p11融合蛋白表达、纯化及抗血清的制备

目的：表达GST－p11和6xHis-p11融合蛋白并制备GST－p11特异性抗体。方法：将人p11基因克隆人两种原核表达载体pGEX-4T-2和pQE30,分别在大肠杆菌BL21和M15中表达，用Glutathione Sepharose 4B和Ni-NTA agarose亲和柱分别纯化目的蛋白。利用纯化的GST－p11蛋白制备多克隆抗体。结果：得到高表达量的融合蛋白，经亲和层析柱纯化获得较高纯度的GST－p11和6xHis-p11蛋白。以GST－p11蛋白免疫新西兰兔得到p11多克隆抗体，Westernblotting证实该杭体能够识别6xHis-p11蛋白，具有较高特异性。结论：利用原核表达人p11融合蛋白制备的p11多克隆抗体具有较好的特异性，为研究p11蛋白在蛋白转运和定位过程中的作用提供重要的技术和材料保障。     

GST-p16融合蛋白的表达、纯化及鉴定

目的利用GST融合基因表达系统表达、纯化及鉴定GST-p16融合蛋白。方法以质粒pM-p16为模板,扩增出p16基因片段,将其克隆至大肠杆菌表达载体pGEX-6P-1,将所构建的重组质粒pGEX-p16转化大肠杆菌B121并诱导表达,采用GST蛋白纯化系统进行纯化,所得产物进行SDS-PAGE及Westernblot鉴定。结果大肠杆菌细胞经诱导高效表达出约42kD蛋白,其分子量与GST-p16融合蛋白相符。Westernblot结果显示该蛋白能够被p16．抗体特异性识别。结论本实验在大肠杆菌表达系统中高效表达了有活性的GSTipl6融合蛋白并可用于以后的实验研究。     

BCR/ABL癌蛋白片段的表达、纯化及其抗血清的制备

目的　克隆并表达 bcr/ abl融合基因片段 ,并制备其抗血清 .方法　 PCR扩增包含蛋白融合点的 bcr/ abl癌基因片段 ,序列测定后克隆入带有 His标签的原核表达载体 p ET-16 b,转化宿主菌 BL2 1,IPTG诱导表达 ,SDS- PAGE分析表达结果 ,Ni- NTA树脂亲和纯化 ,皮下多点注射免疫小鼠 ,EL ISA确认抗血清的滴度 .结果　 PCR扩增得到大小约 5 2 3bp的目的片段 ,序列测定表明与发表序列完全一致 ;得到了一种新的癌基因 bcr/ abl片段的原核表达载体 p ET- 16 b- bcr/abl,在 BL 2 1中表达可见于 Mr 2 1× 10 3处有一蛋白新生带 ,表达的 BCR/ ABL蛋白免疫小鼠后 ,EL ESA确认抗血清的滴度 >1∶ 2 0 0 0 .结论　成功的克隆、表达了 bcr/ abl融合基因片段 ,并制备了相应的抗血清 .     

HEV-GST融合蛋白的表达、纯化及鉴定

目的 利用谷胱苷肽转移酶（GST）蛋白纯化系统表达、纯化和鉴定HEN-GST融合蛋白.方法 将标记有GST的重组大肠杆菌E.coli BL21诱导表达HEV-GST融合蛋白,采用GST蛋白纯化系统进行纯化、所得产物进行SDS-PAGE和Western Blot鉴定.结果 大肠杆菌细胞高效表达出约43Kd蛋白,其分子量与HEV-GST分子量相符,经Western Blot显示所纯化蛋白能被抗GST抗体识别.结论 GST大肠杆菌表达系统中高效表达的HEV-GST融合蛋白可用于临床及实验研究.     

p62Dok PTB结构域融合蛋白的表达和纯化

目的：制备p62DokPTB结构域的GST融合蛋白。方法：用PCR方法扩增编码p62Dok PTB结构域的cDNA,并将其克隆入表达载体pGEX-4T-3中,转化大肠杆菌BL－21,构建成表达GST－PTB融合蛋白的菌株。经IPTG诱导表达后,经Glutathion-Sepharose 4B亲和层析柱纯化,用SDS－PAGE进行分析,该融合蛋白的表达量超过菌体总蛋白的25％。结果：获得重组GST－PTB融合蛋白,纯度在95％以上,产物得率约75％。结论：成功制备高纯度p62DokPTB结构域的GST融合蛋白,为进一步研究p62DokPTB结构域的结构和生物学功能奠定了基础。     

HCMV pp65在原核细胞中的表达、纯化及其抗血清的制备

目的 采用原核表达系统获得HCMV pp65目的 蛋白,免疫家兔制备该蛋白特异性抗血清.方法构建表达GST-HCMV pp65融合蛋白的质粒,在大肠杆菌中诱导表达,经GST亲和层析纯化后的pp65蛋白免疫家兔,获得兔多克隆抗血清.采用ELISA、SDS-PAGE电泳及Western blot检测纯化后的蛋白,并以间接免疫荧光染色法检测鉴定该蛋白的抗原性.结果成功构建PGEX-5X-pp65重组质粒,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,获得可溶性的融合蛋白;GST亲和层析纯化后的蛋白免疫家兔获得特异性抗血清.结论 在原核细胞中成功获得了融合蛋白pp65,免疫家兔后获得具有高度特异性抗血清.为进一步揭示该蛋白的功能及作用机制奠定了重要基础.     

HCV胞膜蛋白E2基因的融合表达、纯化及多克隆抗体制备

目的 原核表达HCV胞膜蛋白E2,获得抗E2多克隆抗体.方法 利用PCR方法从HCV基因组序列中扩增出831 bp（384～661aa）的E2基因片段并按读框克隆到原核表达载体pET32a（＋）,IPTG诱导HCV E2蛋白表达,SDS-PAGE和Western Blot法检测蛋白表达,Ni-NTA偶联的琼脂糖吸附柱纯化融合蛋白,薄层扫描及Bradford 法检测纯化蛋白的纯度＞90%;用表达的E2蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,利用间接ELISA 法检测抗体效价,Western Blot法检测抗体特异性.结果 用原核诱导表达出HCV胞膜蛋白E2免疫新西兰兔后获得多克隆抗体的效价在1∶1 280以上,能特异性识别E2蛋白.结论 成功构建HCV E2基因的原核表达载体,利用原核表达HCV胞膜蛋白E2制备的多克隆抗体能特异性识别E2蛋白.为进一步开展HCV E2蛋白功能和HCV受体的研究奠定了基础.     

人MT-1E融合蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

目的：体外表达人源性MT-1E融合蛋白并进行纯化。方法：采用RT-PCR方法获得人MT-1E基因的编码区，将其克隆入原核表达载体pQE40，并在大肠杆菌M15中表达，对蛋白的表达形式及诱导条件进行分析。用Ni-NT agarose亲和层析柱纯化目的蛋白。结果：重组蛋白在原核细胞中以可溶和不可溶两种表达形式存在。但以不可溶性形式为主。表达量随诱导时间延长而增加，在诱导8h时目的蛋白约占菌体总蛋白的32％。经亲和层析获得较高纯度的人MT-1E融合蛋白。结论：利用基因重组原核表达技术获得较纯的人源性MT-lE融合蛋白。为进一步研究金属硫蛋白的功能及特异性抗体的制备奠定了基础。     

EB病毒GST-Rta融合蛋白的表达、纯化及其多克隆抗体的制备

目的 表达和纯化EB病毒的重组融合蛋白谷胱氨肽S转移酶（GST）-Rta185和GST-Rta150,并制备特异性多克隆抗体。方法 质粒表达载体pGEX-R185I、pGEX-R150I和pGEX-5X-3分别转入大肠杆菌BL21（DE3）中,异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）诱导表达,用Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化目的蛋白。将纯化后的GST-R185、GST-R150和GST蛋白免疫新西兰大白兔制备抗血清。结果 在细菌裂解液中检测到高表达量的融合蛋白,经Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化获得较高纯度的GST-Rta融合蛋白。应用Western blot和ELISA方法检测证实,用纯化的GST-Rta蛋白免疫家兔得到了特异性的多克隆抗体。结论 通过上述方法制备出来的融合蛋白纯度较高,免疫家兔获得的多克隆抗体具有良好的特异性,为研究EB病毒Rta蛋白及与EB病毒相关疾病的诊断和治疗提供了重要的条件。     

血管生成素与绿色荧光蛋白融合蛋白的表达及纯化

目的:表达并纯化血管生成素(ANG)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白,以进一步探讨血管生成素的生物学功能。方法:PCR扩增人ANG基因,将其与EGFP基因融合后克隆到高表达载体pMFHT,构建了原核表达质粒pHIS鄄ANG鄄EGFP。该质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并用金属螯合亲和层析纯化目的蛋白。激光共聚焦显微镜和Westernblot鉴定融合蛋白的表达情况。结果:重组蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,并从破菌上清中一步纯化目的蛋白,纯度可达95%以上。Westernblot分析表明表达产物具有良好的抗原性和特异性。诱导表达的菌体在激光共聚焦显微镜下可发射明亮的绿色荧光。结论:成功的表达并纯化了ANG鄄EGFP融合蛋白,利用EGFP的荧光示踪作用,该融合蛋白可用于血管生成素核转位和胞内共定位蛋白质研究。     

GST-p60PLAD融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达和纯化

目的:制备GST-p60PLAD融合蛋白. 方法:依据人p60PLAD氨基酸序列,根据大肠杆菌偏爱密码子进行反翻译,获得适合在大肠杆菌中表达的基因序列. 根据该基因序列设计五条引物,用重叠延伸PCR法获得编码人p60PLAD的基因,进而将其克隆入原核表达载体pGEX-4T-2中,转化大肠杆菌BLR(DE3)polys. 经IPTG诱导表达后收集菌体,超声裂解,将上清液经GSTrapFF亲和层析柱纯化、经HiTrap脱盐柱脱盐,用SDS-PAGE进行分析. 结果:成功构建重组质粒pGEX-4T-2-p60PLAD,经DNA 测序证实插入序列与设计完全一致. 并在大肠杆菌中高表达出Mr约为34×103大小具有可溶性的目的蛋白,经亲和层析柱纯化后获得纯度很高的GST-p60PLAD融合蛋白. 结论:成功制备了高纯度的GST-p60PLAD融合蛋白,为进一步探讨p60PLAD蛋白的结构和生物学活性提供必要的物质基础.     

GST-p43/AIMP1融合蛋白表达和纯化以及与NF-L的相互作用

目的 构建人p43/AIMP1蛋白与谷胱甘肽转移酶(GST)重组的融合蛋白原核表达载体并进行表达纯化,通过GST-pull down方法验证其与神经中间丝轻链(NF-L)的体外直接相互作用.方法 以重组质粒pcDNA3.1-p43为模板,扩增p43/AIMP1基因,产物经纯化回收后与原核表达载体pGEX4T-1连接构建成新载体GST-p43/AIMP1,经鉴定完全正确后转化大肠埃希菌B.21(DE3),通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,并纯化获得目的蛋白;将myc-NF-L体外转染HEK293T细胞,利用GST pull-down原理和方法验证人p43蛋白与神经中间丝轻链蛋白NF-L之间的相互作用.结果 酶切鉴定和测序结果显示,成功构建了GST-p43/AIMPI融合蛋白原核表达载体;考马斯亮蓝染色和Western blotting结果显示,成功获得有生物活性的GST-p43/AIMPI融合蛋白;GST pull-down实验结果证实,p43/AIMP1与NF-L存在直接相互作用.结论 获得有生物活性的GST-p43/AIMP1蛋白,并成功应用GST pull-down方法证实p43/AIMP1与NF-L在体外存在直接的相互作用.     

p53蛋白的原核表达及其鸡卵黄抗体的制备

目的制备抗p53蛋白卵黄抗体。方法原核表达p53融合蛋白,纯化后免疫产蛋母鸡。结果融合蛋白能有效刺激母鸡产生抗体,末次免疫后其卵黄抗体滴度达到1∶106,并且能维持较长时间。结论本文介绍的方法是一种简便、经济、特异、高效、均一、来源充足的抗体产生方法。     

CTLA-4/Ig融合蛋白在COS-7中的表达、纯化及鉴定

探讨ＰＣＴＬＡ－４／Ｉｇ融合蛋白表达载体在哺乳动物细胞中的表达及表达产物的鉴定,纯化为其功能研究和临床应用奠定基础。方法将ｐＣＴＬＡ－４／Ｉｇ表达质粒转染ＣＯＳ－７细胞,双抗体夹心ＥＬＩＳＡ检测细胞培养上清中融合蛋白表达：ＰｒｏｔｅｉｎＡ亲和层析纯化,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹、＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入等进行分子量,纯度、抗原特异性及生物知性鉴定。结果在ＰＣＴＬＡ－４／Ｉｇ质粒转染后的４８ｈ的     

幽门螺杆菌双价亚单位分子内佐剂疫苗的构建表达与纯化

目的 克隆表达幽门螺杆菌外膜蛋白烷基过氧化氢还原酶ahpC、ureB414功能片段基因,与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位构建融合基因ahpC-ureB414-ltB(aul).方法 采用重叠延伸PCR的方法,以AhpC做为融合蛋白前端,与UreB414功能片段及黏膜佐剂ltB依次串联,在片段间引入5个氨基酸的柔性Linker GGGGS进行连接;将融合基因构建在原核表达载体pET-22b( )中,经酶切及测序鉴定后转化宿主菌E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白ahpC-UreB414.ltB(AUL).融合蛋白经AKTA-explore纯化仪纯化融合蛋白.结果 PCR扩增出1 350 bp的目的 基因片段aul,工程菌pET22b-aul/BL21经IPTG诱导后,SDS-PAGE显示有新生的蛋白表达条带,相对分子质量约为50×103,与预期值一致,目的 蛋白约占菌体总蛋白的28.7%,重组蛋白用Ni2 -NTA树脂提纯.纯化后的蛋白质经SDS-PAGE分析可见单一条带,图像软件分析表明纯度可达85%以上.Western blot显示重组蛋白质具有良好的免疫反应性.结论 成功构建、表达融合蛋白rAUL,纯化后的融合蛋白保持各亚单位组分及佐剂的独立免疫反应性.     

类泛素化修饰蛋白SUMO3/GST融合蛋白表达载体的构建及表达

目的:构建pGEX-4T- 1/SUMO3重组表达质粒,并在大肠杆菌中表达和纯化出类泛素化修饰蛋白SUMO3/GST融合蛋白.方法:采用PCR技术利用pcDNA3.1-SUMO3质粒为模板,扩增出SUMO3全长编码序列(312 bp),并将其重组于谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达质粒pGEX-4T-1中,酶切、测...