胶原-纤维蛋白混合凝胶对关节软骨细胞合成Ⅱ型胶原的影响

目的：以胶原蛋白和人血纤维蛋白混合物为载体在体外进行关节软骨细胞三维立体培养,构建人工软骨组织,研究载体对软骨细胞在其中的表达及合成Ⅱ型胶原的影响。方法：取2周龄的新生兔关节软骨,经消化,将获得的软骨细胞与牛Ⅰ型胶原、人血冻干纤维蛋白原、凝血酶按一定比例混合,制成软骨培养物并在体外培养。培养第3周时,取材进行Masson染色、Ⅱ型胶原寡核苷酸探针原位杂交和Ⅱ型胶原的免疫组化观察。 结果：体外培养3周,培养物内细胞大部分存活, Masson染色形成软骨陷窝,同源性细胞簇出现,细胞周围有蓝色物质环绕存在,原位杂交证实其软骨细胞表达Ⅱ型胶原mRNA,免疫组化证实软骨细胞分泌Ⅱ型胶原。 结论：用胶原蛋白和人血纤维蛋白为载体支架体外培养软骨细胞,可促进关节软骨细胞合成分泌Ⅱ型胶原,Ⅱ型胶原是软骨组织最主要的细胞外基质成分。     

自体软骨细胞立体培养修复兔关节软骨缺损的实验研究

目的探讨自体软骨细胞立体培养构建的组织工程软骨修复关节软骨的效果。方法24只4～6月龄新西兰大白兔进行标记,首先在股骨下端建立动物软骨3.5mm缺损模型,获取软骨细胞进行体外培养、扩增,3代后获取足够细胞数量,制成1×108/ml细胞悬液,植入细胞载体Ⅰ型胶原海绵培养,两周后移植到自体3.5mm的软骨缺损面上,分别1、2、3个月处死观察。结果软骨细胞与细胞载体Ⅰ型胶原海绵有良好组织相溶性,两者培养形成自体组织工程软骨能完成关节软骨缺损修复。第1个月修复组织初步具备纤维软骨特征,第2个月初步具备透明软骨特征,第3个月修复组织具备透明软骨的生物学特性。结论细胞载体Ⅰ型胶原海绵与软骨细胞体外培养形成的组织工程软骨,能完成关节软骨的修复,修复组织为透明软骨。     

软骨细胞与骨髓基质细胞共培养构建软骨的体内评价

目的探讨软骨细胞与骨髓基质细胞（BMSC）共培养体外构建复合物体内植入形成成熟软骨组织的可行性。方法体外培养扩增猪BMSC,经绿色荧光蛋白（EGFP）基因转染标记后,与猪关节软骨细胞按1：1比例混合,以5．0×10^7／ml的细胞终浓度接种于聚羟基乙酸／聚乳酸（PGA／PLA）材料支架作为共培养组,以相同终浓度的单纯软骨细胞和单纯BMSC分别接种PGA／PLA作为阳性对照组及阴性对照组。各组标本均于体外培养2周后植于裸鼠皮下,8周后取材,通过大体观察、激光共聚焦显微镜观察、糖胺聚糖含量测定、生物力学、组织学以及免疫组织化学等方法对新生软骨组织进行全面评价。结果各组细胞均与材料黏附良好。体内植入8周后,共培养组及阳性对照组标本基本保持植入前的大小和形状,外观类似软骨组织,组织学显示两组均有连续的软骨陷窝样结构形成,免疫组织化学显示有大量Ⅱ型胶原沉积。定量测定结果显示,共培养组的糖胺聚糖含量和弹性模量均达到软骨细胞构建软骨组织的80％以上。共聚焦显微镜观察可见EGFP标记细胞形成了软骨陷窝。阴性对照组标本的体积较植入前明显缩小,组织学及免疫组织化学均未见软骨样组织形成。结论软骨细胞与BMSC共培养构建的复合物植入体内后能继续形成成熟软骨组织,这表明植入体内后软骨细胞仍能保持对BMSC的诱导作用。     

体外家兔骺板软骨细胞和复合支架材料构建人工骺板软骨

目的：探讨采用复合支架材料构建人工骺板软骨的可行性。方法:分离获得骺板软骨细胞,加入0.3% Ⅰ型胶原酸性溶液、1 000 U·mL^-1凝血酶溶液及20 g·L^-1人血冻干纤维蛋白原混匀,成为胶冻样软骨组织培养物。定期取培养块固定,常规石蜡切片,行HE染色、甲苯胺蓝染色及免疫组化检查。结果：新制成的以胶原-纤维蛋白混合凝胶为支架材料的软骨细胞培养物呈浅粉红色胶冻样 ,细胞均匀分布于其中。培养3 d后悬浮物呈乳白色,透光度降低。逐渐缩小至直径约7 mm大小,硬度逐渐增加。HE染色见软骨细胞位于软骨陷窝内,软骨细胞培养物有一定层次感,但没有象骺板样排列成柱状。甲苯胺蓝染色显示胞体周围有丰富的软骨基质。免疫组织化学染色可见Ⅱ型胶原阳性细胞。结论：利用混合支架构建的人工骺板软骨在大小及可塑性等方面结果较满意。     

关节软骨损伤组织工程修复的实验研究

目的：（1）研究不同体外培养时间软骨的生物学特性，探讨运用于软骨组织工程中软骨种子细胞的最适宜培养时间和条件。（2）应用组织工程技术探讨运用自体关节软骨细胞修复关节软骨缺损的可行性。（3）应用组织工程技术探讨应用同种异体软骨细胞修复关节软骨缺损的可行性。（4）研究修复关节软骨缺损的软骨细胞来源。方法：（1）取新西兰兔关节软骨细胞体外培养，观察软骨细胞的形态学变化，生长曲线，酸性粘多糖及胶原分泌情况。（2）建立关节软骨缺损模型，应用自体关节软骨细胞复合生物支架Pluronic修复关节软骨缺损，观察修复效果。（3）应用同种异体软骨细胞复合生物支架Pluronic修复关节软骨缺损，观察修复效果。（4）应用3H－TdR放射自显影方法，确定修复关节软骨缺损的细胞来源。结果：（1）体外培养第四代软骨细胞的增殖能力达到高峰，而第二代软骨细胞分泌基质能力最强。（2）自体或同种异体软骨细胞复合Pluronic修复关节软骨缺损，12周后缺损表面较平滑，与正常软骨界面愈合较好，MASSON三色染色显示胶原分布已较均匀， 骨细胞呈柱状排列，II型胶原在细胞周围阳性表达，而空白对照和材料对照组未见明显修复。（3）3H－TdR放射自显影方法证实修复软骨组织的细胞来源于体外移植细胞，软骨细胞植入体内早期仍进行有丝分裂，而在中后期软骨细胞以分泌基质为主，植入的细胞与周围软骨细胞间存在物质交换。结论：（1）软骨细胞在体外培养2－3周左右是作为软骨组织工程种子细胞的最佳时机。（2）自体或同种异体组织工程化软骨是修复关节软骨缺损的较好方法。（3）组织工程化软骨修复关节软骨缺损的细胞来源于体外移植的软骨细胞。     

间充质干细胞在构建组织工程软骨中的实验研究

目的探索利用几丁质支架和间充质干细胞(MSC)构建组织工程软骨。方法抽取兔股骨骨髓,密度梯度离心分离骨髓MSC,用转化生长因子β(1TGF-β1)诱导第3代的骨髓MSC向软骨方向分化,2周后用免疫组化检测Ⅱ型胶原表达情况。将分化后的软骨样细胞传代,接种在几丁质支架上,用含TGF-β1的培养基继续培养2周,再用免疫组化检测Ⅱ型胶原表达情况,并在电镜下观察软骨细胞的生长情况。结果骨髓MSC经TGF-β1诱导后,具有软骨细胞特点,接种在几丁质支架上继续培养2周,这些细胞在支架上生长良好,并仍能很好表达Ⅱ型胶原。结论MSC经TGF-β1诱导,分化成的软骨样细胞在几丁质支架上表型稳定,生长良好。     

利用PLGA细胞支架再生人关节软骨的实验研究

目的：研究人关节软骨细胞在PLCA三维支架上的贴附和生长情况，利用组织工程技术培养工程化关节软骨。方法：制作PLGA三维细胞支架。分离培养成人关节软骨细胞，体外扩增后种植到PLGA支架中。在体外和裸鼠体内分别培养软骨细胞一支架复合物，分期终止培养，进行组织学染色、扫描电镜、Ⅱ型胶原免疫组织化学及cDNA探针原位杂交检测。结果：体外培养发现，软骨细胞支架材料内贴附生长良好，长期培养仍保持软骨细胞特性，棵鼠体内培养8周后可形成软骨样组织。结论：PLGA三维支架适合软骨细胞贴附生长和分泌软骨外基质，可作为软骨组织工程的细胞载体。利用组织工程的方法可获得适于移植的工程化关节软骨。     

微球化骺板细胞构建兔异位骺软骨实验

目的探讨海藻酸钙-多聚赖氨酸微球复合骺板细胞,在兔体内异位构建组织工程化骺软骨的可行性。方法将兔异体骺板软骨细胞接种于海藻酸钙-赖氨酸凝胶微球中,体外培养后植入兔背部皮下,分别于2、4、8周取材进行大体及组织学观察。结果体外培养时微球中骺板细胞生长、增殖情况良好;移植皮下后第4周取材可见外形呈类骺软骨样组织块,行HE、甲苯胺蓝、番红“O”及Ⅱ型胶原等染色,镜下观察可见大量软骨细胞及类软骨陷窝样结构,植入的海藻酸钙微球周围组织无明显炎症反应。结论海藻酸钙-赖氨酸具有良好的组织相容性,复合异体骺板细胞形成微球,植入同种异体动物体内可以构建类骺软骨样组织。     

软骨细胞与壳聚糖复合物体内构建软骨组织的研究

目的探讨利用软骨细胞和新型生物材料壳聚糖动物体内构建软骨组织的可行性。方法体外分离培养猪耳软骨细胞,扩增后以5.0×107/ml的终浓度接种于壳聚糖支架并植入猪皮下。标本于8周后取材,行大体观察、组织学及免疫组织化学等相关检测。结果细胞-生物材料复合物在植入猪皮下8周后形成了单一成熟的软骨组织,并保持了支架材料的大小和形状,免疫组织化学染色结果表明其大量表达软骨特异性细胞外基质Ⅱ型胶原。结论壳聚糖是一种良好的生物材料,能够提供软骨细胞生长的三维环境并用于体内构建软骨组织。     

兔半月板纤维软骨组织缺损的体外修复实验

目的：探讨体外培养条件下半月板组织的修复能力。方法：将纤维蛋白填入兔半月板纤维软骨组织缺损区，体外条件下培养１，２，３，４，８周，组织学及电镜观察纤维软骨细胞在纤维蛋白支架结构中的生长情况。结果：培养１～４周纤维软骨细胞能逐渐长入纤维蛋白支架结构，４至８周发现纤维软骨细胞在其中的生长呈现相对停滞趋势。结论：纤维软骨细胞具备再生修复能力，能够启动半月板组织的修复。     

组织工程化软骨对兔膝关节全层软骨缺损的修复效果

目的 观察同种异体软骨细胞复合人胎盘Ⅰ型胶原蛋白海绵对兔膝关节股骨髁间窝全层软骨缺损的修复效果.方法取2周龄新西兰兔软骨细胞体外培养传代,选择生长状态相对较好的第2代细胞作为种子细胞,并与人胎盘Ⅰ型胶原蛋白海绵复合.取雄性8月龄新西兰兔54只,制作股骨髁间窝全层软骨缺损模型,随机分为3组：分别为对照组、种子细胞组及种子细胞＋支架材料组.后两组分别植入相应成分.于术后12周、24周、36周分别取其膝关节,观察修复效果. 结果 术后12周种子细胞组缺损区可见少量白色半透明组织覆盖,组织结构粗糙,可见多数针尖样结构;复合支架材料组表面相对光滑,亦可见半透明白色组织形成.24周,种子细胞组缺损区可见较多白色组织形成,透明度较前降低,呈半软骨半纤维样组织;复合支架材料组修复明显较种子细胞组快,表面光滑,呈半透明状覆盖于缺损区,与周围组织有较好吻合,但仍未完全修复软骨缺损.36周,种子细胞组可见更多白色组织覆盖,透明度较前更低;复合支架材料组则修复完好,高度基本与周围组织平齐,呈半透明样软骨组织.空白对照组随着时间的推移,呈现不同程度的纤维组织样修复. 结论 关节软骨自身修复能力有限,只能实现纤维样修复;软骨细胞可部分修复关节软骨缺损,但随着修复时间的推移,逐渐去分化而出现纤维样改变;而软骨细胞复合Ⅰ型胶原蛋白海绵则可以较好地修复关节软骨缺损,且随着时间的延长,关节软骨可基本实现完全修复.     

透明质酸凝胶中肌源性干细胞与透明软骨联合培养的实验研究

 摘　要：目的 探讨肌源性干细胞与软骨细胞混和培养体外成软骨的可行性。方法 分离培养、扩增传代兔MDSCs及关节软骨细胞,二者按一定比例混和,6×1010/L密度接种于5%浓度的透明质酸凝胶为共培养组,以相同密度的单纯MDSCs和单纯软骨细胞作为阴性与阳性对照。倒置相差显微镜下观察,10d后行甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫细胞化学检测,RT-PCR检测Ⅱ型胶原和aggrecan的mRNA表达。结果 5d后镜下见共培养组MDSCs形态由梭形向多边多角形转化,10d后细胞甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学检测与阳性对照组相同,RT-PCR检测Ⅱ型胶原和aggrecan mRNA呈阳性表达。阴性对照组在体外培养过程中未分化为软骨细胞. 结论:软骨微环境在MDSCs成软骨分化过程中具有重要作用,软骨细胞能有效地诱导MDSCs向软骨样细胞分化,透明质酸凝胶可以作为软骨组织工程的良好载体。     

胶原凝胶包埋软骨细胞接种骨胶原基质支架体外构建组织工程软骨

目的探讨复合应用胶原凝胶和骨胶原基质（BCM）支架作为软骨细胞载体体外构建组织工程软骨的有效性和可行性.方法将胶原凝胶包埋的软骨细胞接种BCM支架并在体外培养,应用倒置相差显微镜和扫描电镜观察软骨细胞的粘附、生长和增殖情况,培养14d,行HE、TB（甲苯胺蓝）染色观察软骨组织形成情况.结果软骨细胞在支架上粘附、生长和增殖良好,体外培养14d能形成较成熟的软骨组织.结论胶原凝胶复合BCM支架可作为软骨细胞的载体体外构建组织工程软骨.     

新型乳酸 羟基乙酸共聚物(PLGA)/胶原复合材料用于软骨再生的体外研究

 目的 设计和制备新型乳酸 羟基乙酸共聚物［poly(lactic co glycolic acid),PLGA］/胶原(collagen)复合材料,研究其在体外对软骨再生的促进作用,为软骨组织工程提供新型支架材料。方法 利用冷冻干燥技术将胶原多孔海绵复合于PLGA编织网膜;扫描电镜观察材料表面微观结构,利用图像软件统计孔径大小;分离与培养牛膝关节软骨细胞(bovine articular chondrocyte, BAC),接种于PLGA/胶原材料,检测细胞接种效率,扫描电镜观察细胞在材料内部生长情况;体外培养1周后检测DNA和糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)含量,real time PCR检测I型胶原、Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖(aggrecan) mRNA表达强度。牛膝关节软骨组织和体外单层培养的BACs做对照。结果 成功构建新型PLGA/胶原复合材料,表面孔径为(136.4±11.8) μm;细胞接种效率为87.8%±1.6%;BACs在材料表面和中心生长活跃,培养1周后的DNA、GAG含量, Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA表达强度均显著高于对照组(P<0.05)。结论 新设计制备的PLGA/胶原复合材料能促进体外软骨再生,可作为支架材料用于软骨组织工程研究。     

两种自制支架材料对体外培养关节软骨细胞生长与代谢的影响

目的 评定两种自制支架材料DL－聚乳酸支架，聚磷酸钙纤维对体外培养关节软骨细胞生长与代谢的影响。方法 采用材料样品与体外单层培养关节软骨细胞直接接触法，并对其进行倒置显微镜观察，培养细胞计数与DAN含量及其细胞外基质^35S掺入量和羟脯氨酸含量测定。结果 两种支架材料可与培养关节软骨细胞完全相容，无关节软骨细胞毒性；对培养关节软骨细胞的DNA，蛋白多糖及胶原合成无异常影响。结论 两种支架材料具有良好的关节软骨细胞相容性，对其功能物质的合成无异常影响，经其结构与性能优化，即可满足关节软骨组织工程制备的各项要求。     

关节软骨细胞体外培养及生物学特性的实验研究

目的:探讨关节软骨细胞培养方法及其生物学特征。方法:从4周龄新西兰乳兔关节分离静置培养软骨细胞,倒置显微镜下观察原代及传代细胞形态变化,并计数绘制生长曲线。用番红-O,甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学法观察蛋白多糖,碱性糖胺聚糖(GAGs),Ⅱ型胶原的分泌情况,用PCR鉴定Ⅱ型胶原,Aggrecan基因的表达。结果:成功建立兔关节软骨细胞体外培养实验方法。形态学及免疫化学染色显示体外培养3代以内的软骨细胞可保持表型稳定而3代后软骨细胞呈现增殖缓慢及衰老现象。结论:本实验建立的体外培养关节软骨细胞方法简单可行,3代内的兔软骨细胞表型稳定且生物学活性较高,具备可用于实验研究的能力。     

组织工程修复关节软骨缺损的实验研究

目的　用组织工程的方法 ,将新生关节软骨细胞先在高分子聚乳酸材料上进行体外培养 ,然后移植于关节软骨缺损处 ,以达到修复关节软骨缺损的目的。方法　取新生新西兰兔关节软骨细胞培养于高分子聚乳酸材料支架上。将 16只兔的 32个膝关节股骨髁处人工造成一 4m m× 6 m m大小缺损 ,并随机分为二组。 组 10只兔 ,2 0个关节缺损 ,用软骨细胞 -高分子聚乳酸移植修复。 组 6只兔 ,左膝用软骨细胞 -高分子聚乳酸移植体修复 ,表面覆盖单层软骨细胞 ;右膝仅用高分子聚乳酸材料修复。术后分别于 4、8、12、2 4周取标本进行大体、光镜、组织化学的方法进行结果评估。结果　用软骨细胞 -高分子聚乳酸移植体能修复关节软骨缺损 ,且为透明软骨。新生软骨组织胶原定型为 型胶原。结论　用软骨细胞 -高分子聚乳酸移植体移植 ,关节软骨缺损能获得透明软骨修复     

壳聚糖-明胶多孔复合支架构建自体组织工程化软骨组织的实验研究

目的探讨壳聚糖一明胶多孔复合支架作为软骨组织工程支架的可行性。方法消化分离猪耳廓软骨细胞,接种于自制壳聚糖一明胶多孔复合支架上培养1周,将细胞一生物支架复合物种植于猪自体腹外侧壁皮下,第10、16周取材,分别从大体、组织学、Ⅱ型胶原免疫组化和生物化学对再生软骨组织进行评价。结果HE染色见10周时有软骨组织形成,所形成的软骨组织见软骨细胞均匀分布,包埋在软骨陷窝内,还可见未降解的支架材料。16周时软骨组织完成成熟,软骨细胞包埋在软骨陷窝内,支架材料完全降解,结构与正常软骨组织相似。Masson’s trichrome染色见所形成的软骨组织间质中都有被染成绿色的胶原分布。Vehoeff染色见16周时形成的软骨间质内含大量被染成蓝黑色弹性纤维。免疫组化证实形成的软骨组织有Ⅱ型胶原分布,生物化学证实所形成的软骨组织的蛋白聚糖含量与正常猪耳软骨的含量接近。结论利用自制壳聚糖一明胶多孔复合支架上可在具有免疫功能的自体动物内形成软骨组织,但形成的软骨不充分,壳聚糖一明胶多孔复合支架有以作为软骨组织工程支架的应用前景。