犬骨髓基质干细胞诱导为成骨细胞的实验研究

目的：研究骨髓基质干细胞（Bone marrow stromal cells,BMSCs)在体外培养，诱导后的成骨活性，探讨BMSCs作为骨组织工程种子细胞的可能性和可行性。方法：抽取成年犬骨髓，用梯度离心法获取单核细胞，经条件培养液体外诱导培养后，进行组织化学、免疫组化、原位杂交检测，并在透射电镜下观察其成骨活性。结果：第1代细胞Alkaline phosphatase(AKP)染色、Core-binding factor alpha subunit 1(Osf2/Cbfal)、Osteopotin(OPN),I型胶原的免疫细胞化学检测和I型胶原的原位杂交结果开始呈现阳性，第3代细胞Bone Sailoplain(BSP),Osteocalcin(OCN)免疫细胞化学染色开始呈现阳性，透射电镜显示细胞外有胶原分泌和钙盐沉积。结论：BMSCs不仅能大量扩增，且在一定条件下可向成骨细胞分化，是骨组织工程理想的种子细胞。     

体外培养骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响因素研究

探讨影响骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的因素。在骨组织工程中，骨髓间充质干细胞的成骨细胞分化率影响着骨量的形成。本文从诱导条件、细胞密度、支架材料、培养环境等方而综述了影响旗向成骨细胞分化的诸多因素，以期为获得更大量的组织工程化骨提供参考依据。     

成人骨髓基质干细胞体外培养与鉴定

目的：本实验旨在建立一套体外分离培养人骨髓基质干细胞（human bone marrow stem cell HMSCs)的方法，观察HMSCs，体外培养并传代，观察原代及传代细胞的细胞形态及生长规律，第4代细胞用矿化液连续培养30天，在倒置显微镜下观察矿化结节形成情况。结果：体外利用骨髓基质细胞培养液成功培养了HMSCs,并连续传代5－7代，利用第4代细胞用矿化液连续培养30天，矿化结节形成，在细胞间有钙盐沉积。结论：HMSCs可以在体外培养成功，并可定向诱导为成骨细胞，有希望作为极佳的种子细胞应用于临床。     

大鼠骨髓基质干细胞体外培养及成骨作用的实验研究

目的研究大鼠骨髓基质干细胞在体外条件培养下的成骨能力，为骨组织工程选择理想的种子细胞来源。方法取大鼠骨髓基质干细胞进行体外培养，用倒置相差显微镜、钙染色、扫描电镜和X线能谱等手段观察细胞的生长情况和矿化能力。结果细胞呈贴壁型生长，形态为梭形或多角形，在条件培养液中这些细胞间不发生接触抑制，而是相互重叠成多层，形成钙化结节，与成骨细胞的特点相符合。碱性磷酸酶染色呈强阳性，结节钙染色阳性，X线能谱分析显示结节的主要组成元素为钙和磷。结论体外培养的大鼠骨髓基质干细胞具有与成骨细胞相似的形态特征，并能在体外形成钙化的新骨结节。     

人恒牙牙髓干细胞体外定向诱导分化为成骨细胞的研究

目的:研究人恒牙牙髓组织来源的牙髓干细胞在体外分化为成骨细胞的能力,探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性.方法:从正畸治疗减数拔除的恒前磨牙中分离牙髓组织,应用酶消化法获得牙髓细胞.单抗Stro-1标记、免疫磁珠阳性分选系统分选获得牙髓干细胞,第3代牙髓干细胞用成骨向诱导培养基向成骨细胞诱导分化.用碱性磷酸酶染色和Vo...     

体外培养狗骨髓基质细胞在牙根上生长的超微结构

目的：探讨体外培养的骨髓基质细胞及其与牙根复合后的生长特性，为牙周组织工程载体材料的选择提供实验依据。方法：分离纯化的狗骨髓基质细胞与牙根复合体外培养，分别在相差显微镜和扫描电镜下动态观察细胞及其与牙根复合生长的形态变化。结果：骨髓基质细胞在牙根上贴附生长、增殖良好，功能正常。结论：牙根与骨髓基质细胞具有良好的生物相容性，可能成为牙周组织工程的载体材料选择。     

山羊骨髓基质干细胞向成骨细胞诱导后成骨分化相关基因表达的变化

目的:研究山羊骨髓基质干细胞向成骨细胞诱导后成骨分化相关基因ALP、OCN、COL I mRNA表达水平的变化.方法:采用全骨髓培养法培养骨髓基质干细胞,使用成骨条件培养液体外诱导成骨细胞,通过细胞形态学观察、免疫组化染色、钙结节等检测手段进行成骨细胞鉴定,采用RT-PCR和实时定量PCR检测诱导2周后骨髓基质干细胞ALP、OCN、COL Ⅰ的表达水平,未诱导的骨髓基质干细胞作为对照组.结果:通过成骨细胞鉴定,骨髓基质干细胞成功诱导分化为成骨细胞:OCN和COL Ⅰ基因存细胞诱导组表达上调,ALP基因表达在诱导组和未诱导组间无显著差异.结论:成功诱导山羊BMSCs向成骨细胞分化,成骨分化相关基因在诱导后为适应成骨细胞的功能发生变化.     

牙本质支架体外诱导兔骨髓干细胞分化

目的：探讨将人牙本质作为组织工程支架的可行性,采用不同的方式处理牙本质片,观察牙本质片处理后诱导兔骨髓基质干细胞贴壁附着生长的规律及成骨分化潜能。方法：将兔的骨髓基质干细胞分别接种于经机械去除前期牙本质加EDTA-柠檬酸脱矿处理（A组）,标准根管预备-EDTA处理（B组）的牙本质片上,体外培养1周,扫描电镜观察细胞与牙本质片的附着情况,碱性磷酸酶、茜素红及Vonkossa染色观察兔骨髓基质干细胞成骨分化。结果：兔骨髓基质细胞附着在2种方式处理的牙本质片上生长良好,贴附紧密。B组牙本质片上细胞碱性磷酸酶表达阳性率高达80％,茜素红、Vonkossa染色观察到钙结节数量多于A组。结论：经标准根管预备一EDTA处理的人牙本质能有效促进骨髓基质干细胞增殖及成骨分化,可能成为一种理想的成骨生物支架,并为牙体牙髓疾病的治疗提供了新的思路。广西科学研究与技术开发计划项目（桂科攻1012400lA一42）     

黄芪多糖对犬骨髓基质干细胞增殖及超微结构的影响

目的探讨黄芪多糖（APS）对诱导培养的犬骨髓基质干细胞（BMSCs）增殖、分化成骨作用及超微结构的影响。方法用瑞氏- 姬姆萨染色、改良Gomori钙- 钴法、茜素红染色法检测BMSCs分化成骨的能力。用四唑盐（MTT）比色和酶动力学方法测定不同浓度和时间的APS对诱导培养的BMSCs增殖影响以及超微结构的改变。结果诱导条件下BMSCs具有成骨细胞活性,瑞氏- 姬姆萨染色呈深蓝色,改良Gomori钙- 钴法将细胞及矿化结节染成黑色,茜素红染色法见细胞及矿化结节成红色。第1、3天时,低浓度（0.005 mg/mL）APS可促进诱导培养的BMSCs增殖;而第5天时,高浓度（50 mg/mL）APS则明显抑制诱导培养的BMSCs增殖。第5天,透射电镜下,0.005 mg/mL APS组细胞线粒体、粗面内质网增多,细胞外基质分泌增加;50 mg/mL APS组细胞发生退变,粗面内质网和线粒体明显减少,且二者明显肿胀、变性、膜结构破坏。结论短期低浓度APS能促进诱导培养的BMSCs的代谢和蛋白质的合成,有利于细胞的增殖和向成骨分化。     

骨髓基质细胞及诱导后成骨细胞在钛合金表面粘附率的研究

目的研究小型猪的骨髓基质细胞(bone mesenchymal stem cell,BMSC)及其诱导后的成骨细胞在种植体钛合金(Ti-6Al-4V)表面的粘附情况.方法分离培养小型猪的骨髓基质细胞,并将其诱导为成骨细胞.分别将不同浓度的骨髓基质细胞及诱导后的成骨细胞悬液接种于种植材料表面,利用扫描电镜观察其粘附情况,计算不同接种浓度下两种细胞与种植材料的粘附率及粘附的细胞数.结果两种细胞在种植体表面粘附良好,接种浓度为3×105/100μl组两种细胞在种植材料表面的粘附细胞数量分别为17.6×106和18.6×106;粘附率分别84.2%和85.5%.两种细胞在钛合金表面的粘附率和粘附的细胞数与其余三组(1×105/100 μl;2×105/100μl;4×105/100μl)相比差异均有显著性.结论小型猪BMSC在体外可经条件培养液诱导为成骨细胞,接种浓度为3×105/100μl组骨髓基质细胞及成骨细胞在种植材料表面有良好的粘附能力.     

大白鼠骨髓间质干细胞体外培养体系的建立及分化研究

目的：建立大鼠骨髓间质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)体外培养体系，对大白鼠BMMSCs体外培养的条件，供体大白鼠鼠龄等进行了研究。对体外培养的大白鼠BMMSCs的形态学，增殖动力学，成骨的表面标记及体外钙化能力进行了系列研究，方法：取2月龄SD大鼠胫骨和股骨骨髓进行体外培养，取第二代BMMSCs,绘制生长曲线并计算群体倍增时间，对经成骨诱导剂诱导的BMMSCs的ALP表达及体外钙沉积进行了研究。结果：细胞呈长梭形或多角形，细胞表面有不规则的细胞突起，秀射电镜可见胞浆有大量的粗面内质网及线粒体，细胞表面可见突起，细胞生长曲线呈S形，群体倍增时间为72小时，经诱导分化的BMMSCs可见碱性磷酸酶的表达。von Kossa染色可见散在深染的钙沉积班块。结论：来源于年轻大鼠股骨骨髓的间质干细胞体外培养并经诱导后可分化为具有部分成骨特性的细胞，可以为体内骨组织工程提供组织细胞。     

神经生长因子对山羊骨髓间充质干细胞向成骨分化的调节作用

目的:研究神经生长因子(NGF)对山羊骨髓间充质干细胞(BMSCs)向成骨细胞分化的调节作用. 方法:体外培养山羊BMSCs,流式细胞仪鉴定表面标志物;将第3 代BMSCs分为空白对照组、成骨诱导对照组、NGF组和实验组,检测各组碱性磷酸酶(ALP)活性和骨钙素(OC)水平、应用von Kossa染色的方法比较各组细胞成骨性能. 结果:流式细胞术测得各组细胞均呈CD90、CD105强阳性表达,CD34、CD45阴性.实验组ALP和OC表达明显高于其它3 组,差异有显著性意义(P<0.05).成骨诱导对照组细胞von Kossa染色阳性,可见黑色钙化结节,实验组较成骨诱导对照组钙化结节数目明显增多,面积增大.而NGF组各项指标与空白对照组无明显差异.结论:单纯使用NGF并不能诱导山羊BMSCs向成骨细胞转化,但NGF对山羊BMSCs向成骨细胞分化过程具有明显的促进作用.     

人髁突来源骨髓间充质干细胞的分离与鉴定

目的探讨人髁突来源骨髓间充质干细胞（MSCs）分离、培养和鉴定方法以及多向分化能力．为骨组织工程提供种子细胞。方法取髁突良性肥大患者被切除的髁突。冲洗收集骨髓细胞．采用密度梯度离心和贴壁培养法进行培养和纯化MSCs．取生长良好的P3或P4代MSCs进行检测：（1）MTT法测定细胞增殖和生长曲线分析；（2）流式细胞仪检测MSCs细胞表面抗原标记和细胞增殖周期；（3）脂肪细胞、成骨细胞和神经细胞多向诱导分化及相关检测。结果（1）利用密度梯度离心和贴壁筛选的方法从人髁突分离MSCs．经传代后细胞形态呈梭形．成纤维细胞样．均匀一致；（2）MTT法测定细胞增殖和生长曲线分析结果显示MSCs在传代后经历游离期、贴壁期、潜伏期、对数生长期和平台期；（3）流式细胞仪检测结果显示所获得的MSCs纯度较高．细胞单一。CD44、CD29和CD55表面标记阳性率分别为100％、99．8％和86．6％，而CD34、CD45和CD106的阳性率仅为0．5％、2．9％和6．3％；（4）MSCs细胞周期检测结果为G0期和G1期91．9％、G2期2．4％和S期5．7％，说明大部分细胞仍处于静止期：（5）成脂诱导后细胞胞浆内可见脂滴，苏丹黑B、油红O染色均呈阳性；成骨诱导后，Vonkossa和茜素红染色均呈阳性：神经细胞诱导后，细胞由梭形变为有多个突起的神经元样细胞，甲苯胺蓝尼氏和GFAP免疫组化染色均为阳性。结论从人髁突骨髓中能分离出高度一致的MSCs，这些细胞具有多向分化能力．可作为骨组织工程的种子细胞。     

同期神经化增强髂骨瓣术后骨髓间充质干细胞的活性

目的： 比较神经化髂骨瓣和传统髂骨瓣重建下颌骨缺损术后,移植骨块骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs）的干细胞活性。方法： 游离血管化髂骨瓣移植修复下颌骨缺损术后半年,从移植骨骨髓体外分离、培养BMMSCs,通过集落形成观察、Brdu摄入实验、群体倍增时间、体外成骨茜素红染色法、裸鼠皮下成骨法检测BMMSCs增殖、自我更新及成骨分化能力。采用SPSS 24.0软件包对数据进行统计学分析。结果： 神经化髂骨移植术后分离、培养的BMMSCs的集落形成、增殖、群体倍增时间、体外及体内成骨分化能力均显著高于非神经化组（P<0.05）。结论： 神经化髂骨瓣重建下颌骨缺损可以增强BMMSCs的自我更新、增殖、成骨分化等潜能,有助于维持移植骨的术后内环境稳定,减少术后移植骨吸收。     

骨髓间充质干细胞与PLGA体外附着的实验研究

目的:研究骨髓间充质干细胞(BMSCs)在可降解骨基质材料聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)上的黏附、增殖和分化能力,为进一步体内回植提供研究基础。方法:等比混合聚乳酸(PLA)和聚乙醇酸(PGA) ,有机溶剂注模法制备PLGA。体外培养BMSCs ,复合PLGA ,通过扫描电镜观察BMSCs在PLGA上的黏附、增殖,以及在成骨诱导情况下细胞形态的变化。结果:合成的PLGA呈多孔状,孔隙率为85 % ,孔径为10 0～40 0 μm。BMSCs可在PL GA上黏附、增殖、分泌胞外基质,并可在成骨诱导剂的作用下分化为多角形的成骨样细胞。复合后14d ,BMSCs和胞外基质已将基质材料颗粒完全覆盖。结论:BMSCs能在PLGA上粘附、增殖,PLGA可作为BMSCs的载体和骨组织工程的支架材料。     

骨髓间充质干细胞分化能力及Notch通路活性的增龄性变化

目的： 在体外实验中初步探索骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）成骨、成脂分化能力及细胞活性的增龄性变化,以及在增龄过程中Notch信号通路活性的改变。方法： BMSCs取自年轻、成年及老年C57BL/6小鼠全骨髓,以流式细胞术鉴定细胞表面抗原,成骨、成脂诱导评价各组细胞的分化能力,细胞增殖、迁移实验检测各组细胞活性,实时荧光定量PCR（qPCR）检测Notch相关基因的表达。采用SPSS 19.0软件包对数据进行统计学分析。结果： 茜素红和油红O染色结果表明,BMSCs的成骨分化能力随着年龄增长而下降（P<0.05）,成脂分化能力随着年龄增长而提高（P<0.05）。细胞活性实验表明,细胞增殖能力和迁移能力未随着年龄增长而下降（P>0.05）。qPCR结果表明,老龄组BMSCs的Notch信号通路表达水平显著高于年轻组（P<0.05）。结论： 随着个体年龄增长,BMSCs呈现出成骨分化能力下降而成脂分化能力提高的现象,Notch信号通路活性呈现出增龄性升高,为恢复老龄BMSCs受损成骨分化能力提供了新的思路。     

自体骨髓间充质干细胞移植对小型猪下颌骨放射性骨坏死的预防作用

目的：观察和分析自体骨髓间充质干细胞（ bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs）静脉输注移植是否对小型猪下颌骨放射性骨坏死（ osteoradionecrosis,ORN）有预防作用。方法照射前1个月分离培养扩增BMMSCs,在照射后不同时点实验组进行自体BMMSCs静脉输注移植,对照组静脉输注同体积不含细胞的细胞培养液。照射2个月后拔除左侧下颌第一恒磨牙,通过肉眼、CT以及组织病理学观察小型猪动物模型下颌骨是否发生ORN。结果照射2个月拔牙创伤后,两组动物均出现了组织水肿、皮肤溃烂、骨质破坏等。5个月后实验组动物皮肤愈合,随后CT显示破坏骨质修复,组织病理学显示为接近正常的骨组织,而对照组动物下颌骨仍呈典型ORN表现。结论自体BMMSCs移植对下颌骨ORN有一定的预防作用,其预防机制尚有待进一步研究。     

成骨诱导的犬骨髓间充质干细胞复合Bio-Oss构建组织工程化骨的体外研究

目的以骨髓间充质干细胞(MSCs)为种子细胞,以Bio-Oss小牛无机骨颗粒为支架材料,构建MSCs-Bio-Oss组织工程化骨。探讨犬MSCs成骨活性及与Bio-Oss复合构建组织工程化骨的可行性。方法杂种犬MSCs体外分离、培养及成骨诱导分化;取成骨诱导后的MSCs,以106个细胞/ml种植于Bio-Oss无机骨颗粒,轻度负压静置孵育培养。应用倒置相差显微镜、扫描电镜观察其形态学变化,进行细胞表面因子CD44的免疫荧光标记、钙结节染色、ALP定性和定量检测,结果以SPSS12.0统计软件包进行统计学分析。结果MSCs形态较均一,排列紧密,呈纺锤形,CD44表面抗原阳性;诱导分化后,表现出明显的成骨细胞活性,钙结节的茜素红S染色阳性,ALP的Gomori法染色阳性,ALP活性定量检测实验组在诱导分化3、7、14d时,ALP含量分别为(3.307±0.217)U/g、(5.929±0.781)U/g和(9.739±0.547)U/g,与对照组的(0.442±0.087)U/g、(0.581±0.027)U/g和(0.768±0.126)U/g比较有显著差异(P<0.01);MSCs在Bio-Oss表面贴附紧密,生长良好,构建形成组织工程化骨。结论以成骨诱导的犬MSCs作为种子细胞,复合支架材料Bio-Oss构建组织工程化骨是可行的。