6 0、Ｋ5 6 2同时有ｐ16、ｐ5 3抑癌基因的缺失[1,2 ] 。已有研究将正常的ｐ5 3或ｐ16基因单独导入这两种细胞 ,可以不同程度地抑制肿瘤细胞的生长[1,2 ] 。如果同时将缺失的ｐ16、ｐ5 3两种基因导入ＨＬ 6 0及Ｋ5 6 2细胞中 ,可能有更好的抑制作用。材料和方法1　质粒与试剂　含野生型ｐ16ｃＤＮＡ的质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ｐ16由ＧｏｒｄｏｎＰｅｔｅｒｓ教授 (ＩｍｐｅｒｉａｌＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈＦｕｎｄ .Ｌｏｎｄｏｎ)惠赠 ,含野生型ｐ5 3ｃＤＮＡ的质粒ｐＣ5 3 ＳＮ3及真核表达载体ｐＣＮｅ…     

转染p21WAF1基因对K562白血病细胞系增殖的抑制作用

为了探讨p21WAF1基因对白血病细胞增殖的影响,构建了p21WAF1的逆转录病毒表达载体,通过FuGENETM6介导体外转染p21WAF1表达缺如的K562细胞。经筛选得到G418抗性K562细胞系,用RT-PCR和Western印迹检测到外源p21WAF1的表达,用活细胞计数观察细胞增殖情况,同时进行流式细胞术和软琼脂集落形成实验,结果表明,K562-p21WAF1的表达,用活细胞计数观察细胞增殖情况,同时进行流式细胞术和软琼脂集落形成实验,结果表明,K562-p21WAF1中可检测到P21WAF1蛋白及mRNA表达,细胞增殖明显减慢,G0G1期细胞数增多,细胞在软琼脂中的集落形成能力下降,以上结果表明,p21WAF1基因可抑制p21WAF1表达阴性的白血病细胞增殖,可能成为白血病基因治疗的靶基因。     

外源笥野生型p53基因对K562细胞的作用

为了研究外源性野生型p53基因（wt-p53）对K562细胞的作用。探索p53基因治疗白血病的可能性,两种p53基因pC53-SN3(wtp53cDNA)和pN53cG(Val135)(32.5℃表现wtp53功能）通过脂质体介导的DNA转染法导入无P53蛋白表达的K562细胞,获得细胞克隆K-SN3及K-pN53cG。通过生长曲线、克隆形成率、细胞周期分析,片段化DNA及TUNEL检测,联苯胺染色等指标观察外源性wtp53基因对K562细胞的影响,结果显示;（1）RT-PCR检测K-SN3及K-pN53cG均获表达p53基因,但前表达明显低于后;（2）K-SN3,K-pN53cG(32.5℃）细胞生长减慢,克隆形成明显受抑,且G0/G1期增加,S期减少,以上现象均以K-pN53cG细胞（32.5℃）更明显;（3）K-pN53cG932.5℃）可检测到明显凋亡改变,而K-SN3则向红系分化,说明wtp53基因表达使K562细胞生长受到明显抑制,并提示p53低表达可能促使K562细胞向红系分化,而p53高表达诱导K562细胞出现凋亡,wtp53对于白血病基因治疗有潜在的应用价值。     

p16抑癌基因敲除小鼠髓系细胞增殖特性的研究

最近大量资料显示 ,周期蛋白依赖激酶抑制剂 (ＣＤＫＩ)家族成员之一Ｐ16蛋白竞争性地与周期蛋白依赖性激酶 4(ＣＤＫ4)结合 ,在细胞周期中起着重要的负调节作用[1 ] 。许多研究显示ｐ16外显子纯合缺失在慢性粒细胞白血病 (ＣＭＬ)淋巴细胞急变患者中阳性率为 5 0 % [2 ] 。我们对ｐ16基因敲除(ｐ16 - - )小鼠骨髓细胞所建立的细胞系进行了细胞增殖特性的研究。现将结果报告如下。材料和方法1　ｐ16 - -小鼠　ｐ16 - -和野生型 (ＷＴ ,ｐ16 + +)小鼠由英国帝国理工大学动物研究中心提供。ｐ16 - -小鼠由Ｓｅｒ ｒａｎｏ实验室[3 ] 提供…     

转导野生型p53的K562细胞出现生长抑制和凋亡

把重组有编码野生型p53的逆转录病毒载体转导到p53蛋白缺失的K562细胞,以观察野生型p53蛋白在K562细胞表达后对K562细胞增殖和凋亡的影响。应用RT-PCR和Western印迹杂交方法检测K562细胞p53表达,应用流式细胞仪计数检测细胞的增殖,采用梯形DNA和细胞形态学方法检测细胞凋亡变化。研究结果表明:感染pLXSN-p53病毒24小时后,K562细胞p53表达阳性,K562-p53细胞的生长受到抑制,少数细胞进入凋亡状态。结论提示,野生型p53可促进p53表达阴性的K562细胞生长抑制与凋亡。     

野生型p53基因对K562细胞中心体数量和蛋白的影响

目的 研究重组腺病毒介导的野生型p53基因(Ad5wtp53)对人慢性粒细胞白血病(CML)K562细胞系中心体数量和中心体蛋白表达的影响.探讨应用重组腺病毒p53基因对CML进行基因治疗的可行性.方法 分别将含有野生型p53基因、突变型p53基因和绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒表达载体(AdSwtp53、Ad5mtp53和Ad5GFP)反复扩增,联合多聚季胺共同感染K562细胞.观察感染效率.MTT法确定最适重组腺病毒感染滴度和感染时间.然后用RT-PCR和Western blot检测p53 mRNA和蛋白的表达.最后应用间接免疫荧光染色法对中心体γ-微管蛋白和纺锤体α-微管蛋白同时进行标记,在激光共聚焦显微镜下观察中心体γ-微管蛋白的表达和有丝分裂,并对中心体进行计数.结果 多聚季胺可显著提高腺病毒载体对K562细胞的感染效率.多聚季胺的剂量选择为4μg/ml;感染K562细胞的最适腺病毒滴度为20 000 MOI,感染时间为72 h;Ad5wtp53和AdSmtp53转染的K562细胞均可表达p53 mRNA和蛋白.Ad5wtp53感染K562细胞后,中心体数量减少,γ-微管蛋白的表达降低.结论 重组腺病毒介导的野生型p53基因能够在白血病K562细胞中持续表达;野生型P53蛋白能够降低K562细胞中心体数量及中心体γ-微管蛋白的表达.     

转染p16、p53对白血病细胞株K562及HL-60的抑制作用

本研究构建p53,p16基因真核表达载体,用脂质体法转染入白血病细胞,观察其在白血病细胞中的表达和对白血病细胞的作用。设计并构建包含野生型p53cDNA与p16cDNA的真核双表达载体pBudCE4.1-53-16,用脂质体法转染白血病细胞,用间接免疫细胞化学法、Western blot法检测鉴定外源性p53及p16的表达情况。通过CCK-8,流式细胞仪检测细胞的生长曲线、细胞周期、细胞凋亡。结果发现:p53p16基因双表达真核载体构建成功,体外转染入白血病细胞后能检测到外源性P53、P16蛋白在白血病细胞中表达。转染48小时后,试验组与对照组比较,细胞周期阻滞(p0.001);试验组和对照组比较,细胞增殖下降,细胞凋亡增加(p0.001)。结论:重组质粒pBudCE4.1-53-16构建成功,经体外转染白细胞细胞后2个目的基因能够在细胞中同时表达,并引起细胞周期阻滞于G0期,细胞凋亡增加。     

反义Bmi-1对K562细胞增殖的抑制作用及机制探讨

目前已知Bmi-1对于正常和白血病造血干细胞的自我更新至关重要,而且在正常和白血病造血干/祖细胞增殖活性的调控中Bmi-1是一个最值得关注的基因[3,4].我们通过将反义Bmi-1表达载体用脂质体介导的基因转染法将其导入红白血病细胞系K562细胞中,观察其对K562细胞的体外增殖、细胞周期、P16蛋白及细胞凋亡的影响.探讨Bmi-1反义寡核苷酸抑制白血病细胞增殖的作用机制及在白血病基因治疗中的作用.     

血复康对K562细胞增殖的影响

~~血复康对K562细胞增殖的影响@李晓惠$南京中医药大学第一附属医院!南京210029 @陈健一$南京中医药大学第一附属医院!南京210029 @刘志辉$南京中医药大学第一附属医院!南京210029 @张文曦$南京中医药大学第一附属医院!南京210029 @倪海雯$南京中医药大学第一附属医院!南京210029 @甘欣锦$南京中医药大学第一附属医院!南京210029 @李建敏$南京中医药大学第一附属医院!南京210029~~~~~~     

转导野生型p53基因提高K562细胞对紫外线诱导的细胞凋亡的敏感性

目的：观察野生型ｐ５３基因转染的Ｋ５６２细胞对紫外线诱导其细胞凋亡的影响。方法：应用基因转染技术将重组野生型ｐ５３的逆转录病毒载体转导ｐ５３蛋白缺失的Ｋ５６２细胞，用紫外线照射Ｋ５６２ｐ５３细胞不同时间后再培养不同时间，用ＤＮＡ片段化和细胞ＤＮＡ原位末端标记技术检测细胞凋亡情况。结果：紫外线照射Ｋ５６２ｎｅｏ和Ｋ５６２ｐ５３细胞８分钟后再培养７～１２小时，Ｋ５６２ｎｅｏ和Ｋ５６２ｐ５３两组细胞的凋亡差异显著。结论：野生型Ｐ５３蛋白在Ｋ５６２细胞表达后，能加速紫外线诱导的Ｋ５６２细胞凋亡，为临床应用ｐ５３进行基因治疗提供了有意义的实验基础     

转染p16与dll4阻滞白血病细胞株K562细胞周期

本研究探讨p16,dll4基因真核表达载体在白血病细胞中的表达和作用,设计并构建包含野生型p16cDNA,dll4cDNA的真核双表达载体pBudCE4.1-16-dll4,用脂质体法转染白血病细胞,用Western blot方法检测外源性p16及dll4的表达情况;通过CCK-8和流式细胞仪检测细胞的生长曲线和周期。结果表明:成功构建p16、dll4基因双表达真核载体,体外成功转染入白血病细胞。在白血病细胞检测到外源性P16、Dll4蛋白的表达。转染48小时后,试验组与对照组比较,细胞周期被阻滞(p0.001),细胞增殖下降(p0.001)。结论:重组质粒pBudCE4.1-16-dll4体外转染白血病细胞后,两个目的基因能够在细胞中同时表达,并诱发细胞周期阻滞于G0/G1期。     

人恶性淋巴瘤细胞系p53,p16与bcl-2/JH基因的研究

抑癌基因p53,p16的缺失和突变以及癌基因bcl-2/JH融合基因的出现是恶性淋巴瘤发生的分子生物学原因,p53和p16基因亦是诱导淋巴瘤细胞凋亡的重要基因,而bcl-2基因是抑制淋巴瘤细胞凋亡的重要基因。为研究这3种基因结构的变化,用PCR和PCR-SSCP,以及PCR扩增产物序列测定的方法测定了人9种恶性淋巴瘤细胞系,发现SU-DHL-1,SU-DHL-4,SU-DHL-6,SU-DHL-8,SU-DHL-10,Daudi,8392 7种恶性淋巴瘤细胞系有p53基因的点突变,分别在第五、六、七外显子;SU-DHL-9有p16基因的纯合缺失,而SU-DHL-1和Daudi细胞系有p16基因的第二外显子的突变,SU-DHL-1的测序结果为密码子30的GAC突变为AAC,密码子35的GCT突变为ACT,密码子40与41之间插入了一个C;SU-DHL-4和SU-DHL-6有bcl-2/JH基因的重排,讨论了基因结构的变化在恶性淋巴瘤细胞系发生发展中的意义。     

联合转染P53、AS基因对K562细胞增殖的抑制作用

本研究观察联合转染p53、血管生成抑素(angiostattn,AS)基因对人K562细胞的抑制作用,并初步探讨其机制.用脂质体转染法将pVITRO2-hp53-hAS转染K562细胞17天后,以RT-PCR法检测转染后细胞目的基因的表达,通过MTT生长曲线、流式细胞术检测细胞周期来观察细胞生物学改变;用细胞免疫化学观察VEGF、Bcl-2、Bax蛋白表达差异.结果表明转染成功后目的基因在细胞中获得稳定表达,目的基因转染组细胞上升幅度均比空载体转染组细胞低(p＜0.05),且双基因组细胞上升幅度(最后1天的A290 nm值0.264±0.011)比p53组(最后1天的A290 nm值0.652±0.039)和AS组(最后1天的A290 nm值0.604±0.017)低(p＜0.05).转染后,VEGF和Bcl-2蛋白表达减弱,Bax蛋白表达加强.结论联合转染p53和AS基因对K562细胞增殖有较强的抑制作用,且比单独转染组作用强,两者协同作用的机制可能是共同影响bcl-2、bax表达的途径.     

LRP16基因对慢性髓系白血病K562细胞促增殖作用的研究

本研究探讨超表达LRP16基因对人慢性髓系白血病K562细胞增殖的影响。采用RT—PCR法扩增人LRP16基因开放阅读框（open reading frame,ORF）片段,将其连接到pGEM—T质粒以构建LRP16基因ORF—pGEM—T重组载体。再将测序鉴定过的LRP16基因ORF插入pcDNA3．1^＋质粒以构建LRP16基因ORF—pcDNA3．1^＋重组表达质粒,转染K562细胞,建立稳定超表达LRP16基因的K562细胞系。用M1Tr法测定细胞存活率并绘制生长曲线,流式细胞术检测细胞周期。结果表明：成功扩增出人LRP16基因ORF片段,并构建LRP16基因ORF—pcDNA3．1^＋重组表达质粒;建立稳定超表达LRPl6基因的K562细胞系;超表达LRPl6基因具有促进K562细胞增殖的作用,且这种促增殖作用部分是通过促进细胞由G0期进入S期而实现的。结论：超表达LRP16基因可促进K562细胞增殖。     

D-柠檬烯对K562细胞增殖及凋亡的影响

本研究探讨D-柠檬烯对K562白血病细胞增殖的影响及机制。应用MTT试验观察不同浓度D-柠檬烯作用后K562细胞增殖的改变；应用细胞形态学检查、流式细胞术、DNA琼脂糖凝胶电泳观察和检测细胞凋亡。结果表明：在0．125-1．0mmol／L浓度范围内，D-柠檬烯对K562细胞增殖的抑制作用呈现剂量依赖的关系。典型的细胞形态学改变、DNA琼脂糖凝胶电泳梯形条带及流式细胞仪检测出亚G1峰共同证实了D-柠檬烯能诱导K562白血病细胞凋亡。结论：D-柠檬烯抑制K562细胞的增殖并呈剂量依赖的方式，使细胞滞留于G1期，诱导其凋亡。     

转染p21WAF1基因降低K562细胞对VP-16的敏感性

为探讨p21^WAF1对K562细胞药物敏感性的谳节作用及其对VP－16诱导的K562细胞凋亡的影响，构建了p21^WAF1逆转录病毒表达载体，体外转染白血病细胞系K562。经RT－PCR和Western印亦检测得到稳定表达p21^WAF1的K562－p21^WAF1细胞克隆后，用MTT法和存活细胞计数法检测转染p21^WAF1的K562细胞对VP－16在剂量和作用时间上的敏感性变化，用DNA凋亡片段分析和流式细胞术检测其对VP－16诱导的K562细胞凋亡的影响。实验结果显示，外源性p21^WAF1的表达明显降低了VP－16诱导的K562细胞凋亡，降低了K562细胞对VP－16的敏感性。以上结果表明，p21^WAF1能通过抑制K562细胞的凋亡来降低其对VP－16的敏感性。