囊泡单胺类转运体功能抑制对PC12细胞凋亡的影响

目的：研究帕金森病黑质多巴胺神经元的死亡机理。方法：用四甲基偶氮唑盐（MTT）法及流式细胞仪观察囊泡单胺类转运（VMAT）功能抑制对大鼠嗜铬细胞瘤（PC12）细胞凋亡的影响。结果：单独作用的VMT抑制剂和利血平对PC12细胞无毒性作用，超过一定浓度的多巴胺（0．3mmol/L）对PC12细胞有毒性作用，利血平协同钦巴胺明显增加多巴胺的毒性，使同伴浓度的多巴胺诱发PC12细胞的凋亡率明显增加，致使较低浓度的多巴胺（0．15mmol/L）就可降低PC12细胞生存率，结论：VMAT功能抑制引发了多巴胺的内源性毒性，进而诱发多巴胺神经元的凋亡，可较好地解释帕金森病的发病机理。     

利血平和多巴胺对大鼠嗜铬瘤细胞生长的影响

目的：研究囊泡单胺类转运体(VMAT)功能抑制在帕金森病发病机制中的作用途径。方法：用MTT法及流式细胞仪观察VMAT功能抑制对大鼠嗜铬瘤细胞(PC12)存活的影响和细胞死亡方式。结果：单独作用的VMAT抑制剂利血平对PC12细胞无毒性作用；超过一定浓度的多巴胺(0．2mmol／L)对PC12细胞有毒性作用；利血平协同多巴胺明显增加多巴胺的毒性，使同样浓度的多巴胺诱发PC12细胞的凋亡率明显增加。随着多巴胺浓度的增加脂质过氧化物丙二醛(MDA)亦相应增加。受药物毒性作用的PC12细胞主要以凋亡途径死亡。结论：VMAT功能抑制触发的多巴胺内源性毒性可能通过氧化应激诱发凋亡和坏死而发挥毒性作用。     

6-羟多巴胺及囊泡单胺类转运功能抑制对PC12细胞凋亡的影响

目的探讨6-羟多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)及囊泡单胺类转运体(vesicular monoamine transport-er,VMAT)功能抑制对大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞细胞凋亡的影响。方法不同浓度6-OHDA(25、50、100、200μmol/L)及VMAT功能抑制剂利血平(50、100、400、1 600nmol/L)与6-OHDA(100μmol/L)作用于PC12细胞,于不同时间点(12、24、36、48h)用流式细胞仪检测细胞凋亡率,并用Western blot法检测PC12细胞Bcl-2蛋白及Bax蛋白活性。结果加入不同浓度的6-OHDA时PC12细胞凋亡随6-OHDA浓度增加显著上升,并且引起Bcl-2蛋白表达抑制,Bax蛋白表达上升,具有时间依赖性。加入利血平后,相应的细胞凋亡增多,Bcl-2蛋白表达降低明显,Bax蛋白表达增多,差异有统计学意义。结论研究提示6-OHDA能诱导PC12细胞凋亡,并呈剂量及时间依赖性,其作用机制涉及到VMAT功能抑制触发了6-OHDA的内源性毒性,抑制Bcl-2蛋白的表达,促进细胞内Bax的表达,进而诱发多巴胺能神经元的凋亡。     

囊泡单胺类转运体功能抑制在帕金森病发病机制中作用的研究

帕金森病（PD）发病机制有多种学说，近年的科学研究从帕金森病黑质多巴胺能神经元选择性受损出发，发现黑质纹状体系统自身的多巴胺递质囊泡转运体（VMAT２）受到抑制而触发的多巴胺内源性毒性可能在帕金森病发病机制中起了关键的作用犤１，２犦。２０００～２００２年，本课题组通过研究加入VMAT特异性抑制剂利血平（RE）后犤３犦，cDNACHO细胞（转PC１２细胞含VMAT２基因的转基因中国仓鼠卵细胞）和野生株中国仓鼠卵细胞（wtCHO细胞）的死亡方式及多巴胺毒性在大鼠嗜铬瘤细胞（PC１２）细胞的作用途径，探讨了PD的发病机制…     

囊泡单胺类转运体功能抑制对PC12细胞的毒性及抗氧化剂的干预

目的：研究囊泡单胺类转运体(VMAT)功能抑制对大鼠嗜铬瘤(PC12)细胞产生的内源性毒性及抗氧化剂的保护作用。方法：用流式细胞仪观察VMAT功能抑制以及不同干预方法对PC12细胞存活的影响和细胞死亡方式。结果：单独加入VMAT抑制剂利血平对PC12细胞无毒性作用；利血平协同多巴胺明显增加多巴胺的毒性，使同样浓度的多巴胺诱发PC12细胞的凋亡率明显增加。加入还原型谷胱甘肽(GSH)、二硫苏糖醇(DTF)和脉冲1号使PC12细胞的生存率明显提高。结论：VMAT功能抑制触发了多巴胺内源性毒性可诱发细胞凋亡，具有抗氧化作用的制剂有细胞保护作用。     

辅酶Q10能有效抑制鱼藤酮诱导的细胞毒性作用

目的:探讨辅酶Q10对鱼藤酮介导的多巴胺能神经元损伤是否具有保护作用并研究其机制.方法:原代培养孕 14 d的胎鼠中脑多巴胺能神经元.以不同剂量的鱼藤酮建立细胞凋亡模型.通过 TH 免疫细胞化学进行鉴定,测定LDH值以了解细胞活力.以罗丹明123染料进行流式细胞仪检测线粒体膜电位(△Ψm).结果:鱼藤酮干预多巴胺能神经元24 h后,细胞活力及△Ψm均明显下降,与0 nmol/L鱼藤酮组比较,15 nmol/L及30 nmol/L鱼藤酮组的LDH值(U/ml)显著增加(P<0.05),其△Ψm(%)则明显下降(P<0.05);辅酶Q10 12 h能显著缓解细胞△Ψm的下降,与15 nmol/L鱼藤酮组比较,50 μmol/L 及100 μmol/L 辅酶 Q10预处理组的△Ψm(%)明显上升(P<0.05).结论:辅酶 Q10能有效抑制鱼藤酮诱导的细胞毒性作用.     

利血平对转染VMAT2基因的CHO细胞抵抗鱼藤酮及多巴胺毒性作用的研究

目的研究单胺囊泡转运蛋白 2（VMAT2）抑制剂利血平（RE）作用于转染VMAT2基因的中国仓鼠卵巢细胞（VMAT2 CHO）时,VMAT2 CHO对鱼藤酮（Rotenone）、多巴胺（DA）的毒性抵抗作用。方法采用MTT比色法检测RE与不同浓度Rotenone及DA共同作用下的VMAT2 CHO细胞存活率;采用流式细胞仪检测细胞内活性氧（ROS）水平。结果Rotenone对VMAT2 CHO细胞有毒性作用,随浓度增大,细胞存活率下降;Rotenone和DA对细胞有协同毒性作用。随DA浓度增大,VMAT2 CHO细胞产生的ROS增加;VMAT2抑制剂利血平增加DA的毒性,使同样浓度的DA诱发VMAT2 CHO细胞产生的ROS增加,存活率下降。结论RE使VMAT2功能抑制时DA在胞浆内聚集,触发DA内源性毒性,通过氧化应激系统而发挥毒性作用。DA内源性毒性可协同环境毒物Rotenone增加对细胞的毒性作用。     

华蟾酥毒基抑制人前列腺癌PC3细胞体外增殖研究

目的探讨华蟾酥毒基对人前列腺癌PC3细胞体外增殖和凋亡的影响及其可能存在的作用机制。方法细胞分为不加药对照组,5、50、100、500 nmol/L华蟾酥毒基组,共5组。各组作用于PC3细胞24、48 h后,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测华蟾酥毒基对人前列腺癌PC3细胞增殖的影响。不同浓度华蟾酥毒基作用于PC3细胞48 h后,光学显微镜观察PC3细胞形态变化;克隆形成实验检测华蟾酥毒基对前列腺癌PC3细胞克隆形成能力的影响;流式细胞术检测华蟾酥毒基作用48 h后各组PC3细胞凋亡情况;蛋白质印迹法检测华蟾酥毒基对髓样细胞白血病-1(MCL-1)蛋白表达的影响。结果 24 h后华蟾酥毒基可在体外抑制PC3细胞增殖(P 0. 01),48 h后华蟾酥毒基对PC3细胞增殖抑制作用更为明显(P 0. 05),华蟾酥毒基对PC3细胞增殖能力有较好的抑制作用,且呈剂量和时间依赖性。细胞克隆形成实验发现,0. 5 nmol/L华蟾酥毒基即可抑制细胞克隆形成(P 0. 05),并且此种抑制作用与药物浓度呈正相关(P 0. 05)。流式细胞术结果显示,0. 5nmol/L以上华蟾酥毒基均可诱导PC3细胞凋亡,随浓度增加凋亡率显著增加(P 0. 01),50 nmol/L华蟾酥毒基干预48 h后,PC3细胞凋亡率为39. 667%;同时光学显微镜下细胞增殖抑制明显,并呈凋亡形态改变。蛋白质印迹法结果显示,不同浓度华蟾酥毒基均可下调抗凋亡蛋白MCL-1蛋白表达(P 0. 01),以50 nmol/L华蟾酥毒基作用于PC3细胞48 h下调MCL-1蛋白表达更为显著(P0. 01)。结论华蟾酥毒基可抑制前列腺癌PC3细胞的体外增殖,并可诱导肿瘤细胞凋亡,其机制可能与抗凋亡蛋白MCL-1表达下调有关。     

囊泡单胺转运体在帕金森病小鼠脑组织中的分布特征

目的：探讨囊泡单胺转运体(VMAT2)在帕金森病(PD)小鼠模型脑组织中的分布特征与帕金森病的关系。方法：使用利血平、MPTP及联合利血平和MPTP分别造成C57BL小鼠的PD模型，应用免疫组织化学方法观察VMAT2和TH在黑质致密部、纹状体、腹侧被盖和蓝斑分布的变化。结果：免疫组织化学分析显示，帕金森病小鼠较对照组小鼠VMAT2和酪胺酸羟化酶(tvrosine hvdmxvlase，TH)阳性神经元细胞数目在黑质致密部明显减少，腹侧被盖和蓝斑中的阳性神经元细胞数无明显变化；VMAT2和TH在纹状体区域阳性神经元纤维明显减少；同时发现在正常对照组中VMAT2在黑质致密部中的分布既少于腹侧被盖也少于蓝斑。结论：这种对多巴胺神经元具有保护作用的VMAT2在黑质致密部中的分布少于腹侧被盖和蓝斑，黑质致密部保护作用薄弱是帕金森病黑质选择性受损的重要原因。     

麦冬皂苷D'通过RIP1/MLKL诱导前列腺癌PC3细胞程序性坏死

目的 研究天然皂苷类化合物麦冬皂苷D'(Ophiopogonin D',OPD')对雄激素非依赖的前列腺癌PC3细胞的抗肿瘤效应及其机制.方法 不同浓度的OPD'处理前列腺癌PC3细胞后,MTT实验检测细胞生长能力,流式细胞术检测Annexin V-Fitc和PI双染,Western blot检测程序性坏死相关蛋白——受体相互作用蛋白1(receptor interacting protein-1,RIP1)、混合谱系激酶结构区域样蛋白(mixed lineage kinase domain-like,MLKL)的表达,结晶紫染色、透射电镜观察细胞形态学的改变.结果 OPD'抑制PC3细胞生长活性,24 h IC50值为(6.25±0.31) μmol/L.5μmol/L OPD'处理24 h诱导PC3细胞凋亡和坏死,5μmol/L OPD'处理6 h PC3细胞在晚期凋亡/坏死象限呈明显的时间依赖关系(r =0.728,P＜0.001).OPD'诱导PC3细胞Caspase非依赖性死亡,且其死亡能被程序性坏死(necroptosis)特异性抑制剂necrostatin-1(Nec-1)所抑制(P =0.047),表明OPD'诱导PC3细胞程序性坏死.OPD'下调Cleaved-RIP1、上调RIP1的表达;上调p-MLKL四聚体的表达,并呈明显的时间依赖关系(r =0.907,P=0.005).形态学上OPD'诱导PC3细胞坏死样改变.结论 OPD'抑制前列腺癌细胞生长具有明显的抗肿瘤效应,而诱导其通过RIP1/MLKL通路发生程序性坏死可能是其发挥抗肿瘤效应的机制之一.     

多巴胺诱导PC12细胞凋亡的免疫组织化学及超微结构分析

目的 研究帕金森病（PD）多巴胺能神经元的死亡机制,方法在免疫组织化学基础上,采用流式细胞仪,电泳及电镜技术观察不同浓度多巴胺（DA）诱导大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞凋亡的超微结构及生化改变。结果 适当浓度DA可诱导PC12细胞凋亡,早期表现为线粒体结构及功能的改变并有抗凋亡蛋白bcl-2的达,后期电镜下可见亡特征性核结构改变及典型的DNA阶梯状电泳带,结论 细胞凋亡参与了PD的病变过程,线粒体在早期细胞凋亡中起着重要的调节作用。     

6-羟基多巴胺致PC12细胞损伤机制中自噬的影响

目的 研究自噬在帕金森病(PD)细胞模型中的作用及可能的机制.方法 体外培养的PC12细胞加入6-羟基多巴(6-OHDA)诱导多巴胺能神经元损伤模型.利用透射电镜观察PC12细胞中自噬的激活,免疫印迹法检测LC3-Ⅱ、Cathepsin B蛋白的表达.结果 电镜下观察到6-OHDA可使PC12细胞内自噬体增多,并出现了凋亡特征.6-OHDA作用2h(灰度比:52.57±2.27),4h(灰度比:56.83±3.51),6h(灰度比:73.43±5.41),12h(灰度比:103.90±2.57),24h(灰度比:100.40±3.91)时LC3-Ⅱ表达逐渐升高,与正常对照组(42.10±2.05)比较差异有统计学意义(P＜0.05),模型组Cathepsin B(113.80±4.46)表达与正常对照组(35.89±3.40)比较明显增加(P＜0.01),与模型组相比,广谱蛋白酶抑制剂UTI组(57.69±4.24)降低Cathepsin B表达(P＜0.01).结论 自噬/溶酶体途径参与PC12细胞的死亡过程:6-OHDA诱导自噬过度激活,LC3-Ⅱ与Cathepsin B表达增加,促进细胞死亡.

Abstract：

Objective To investigated the role of the autophagy lysosomal pathway in PD cells and the possible molecular mechanisms. Methods A dopaminergic neuronal injury model was induced by 6-OHDA in PC12 cells . Autophagosomes in PC12 cells were examined by transmission electronmicro-scopy( TEM ). The expression of LC3- Ⅱ , Cathepsin B were assayed by western blot analysis. Results TEM revealed that the autophagosomes were increased in PC12 cells after 6-OHDA treatment and appeared apoptosis. The LC3-Ⅱ (2h:52.57 ±2.27,4h:56.83 ±3.51,6h:73.43 ±5.41,12h:103.90 ±2.57,24h: 100.40 ±3.91 )and Cathepsin B expression ( model group: 113.80 ± 4.46; normal group 35.89 ± 3.40) were increased after 6-OH DA treatments (P ＜ 0.05 or P ＜ 0.01 ). Conclusion The results indicate that autophagy lysosome pathway is involved in 6-OHDA-induced cell death in PC12 cells.     

氯胺酮对谷氨酸损伤PC12细胞株多巴胺释放的影响

目的 观察氯胺酮持续存在对谷氨酸损伤前、后的神经元样PC12细胞株释放多巴胺的影响。方法 制备谷氨酸损伤前、后的神经元样PC12细胞株模型，采用HPLC技术检测加氯胺酮前、后细胞释放的多巴胺的变化。结果 氯胺酮无论是单独与细胞孵育，或者与谷氨酸共同处理，均能够抑制细胞释放多巴胺，并呈剂量依赖性。结论 氯胺酮持续存在对PC12细胞多巴胺的释放产生抑制作用。     

ELDEPRYL AND RILUZOLE INHIBIT 1—METHYL—4—PHENYL—1，2，3，6—TETRAHYDROPYRIDINE （MPTP）—INDUCED NIGRAL NEURONAL APOPTOSIS IN MICE

Ｒ啨ｓｕｍ啨　　 Ｏｂｊｅｃｔｉｆ　Ｅｔｕｄｉｅｒｌｅｒ ｌｅｐｏｓｓｉｂｌｅｊｏｕ啨ｐａｒｌ ａｐｏｐｔｏｓｅｄａｎｓｌａｐａｔｈｏｇ啨ｎ埁ｓｅｄｅｌａｍａｌａｄｉｅｄｅＰａｒｋｉｎｓｏｎ .　Ｍ啨ｔｈｏｄｅｓ　ＬｅｓｓｏｕｒｉｓＣ57ＢＬ啨ｔａｉｅｎｔｔｒａｉｔ啨ｅｓＰａｒ 1 ｍ啨ｔｈｙｌ 4 ｐｈ啨ｎｙｌ 1,2 ,3,6 ｔ啨ｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ(ＭＰＴＰ) .ＬｅｓｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓＴＵＮＥＬｅｔｃｙｔｏｍ啨ｔｒｉｅａｕｃｏｕｒａｎｔ (ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ)啨ｔａｉｅｎｔｅｍｐｌｏｙ啨ｅｓ…     

Geniposide inhibits CoCl2-induced PC12 cells death via the mitochondrial pathway

Background A number of studies have shown that oxidative stress and mitochondrial involvement are major triggering factors in the development of neurodegenerative diseases. Cobalt chloride （CoCl2）-induced cell death in PC12 cells may serve a simple and convenient in vitro model of hypoxia-induced neuronal cytotoxicity. To explore the effect of geniposide on COCl2 which induced cytotoxicity and mitochondrial function in rat pheochromocytoma PC12 cells, we analyzed the influence of geniposide on the expression of apoptosis-related proteins. Methods PC12 cells and RNAi PC12 cells were treated with 0, 12.5, 25, 50, 100 umol/L geniposide for 12 hours and then exposure to 400 umol/L COCI2 for 12 hours. Cell viability, cell morphology, and expression of Bcl-2, Bax, P53 and caspase-9 were determined using Western blotting. Results Pretreatment with geniposide markedly improved the cells viability and morphology, decreased the expression of Bax, P53 and caspase-9, and increased the expression of Bcl-2 in PC12 cells challenged by CoCl2. However, in the RNAi PC12 cells, geniposide had no significant effect on the expression of these proteins. Conclusion Geniposide protects PC12 cells from CoOl2 involved in mitochondrial mediated apoptosis, and GLP-1R might play a critical role in the neuroprotection of geniposide in PC12 cells.     

多巴胺对PC12细胞凋亡的诱导作用

目的 研究外源性多巴胺对多巴胺能神经元的毒性作用,方法 采用体外培养的PC12细胞为模型,以终浓度0.45mmol/L的多巴胺对细胞进行诱导。结果 在透射电镜下可见培养的PC12细胞核染色质明显固缩、断裂,原位末端标记技术显示胞核内散在分布断裂DNA片段,流式细胞仪检测到DNA周期中G0-G1期前出现明显的亚二倍体峰,琼脂糖凝胶电泳呈现典型的“梯状”带等细胞凋亡的特征性改变。结论 外源性DA可诱导PC12细胞凋亡。     

Eldepryl prevents 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-induced nigral neuronal apoptosis in mice

Objective To study the apoptotic effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydrop yridine (MPTP) on the nigral dopaminergic neurons of mice and 1-methyl-4-phen ylpyridium ion (MPP(＋)) on pheochromocytoma (PC12) cells, as well as the antagon ism of Eldepryl against MPTP’s apoptotic effect.Methods Three groups of C(57)BL mice were treated with MPTP, Eldepryl plus MPTP and normal saline, respectively, for 7 days before performing TUNEL (terminal deoxyn eucleotidyl transferase-mediated dUTP-x nick end labeling) and FACS (fluoresce nce activated cell sorting) analyses of neuronal apoptosis in the substantia nig ra. The same tests were employed in cell culture to examine apoptosis in PC12 c ells treated with MPP(＋), MPTP or PBS. Results Intraperitoneal administration of MPTP 30 mg/kg could induce nigral apoptos is, and oral use of Eldepryl prior to MPTP treatment could completely prevent the ni gral apoptosis caused by MPTP. MPP(＋), an intermediate metabolite of MPTP, coul d lead to the apoptosis of PC12 cells, whereas MPTP itself had no such effect on PC12 cells. Conclusions The experiment indicated that the neurotoxin, MPTP, might cause the death of nig ral neurons through a mechanism of apoptosis and this effect might be mediated b y its bioactive intermediate metabolite MPP(＋). Eldepryl could protect the neurotoxicity from MPTP.     

高热预处理对PC12细胞氧化应激损伤的保护作用

目的 探讨高热预处理（HPC）对过氧化氢（H2O2）所致大鼠嗜铬细胞瘤株（PC12）细胞氧化应激损伤的影响。方法 体外培养PC12细胞,将细胞分为正常对照组、HPC组、H2O2组、HPC＋H2O2组,采用MTT法测定细胞活力,乳酸脱氢酶（LDH）检测细胞损伤,流式细胞术分析细胞凋亡。结果 与正常对照组相比,H2O2组引起PC12细胞MTT活力明显下降（P〈0．01）,LDH释放量增多（P〈0．01）,凋亡明显;而与H2O2处理组相比,HPC＋H2O2组则表现为MTT活力升高（P〈0．05）,LDH释放量减少（P〈0．05）,且没有出现明显凋亡。结论 高热预处理对H2O2所致PC12细胞氧化应激损伤产生保护作用。     

DJ-1对MPP+诱导的多巴胺能神经元损伤的保护机制研究

目的 探讨DJ-1基因对MPP+诱导的多巴胺能神经元损伤模型的保护机制.方法 用神经生长因子(NGF)将PC12诱导成神经元样分化的细胞株(多巴胺能神经元).用1-甲基-4苯基吡啶离子(MPP+)诱导帕金森病PC12细胞损伤模型,用CCK-8试剂盒检测细胞增殖活性,DHE染色法检测ROS水平变化.Western blot检测DJ-1和TH蛋白表达变化,RT-qPCR检测α-synuclein和凋亡相关基因的RNA水平.用pCDH1-cmv载体过表达DJ-1后检测DJ-1对MPP+环境中细胞的保护作用.用RT-qPCR检测α-synuclein、p53和Bax的表达变化.结果 160μmol/L的MPP+处理18 h后,PC12细胞活性降低,细胞内ROS水平升高,处理48 h后细胞凋亡增加.DJ-1和TH蛋白表达均明显下调,RNA水平上α-synuclein、p53和Bax表达增加.过表达DJ-1能够保护MPP+中的细胞活性,抑制ROS水平升高.α-synuclein以及凋亡基因p53和Bax的表达升高受到抑制,细胞凋亡减少.结论 MPP+作用于多巴胺神经元,可以下调DJ-1和TH蛋白,促进α-synuclein积累ROS水平升高,并使p53和Bax表达增加,导致细胞凋亡增加.DJ-1基因能够能够在MPP+处理时抑制p53和Bax的表达,减少α-synuclein积累,降低细胞内ROS水平,保护细胞免受MPP+引起的损伤.