maspin/pEFIRES-N表达载体的构建及应用

目的构建maspin/pEFIRES-N表达载体,为深入研究maspin基因抑制肝癌生长、转移、浸润作用和机制奠定基础.方法 PCR扩增maspin基因全长,将表达载体pEFIRES-N用EcoRⅠ XbaⅠ进行双酶切后,T4DNA连接酶连接成重组质粒,稳定转染到肝癌高转移细胞株mHCC-97中进行表达,检测稳定转染前后maspin表达的变化.结果重组质粒在大肠杆菌株JM109内扩增.提纯、纯化后用EcoRⅠ、XbaⅠ酶切鉴定及测序鉴定证明maspin基因已完整、正确的插入到pEFIRES-N表达载体,并在肝癌MHCC-97细胞中上调了maspin基因mRNA和蛋白水平表达,抑制了肝癌MHCC-97细胞增殖及浸润.结论成功构建了maspin/pEFIRES-N表达载体,能在真核细胞中表达.     

抑癌基因maspin在肝癌细胞株MHCC-97中对VEGF的生物学作用

目的:探讨抑癌基因maspin在肝癌细胞株MHCC-97中对血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的生物学作用及意义.方法:构建maspin/pEFIRES-N表达质粒,重组质粒转染后,采用RT-PCR及Western Blot方法分别从mRNA和蛋白水平检测肝癌细胞株MHCC-97中maspin和VEGF转染前后的表达.结果:成功构建maspin/pEFIRES-N重组质粒,并稳定转染到肝癌细胞株MHCC-97中,显爪转染maspin基因后在肝癌细胞株MHCC-97中maspin的mRNA和蛋白表达明显增强,而VEGF的mRNA和蛋白表达明显减弱(P<0.05).结论:在肝癌细胞株MHCC-97中,maspin基因的过表达会降低VEGF的mRNA及蛋白表达,从而可能抑制新生血管形成,阻止肿瘤细胞的增生和转移.     

过表达maspin基因对肝癌细胞株MHCC-97中VEGF，uPA表达的影响

目的:探讨过表达maspin基因对肝癌细胞株MHCC-97中VEGF和uPA表达的影响及意义.方法:构建maspin/pEFIRES-N表达质粒,重组质粒转染后,采用RT-PCR及Western Blot方法分别从mRNA和蛋白水平检测肝癌细胞株MHCC-97中maspin,VEGF和uPA转染前后的表达.结果:成功构建maspin/pEFIRES-N重组质粒,并稳定转染到肝癌细胞株MHCC-97中.比较maspin/pEFIRES-N组和pEFIRES-N组的肝癌细胞株MHCC-97中maspin,VEGF和uPA的表达,结果显示转染maspin基因后在肝癌细胞株MHCC-97中maspin的mRNA和蛋白表达明显增强,而VEGF,uPA的mRNA和蛋白表达明显减弱(P<0.05).结论:在肝癌细胞株MHCC-97中,maspin基因的过表达会降低VEGF和uPA的mRNA及蛋白表达,从而可能抑制新生血管形成、阻断纤溶酶原激活物调节uPA的活性,减少ECM的降解,阻止肿瘤细胞的转移.     

hCTGF基因真核表达载体的构建及在HUVECs中的表达鉴定

目的 构建人结缔组织生长因子(CTGF)基因真核表达载体，并在哺乳类细胞人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中获得表达。从而为进一步研究CTGF基因在血管新生的作用打下基础。方法 根据人CTGF基因的cDNA序列，设计合成一对5′端分别含有Xba Ⅰ和HindⅢ酶切位点的特异性引物，运用RT-PCR方法扩增JIVECs中CTGF，回收PCR产物，并将其连接至克隆载体PIM-18中，重组的PUMT-18在大肠杆茵DH5α内扩增后，经质粒提取、XbaⅠ和HinsⅢ酶切，筛选出阳性重组子，并进行基因测序鉴定；琼脂糖凝胶电泳回收含有CTGFcDNA全长的酶切片段，然后在DNA连接酶作用下将其与真核表达载体pcDNA3．1(-)连接，重组质粒经XbaⅠ和HindⅢ酶切予以鉴定。并将其转染到HUVECs中，Western blotting法证实其表达。结果 RT-PCR产物含有CTGFcDNA，基因测序显示重组的PUMT-18中含有正确的人CTGFcDNA全长编码序列，重组的pcDNA3．1(-)含有人CTGFcDNA全长编码序列，Western blotting证实重组的真核表达载体在人脐静脉内皮细胞成功转染并表达。结论 成功构建人结缔组织生长因子CTGF基因的真核表达载体。     

hHGF腺病毒载体的构建及其在人脐带间质干细胞中的表达

目的:构建人重组肝细胞生长因子(human hepatocyte growth factor,hHGF)基因腺病毒载体(Ad-HGF),转染人脐带间质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hucMSCs),为转基因治疗提供实验基础.方法:设计含有SalⅠ及XbaⅠ酶切位点的引物,PCR扩增hHGF,将扩增产物克隆到带有绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)标记的pAdTrack-CMV穿梭质粒上.重组穿梭质粒经PmeⅠ线性化后,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183中同源重组,筛选获得含有hHGF的重组腺病毒质粒,PCR、酶切鉴定并测序.重组病毒质粒用PacⅠ酶切线性化,脂质体转染293A细胞,经3轮扩增,制备高效表达的AdGFP/HGF,并转染hucMSCs.结果:重组腺病毒质粒经PCR和SalⅠ,XbaⅠ酶切鉴定,证实含有HGF基因,测序结果和设计片段的序列一致.荧光显微镜下发现293A细胞发光率几乎为100%,感染的hucMSCs亦可表达绿色荧光蛋白.结论:成功构建了hHGF腺病毒表达载体,并获得高滴度的病毒, 能高效感染hucMSCs,为后续研究奠定了基础.     

人脂联素基因重组腺病毒的构建与鉴定

目的:构建含有人脂联素基因apM1的重组腺病毒载体,制备能表达人脂联素蛋白的重组腺病毒,为脂联素用于体内外干预动脉粥样硬化奠定基础.方法:自质粒pGEM-T-apM1上扩增两端带有Sal Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点的全长apM1基因,将PCR产物和穿梭质粒pShuttle-CMV经Sal Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后,连接、转化、筛选,进行PCR鉴定后送双向测序.将鉴定正确的重组质粒pShuale-CMV-apM1用Pme Ⅰ酶切使其线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转BJ5183菌,进行细菌内同源重组,筛选、鉴定、扩增,Pac Ⅰ酶切后用LipoefctaminTM2000转染低代数的HEK293包装细胞,进行包装出毒.结果:重组穿梭质粒pShuttle-CMV-apM1经PCR和测序鉴定正确,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组成功,转染293细胞进行包装,产生的病毒经鉴定正确,并且无具有复制能力的腺病毒存在,生物安全性高.结论:成功的制备了apM1基因重组腺病毒,可进一步用于脂联素干预动脉粥样硬化的研究.     

转染maspin cDNA在胃癌细胞中的表达及其对uPA和uPAR表达的影响

目的 研究转染maspin cDNA在胃癌细胞中的表达及其对uPA和uPAR表达的影响,探讨maspin基因抑制胃癌浸润转移的机制.方法 构建 maspin/PCR2.1表达载体,转染胃癌细胞株MKN28和SGC7901,用RT-PCR和Western blot检测maspin基因,uPA和uPAR表达的变化.结果 经酶切证实,得到正向插入的真核表达质粒maspin/PCR2.1.成功转染到MKN28和SGC7901细胞中并表达,uPA和uPAR的mRNA和蛋白表达均降低.结论 成功构建了maspin/PCR2.1表达载体,maspin基因可在靶细胞表达,并能抑制uPA和uPAR的表达.     

RNAi-DNA表达载体的构建与应用

目的构建siRNA的DNA表达载体,为研究RNAi在哺乳动物内抑制靶基因表达奠定基础.方法合成含靶向EGFP基因的siRNA转录模板的发夹结构,将载体质粒pTZU6 1用Sal I Xba I进行双酶切后,T4DNA连接酶连接成重组质粒,转染到肝癌SMMC-7721细胞中进行表达,检测转染前后EGFP表达的变化.结果重组质粒在大肠杆菌菌株JM109内扩增.提纯、纯化后用HindⅢ、EcoRI酶切鉴定及测序鉴定证明EGFP-siRNA转录模板完整、正确的插入到pTZU6 1质粒中,并在mRNA和蛋白水平抑制了肝癌SMMC-7721细胞中的EGFP表达.结论成功构建了siRNA的DNA表达载体,并初步应用于靶基因的抑制.     

表达翻转重组酶的真核载体的构建

目的 构建表达翻转重组酶(FLP)重组表达的真核载体.方法 以质粒pFRT为模板,用聚合酶链反应(PCR)扩增出两端包含了Xba Ⅰ和BamH Ⅰ内切酶识别位点的全长FLP基因片段,将该片段插入用Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后的载体质粒pBK-CMV上,构建出重组质粒pBK-CMV-FLP.经过转化、挑选菌落,PCR鉴定且测序均正确.结果 成功构建重组质粒pBK-CMV-FLP.结论 构建好的pBK-CMV-FLP质粒为生物工程上删除筛选标记物提供了良好的条件.     

TNFα-Tumstatin融合基因腺病毒载体的构建及其在人脐带间质干细胞中的表达

目的:构建携带绿色荧光蛋白的TNFα-Tumstatin融合基因腺病毒表达载体,转染人脐带间质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)。方法:设计含有GM-CSF信号肽序列和BglⅡ及HindⅢ酶切位点的引物,PCR扩增TNFα-Tumstatin,将扩增产物亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV上,重组穿梭质粒经PmeⅠ线性化后转化含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183中同源重组。筛选获得含有融合基因的重组腺病毒质粒,酶切鉴定并测序。重组病毒质粒用PacⅠ酶切线性化后转染293A细胞,经过包装、扩增后感染hUCMSCs并检测细胞内融合基因的表达。结果:重组腺病毒质粒经PCR和PacⅠ酶切鉴定,证实含有TNFα-Tumstatin融合基因,测序结果和设计片段的序列一致。重组腺病毒感染的hUCMSCs表达绿色荧光蛋白和融合基因。结论:成功构建了TNFα-Tumstatin融合基因的腺病毒表达载体,能高效率感染hUCMSCs,为进一步研究融合基因修饰的hUCMSCs抗肿瘤效应奠定了基础。     

含HSV-TK基因的真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的　构建AFP增强子CMV启动子调控下的HSV -TK真核表达质粒用于肝细胞癌的靶向基因治疗。方法　采用PCR方法从HepG2细胞基因组DNA中扩增AFP基因增强子最小的功能片断 ,插入pcDNA3.1-LUC质粒的BglII位点 ,从而构建重组表达质粒 pAFP -LUC。HSV -TKcDNA全长序列替换pAFP -LUC质粒中EcoRI位点的LuciferasecDNA全序列构建重组表达质粒 pAFP -TK。质粒 pAFP -LUC采用脂质体法转染AFP阳性的肝癌细胞系HepG2及AFP阴性的非肝癌细胞系HeLa ,用Luciferase分析试剂盒分析Luciferase的表达情况。结果　PCR扩增所得AFP增强子片段的长度和序列通过琼脂糖凝胶电泳、DNA测序得到证实。采用限制性内切酶酶切及PCR方法证实质粒pAFP -LUC中插入的AFP增强子大小、位置及方向均正确。酶切后凝胶电泳分析证实HSV -TK已成功地定向克隆入真核表达载体中。Luciferase报道基因的表达受AFP增强子的调控 ,在AFP阳性肝癌细胞HepG2中高效表达 ,而在AFP阴性的HeLa细胞中表达很低 ,这种差异具有显著性 ,P <0 .0 5。结论　AFP增强子CMV启动子调控的HSV -TK真核表达质粒的构建及其在HepG2细胞中的特异性表达为肝细胞癌的靶向基因治疗提供了实验基础。     

人pcDNA3.1-TPX2真核表达载体的构建与表达

目的:构建TPX2的真核表达载体pcDNA3.1-TPX2,并观察其在食管癌EC9706细胞中的表达。方法:在pQE-70-TPX2原核表达载体基础上,根据GenBank上提供的TPX2基因序列及测序结果,采用Primer Premier 5.0软件设计扩增TPX2基因编码区的引物序列,经HindⅢ和BamHⅠ双酶切,与真核表达载体pcDNA3.1连接后转化感受态大肠杆菌JM109,并进行酶切分析和序列测定。将构建的质粒pcDNA3.1-TPX2体外转染EC9706细胞,进行稳定筛选。用Western blot鉴定基因的表达。结果:DNA测序和BLAST比对表明克隆的人TPX2基因序列正确,进一步酶切分析显示,成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-TPX2,并在EC9706细胞中获得稳定表达。结论:TPX2基因真核表达载体的成功构建为后续研究TPX2基因在肿瘤细胞中的功能奠定了基础。     

反义c-myc表达载体的构建及其瞬时表达对HepG2.2.15细胞的体外生物学效应

目的:构建反义RNA表达载体pcDNA3.1-as-myc,建立新型的c-myc反义RNA肝癌靶向性转移系统,研究瞬时表达对HepG2.2.15细胞的体外生物学效应。方法:XbaI和HindIII双酶切携带目的基因的质粒pcMYC和pcDNA3.1(-)真核表达载体,T4DNA连接酶连接,构建c-myc反义RNA表达载体。合成针对表皮生长因子受体(EGFR)的相应16肽GE7和流感病毒血凝素功能域的HA20寡肽,并与多聚赖氨酸连接,连接物与c-myc的反义RNA表达载体混合,构建新型c-myc反义RNA肝癌靶向性转移系统,即四元复合体。结果:成功构建反义RNA表达载体pcDNA3.1-as-myc,建立了as-myc四元复合体基因转移系统,经HepG2.2.15细胞系瞬时转染,证实c-myc蛋白的表达下降。结论:构建的反义表达载体pcDNA3.1-as-myc具有阻断c-myc表达的效应。     

hTERT启动子调控的TRAIL基因载体的构建及表达

目的：构建hTERT启动子调控的TRAIL基因载体，探讨hTERT启动子调控的转基因表达。方法：PCR法扩增膜结合型TRAIL基因，回收产物与带有hTERT启动子的载体连接，构建重组载体ph—TERT—TRAIL；瞬时转染乳腺癌细胞系MCF-7／ADR；采用RT—PCR法检测外源基因TRAILmRNA水平的表达，流式细胞术(FCM)检测蛋白水平的表达。结果：重组载体phTERT—TRAIL经PCR、酶切出现相应长度的片段；测序结果连入TRAIL基因；目的基因的序列分析结果与Genebank中的数据高度同源；RT—PCR显示细胞中外源基因TRAIL在mRNA水平明显表达；FCM显示转染了重组载体phTERT—TRAIL的细胞较未转染带有TRAIL基因载体的细胞TRAIL蛋白表达水平上调。结论：成功构建重组载体ph—TERT-TRAIL，hTERT启动子调控的TRAIL基因在乳腺癌细胞系MCF-7／ADR中明显表达。     

解偶联蛋白嵌合体及突变体的构建方法

目的：构建解偶联蛋白(UCPs) 嵌合体和突变体,为阐明解偶联蛋白家族功能结构域的研究提供条件。方法：采用普通PCR和重叠延伸PCR获得UCPs 嵌合体基因片段,分别插入pCR2.1测序载体后进行测序,再以限制性内切酶连接方式将嵌合基因定向亚克隆到真核表达质粒pcDNA3.1中,获得pcDNAUCP1UCP2、pcDNAUCP2UCP1和pcDNAUCP3UCP1,以PCR和酶切方法鉴定构建的重组真核表达质粒pcDNA。利用定向点突变产生pcDNA-UCP3R167G/pcDN
A- UCP3RE171/172GG,并进行测序证实。结果：PCR和酶切,获得的目的基因与嵌合基因片段中包含的碱基数量吻合;测序结果,UCPs嵌合体基因序列、突变体基因序列与预期设计完全相同。结论：成功地构建了含有UCPs 嵌合体和突变体基因重组真核表达质粒。
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小鼠Collectrin正反义真核表达载体的构建及其功能

目的:构建新基因Collectrin的正反义真核表达载体,研究其与细胞生长的关系.方法:以PCR的方法扩增Collectrin的开放阅读框序列,与载体pcDNA3.1/V5-His相连构成融合基因表达质粒.将重组后的质粒进行细菌转化,质粒扩增、纯化后,测序鉴定Collectrin的正义及反义序列.以脂质体介导的方法体外转染肾皮质集合管细胞系(M-1).以β-Gal staining的方法测定转染效率.分别行逆转录-PCR和Western blot,检测不同融合基因转染后细胞Collectrin mRNA和蛋白水平的表达变化.以四甲基偶氮唑蓝(MTF)参入法分别在第24小时、第48小时测定不同融合基因转染后细胞增殖活性.结果:M-1细胞在融合基因转染第24小时转染效率最高.Collectrin正义转染组较反义、空载体和正常对照组在核酸和蛋白水平表达量都显著增高,Collectrin反义转染组蛋白表达较其他组明显下调.反义转染组细胞较其他组明显减少.结论:成功构建了Collectrin正义及反义真核表达载体,Collectrin是维持细胞生长存活的重要元件.     

凋亡抑制基因survivin表达载体的构建及其在HepG2中的表达

目的:克隆细胞凋亡抑制蛋白Survivin(SVV)的编码序列,构建含SVV基因的真核细胞表达载体并在肝癌细胞系HepG2中表达,为进一步研究该基因在肝癌发病中的作用奠定基础. 方法:根据已发表的SVV基因的核苷酸序列设计并合成一对引物,以HL-60细胞系抽提的RNA为模板进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),扩增产物用BamHI和XhoI双酶酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.0中,用限制性内切酶酶切重组质粒pcDNA3.0-SVV和DNA序列测定进行鉴定. 用脂质体法将pcDNA3.0-SVV导入肝癌细胞系HepG2中,G418选择培养,经免疫组化法和RT-PCR鉴定其表达. 结果:RT-PCR扩增出长445 bp的特异性片段,经克隆至pcDNA3.0后酶切鉴定证实,并测序表明序列与GenBank报道完全一致. pcDNA3.0-SVV在HepG2细胞中有稳定表达. 结论:成功克隆了SVV的编码序列,构建了其真核细胞表达载体pcDNA3.0-SVV,有助于对SVV基因在肝癌发生中的致瘤机制做进一步研究.     

HSV1-TK基因重组腺相关病毒载体的构建及表达

目的:构建含单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶(HSV1-TK)基因的重组腺相关病毒载体质粒pSNAV2.0-TK,制备重组腺相关病毒rAAV2/HSV1-TK,并检测HSV1-TK基因在转染晶状体上皮细胞中的整合和表达,为后囊膜混浊的基因治疗奠定基础.方法:用基因重组技术构建含HSV1-TK基因的重组腺相关病毒载体质粒pSNAV2.0-TK,并通过PCR和酶切鉴定;将该质粒转染BHK-21细胞,经G418筛选出携带该质粒的载体细胞株BHK-21/TK,在辅助病毒的参与下包装成重组病毒rAAV2/HSV1-TK;用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法和高效液相色谱(HPLC)法检测重组病毒rAAV2/HSV1-TK的纯度,用斑点杂交法检测重组病毒的滴度;重组病毒rAAV2/HSV1-TK转染兔晶状体上皮细胞N/N1003A,用PCR和RT-PCR检测HSV1-TK基因的整合和表达.结果:经PCR和酶切鉴定重组质粒pSNAV2.0-TK构建成功;成功制备了重组病毒rAAV2/HSV1-TK,病毒滴度达1×1012v.g./mL;重组病毒转染N/N1003A细胞后,PCR和RT-PCR检测显示HSV1-TK基因在细胞中整合并且有效表达.结论:成功构建了含HSV1-TK基因的重组腺相关病毒载体质粒,制备了高滴度重组病毒rAAV2/HSV1-TK,HSV1-TK基因在转染该病毒的晶状体上皮细胞中可有效表达.     

H7N9亚型禽流感病毒非结构蛋白-1真核表达载体的构建与表达

目的:构建甲型H7N9亚型禽流感病毒非结构蛋白NS1真核表达载体并转染293T细胞以表达其编码的蛋白?方法:从南京分离株H7N9流感病毒[A/Nanjing/1/2013(H7N9)]提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增NS1全长基因,将其克隆至pMD18-T 载体中构建pMD18-T-NS1质粒,以pMD18-T-NS1质粒为模板扩增NS1基因?双酶切NS1基因PCR产物与PXJ40-MYC后,连接构建真核表达载体PXJ40-MYC-NS1,经酶切及测序鉴定后将质粒转染到293T细胞中,通过Western blot鉴定NS1蛋白的表达?结果:经双酶切?测序鉴定证实NS1基因的真核表达载体构建成功?Western blot法可见NS1基因编码蛋白的成功表达?结论:成功构建了H7N9非结构蛋白NS1真核表达载体,该表达载体的构建为后期建立稳定表达NS1蛋白的细胞模型和NS1蛋白功能研究奠定基础?