慢病毒载体的构建及低表达和过表达CEA EC9706细胞株的建立

目的:构建人癌胚抗原(CEA)慢病毒siRNA和表达载体并包装成感染性病毒颗粒,获得稳定低表达和过表达CEA的EC9706细胞.方法:构建CEA siRNA载体:依据siRNA靶序列设计原则,针对人CEA的cDNA序列,设计并合成编码siRNA的3对寡核苷酸序列,克隆入siRNA载体(pRNAT-U6.2/Lenti)中构建3个重组体pRNAT-U6.2-SCEA.构建CEA表达载体:以人CEA的测序质粒为模板,PCR扩增CEA全长,装入pLentiGFP转移质粒,经过测序证实其序列与标准序列完全一致.然后进行重组慢病毒分剐感染EC9706细胞,G418筛选得到稳定感染细胞株.分别用荧光定量Real-time RT-PCR和Western blot检测EC9706细胞中CEA基因表达抑制或增强的效果.结果:EC9706病毒感染48 h后荧光显微镜观察CEA慢病毒载体在细胞中高效表达.经过RTPCR和Western-blot验证:得到3株稳定CEA低表达的EC9706细胞株,其中一个CEA的表达几乎得到完全抑制,1株稳定CEA过表达的EC9706细胞株(EC9706-CEA).结论:建立了稳定低表达和过表达CEA的EC9706细胞株,成功调控食管癌EC9706细胞中CEA的表达,为进一步从分子水平探讨CEA的功能奠定了基础.     

同时沉默Livin基因和MTA1基因的siRNA载体的构建

目的:构建同时沉默Livin基因和MTA1基因的小干扰RNA(siRNA)载体.方法:设计Livin和MTA1的siRNA靶序列,合成它们互补的寡核苷酸链,分别退火后重组入pRNAT-U6.2载体,得到pRNAT-U6.2-Livin和pRNAT-U6.2-MTA1.AccⅡ和XhoⅠ酶切pRNAT-U6.2-MTA1,回收475 bp的MTA1 siRNA单元,然后与XhoⅠ和PmeⅠ酶切线形化的pRNAT-U6.2-Livin重组,得到pRNAT-U6.2-Livin-MTA1,后者用脂质体包被转染人食管癌细胞EC9706,采用RT-PCR法分别检测转染细胞Livin和MTA1基因mRNA的表达情况.结果:针对Livin基因和MTA1基因的siRNA的双链寡核苷酸片段分别克隆入pRNAT-U6.2载体,经测序分析插入片段正确.PCR扩增证实MTA1 siRNA单元重组入pRNAT-U6.2-Livin.RT-PCR检测显示,转染pRNAT-U6.2-Livin-MTA1的EC9706细胞Livin基因和MTA1基因mRNA表达水平皆明显降低.结论:同时沉默Livin基因和MTA1基因表达的siRNA载体构建成功.     

针对MTA1基因siRNA载体构建和沉默效应

目的 构建针对人MTA1基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体,观察RNA干扰对食管癌细胞MTA1基因表达的抑制作用.方法 设计MTA1的siRNA靶序列,分别合成两条互补的寡核苷酸链,退火后重组入pRNAT-U6.2载体,转化扩增后进行序列测定.用脂质体包裹转染人食管癌细胞EC9706,采用RT-PCR和Western blotting分别检测MTA1基因mRNA和蛋白表达的变化.结果 把针对MTA1基因的siRNA的双链寡核苷酸片段克隆入pRNAT-U6.2载体,经测序分析,插入片段正确;RT-PCR和Western blotting检测显示,MTA1基因的表达水平明显降低,其中以481-499(GACCCT GCTGGCAGATAAA)为靶序列的siRNA沉默作用最强,MTA1蛋白几乎完全不表达.结论 成功构建出沉默食管癌细胞MTA1基因表达的siRNA载体,为通过沉默MTA1基因的表达来减少恶性肿瘤侵袭转移提供了实验基础.     

核干细胞因子基因siRNA表达载体的构建及鉴定

目的 构建针对核干细胞因子(NS)基因的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体.方法 根据GenBartk提供的NS基因AY825265 mRNA序列及siRNA设计原则设计siRNA,筛选得到126-144 nt,199-217 nt和487-505 nt 3个19 bp片段为靶序列;合成带有BamHI、XhoI酶切位点的发夹结构寡核苷酸序列,经过退火,将此序列克隆至载体pRNAT-U6.1中构建重组表达载体;转化DH5α,提取质粒,应用PCR技术和测序方法鉴定重组克隆.转染入食管癌EC9706细胞,检测NS基因沉默情况.结果 PCR筛选得到3个目的片段的阳性重组克隆,测序证实重组表达载体中插入序列与设计一致.RT-PCR和Western blot检测显示构建的siRNA表达载体可显著降低EC9706细胞中NS mRNA和蛋白水平的表达.结论 成功构建出一组针对NS基因的siRNA表达载体,为下一步NS基因的RNA干扰研究鉴定了基础.     

Survivin基因siRNA表达载体的构建及其在食管癌EC109细胞中的表达

目的 为研究survivin基因的功能及食管癌的基因治疗，构建针对survivin基因的siRNA的表达载体，转染细胞EC109后观察其对survivin基因表达的抑制作用。方法 利用网站选择适当位点设计并合成针对survivin基因mRNA的寡核苷酸序列，插入质粒pBAsi-hU6中形成重组载体pBAsi-survivin。重组载体经测序鉴定后转染食管癌细胞EC109，western blot检测转柒前后survivin蛋白的表达情况。结果 测序结果与所合成的寡核苷酸完全一致，证实成功构建了针对survivin基因的siRNA表达载体。Western blot检测显示转染食管癌细胞EC109后有效抑制了survivin基因的表达。结论 针对surivivin基因的siRNA表达载体成功构建，并能有效抑制食管癌细胞EC109中survivin基因的表达。     

Survivin基因siFNA表达载体的构建及其在食管癌EC109细胞中的表达

目的为研究survivin基因的功能及食管癌的基因治疗,构建针对survivin基因的siRNA的表达载体,转染细胞EC109后观察其对survivm基因表达的抑制作用.方法利用网站选择适当位点设计并合成针对survivin基因nRNA的寡核苷酸序列,插入质粒pBAsi-hU6中形成重组载体pBAsi-survlvin.重组载体经测序鉴定后转染食管癌细胞EC109,western blot检测转染前后survivin蛋白的表达情况.结果测序结果与所合成的寡核苷酸完全一致,证实成功构建了针对sLurvivin基因的siRNA表达载体.Westem blot检测显示转染食管癌细胞EC109后有效抑制了survivin基因的表达.结论针对surivivin基因的siRNA表达载体成功构建,并能有效抑制食管癌细胞EC109中survivin基因的表达.     

针对人免疫缺陷病毒1型辅助受体CCR5 RNA干扰表达载体的构建

目的:抑制细胞表面人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的辅助受体CCR5表达, 阻止HIV-1进入靶细胞.方法:设计CCR5靶向的发夹状siRNA,合成2条互补的寡核苷酸链,退火后重组入pRNAT-U6.2载体,转化扩增后进行序列测定.用脂质体包裹pRNAT-U6.2-siCCR5后转染U937细胞,采用RT-PCR和流式细胞术分别检测CCR5基因mRNA和蛋白表达的变化.结果:重组子pRNAT-U6.2-siCCR5,经过测序鉴定与设计一致.RT-PCR检测显示, 转染pRNAT-U6.2-siCCR5细胞的CCR5基因表达水平显著降低于未转染对照组和转染空载体细胞(P<0.05).未转染对照组U937细胞表面CCR5的表达率为(83.10±6.52)%, 转染空载体组为(81.44±4.97)%,转染pRNAT-U6.2-siCCR5组为(1.94±0.06)%,3组间差异有统计学意义(P<0.05).结论:成功构建出沉默细胞CCR5基因表达的siRNA载体.     

肝素酶特异性RNAi对人食管癌EC9706细胞肝素酶基因表达的影响

目的:探讨RNAi技术对人食管癌EC9706细胞肝素酶(heparanase,Hpa)基因表达的影响.方法:针对Hpa不同基因位点设计合成寡核苷酸,然后转录为小分子干扰RNA(siRNA),分别用浓度为10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L的siRNA经LipofectamineTM 2000脂质体介导转染EC9706细胞72 h,同时设无关序列组及不转染组.采用完整细胞原位杂交技术观察各组EC9706细胞中Hpa基因的表达.结果:siRNA可有效抑制人食管癌EC9706细胞Hpa基因的表达,以15 μmol/L的siRNA作用效应最强,但不同浓度siRNA两两相比,差异均无统计学意义(P＞0.05),不同浓度siRNA对Hpa基因表达的抑制效应均显著强于无关序列组及不转染组(P＜0.05).结论:RNAi技术可有效抑制人食管癌EC9706细胞Hpa基因的表达.     

小分子干扰RNA对EC9706细胞中血管内皮生长因子C表达的影响

目的:观察小分子干扰RNA(siRNA)对人食管癌EC9706细胞中血管内皮生长因子C(VEGF-C)表达的抑制作用.方法:根据VEGF-C cDNA已知序列,设计并体外转录合成3条siRNA,将它们分别导入载体质粒中,用脂质体介导分别转染EC9706细胞,以无关序列转染和正常EC9706细胞为对照.采用免疫细胞化学SP法、半定量RT-PCR和原位杂交技术分别检测上述各组细胞中VEGF-C蛋白和mRNA的表达.结果:正常细胞对照组和无关序列转染组均有大量VEGF-C蛋白阳性颗粒和mRNA阳性条带,而在siRNA转染的3组中,仅有少量VEGF-C阳性表达颗粒和较弱的mRNA阳性条带,与正常细胞对照组和无关序列转染组相比,差异均有统计学意义(P＜0.01).结论:VEGF-C siRNA能有效抑制食管癌EC9706细胞中VEGF-C的表达,可望成为一种抗淋巴管生成的新方法.     

人血管内皮生长因子mRNA靶向siRNA表达载体的构建和表达

目的:构建人血管内皮生长因子(VEGF)mRNA靶向siRNA表达载体,观察其表达情况.方法:设计人VEGF靶向的发夹样siRNA,依据设计,合成2条互补的寡核苷酸链,退火后连接入pSUPERneo-GFP载体,转化扩增后得到重组载体pSUPERneo-GFP-siVEGF,进行序列测定.用脂质体转染法将重组载体转染食管癌细胞株Eca109,采用RT-PCR检测转染细胞VEGF mRNA的表达水平. 结果:经过酶切鉴定与测序,pSUPERneo-GFP-siVEGF构建成功.稳定转染该重组体的Eca109细胞VEGF mRNA表达水平明显降低.结论:成功构建了针对VEGF mRNA的siRNA载体, 转染细胞后可显著抑制VEGF mRNA的表达.     

CEA真核表达载体的瞬时表达及检测

目的:检测含癌胚抗原(CEA)的真核表达质粒pWACEA在体外的瞬时表达。方法:用脂质体包裹含CEA的真核表达质粒pWACEA转染MCF7细胞,采用原位杂交和免疫组化技术检测CEA的表达。结果:转染细胞原位杂交和免疫组化均为阳性;对照标本未见阳性信号。结论:真核表达质粒pWACEA在体外可表达CEA分子,为进一步建立CEA阳性动物肿瘤细胞模型及研究CEA阳性肿瘤的免疫防治提供了基础。     

癌胚抗原慢病毒表达载体的制备及鉴定

目的:构建人癌胚抗原(CEA)慢病毒表达载体,以期在哺乳动物细胞中高效、稳定表达。方法:提取CEA阳性的人结肠癌组织总RNA,逆转录获得cDNA序列,CEA全基因引物进行PCR扩增,对所扩增出的大小约2100bp的基因片段胶回收纯化,与pGEM-T Easy载体连接得到重组质粒pGEM-T-CEA。分别用XhoL和HindⅢ双酶切重组质粒pGEM-T-CEA和慢病毒载体pLentiGFP,将双粘CEA片段与羟化后的双粘线形载体pLentiGFP连接得重组载体pLentiGFP-CEA。pLentiGFP-CEA与慢病毒辅助包装载体pΔ8.2和pVSVG共转染293FT细胞,Western Blot验证CEA在转染293FT细胞中表达,72h后收集病毒上清。结果:通过PCR扩增获得了CEA基因,将CEA正向克隆到慢病毒转移质粒pLentiGFP中,并在293FT细胞中包装产生慢病毒颗粒。结论:成功构建了CEA慢病毒表达载体,为进一步从分子水平探讨CEA功能奠定了基础。     

子宫内膜癌组织学类型与CEA、c-erbB-2表达

目的：观察子宫内膜癌的组织学类型与ＣＥＡ、ｃ－ｅｒｂＢ－２表达,探讨其组织学发生。方法：光镜观察组织学形态并进行分型,应用免疫组化Ｓ－Ｐ法,对９４例子宫内膜癌进行单克隆抗体ＣＥＡ和ｃ－ｅｒｂＢ－２检测。结果：子宫内膜样癌６１例（６４．８％）,腺棘癌６例（６．３％）,腺鳞癌８例（８．４％）,浆液性乳头状腺癌７例（７．４％）,粘液性癌５例（５．３％）,小细胞癌４例（４．２％）,透明细胞癌和鳞癌各１例（     

HERG1基因在大肠癌表达的敏感性与特异性

目的:比较HERG1(human ether-a-go-go-related gene)钾通道及CEA在大肠癌组织中的表达水平,为大肠癌早期诊断和治疗提供更有特异性和敏感性的生物学标志和分子治疗靶点。方法:利用免疫组化方法检测55例大肠癌标本中的HERG1蛋白及CEA蛋白表达水平,以25例大肠息肉标本作为对照组。结果:HERG1在大肠癌标本中表达的敏感度为100%,特异度为92.0%,而CEA大肠癌标本中表达的敏感度为87.3%,特异度为28.0%。结论:HERG1在原发性大肠癌组织中表达的敏感度与特异度均高于CEA(P<0.05),HERG1可能成为一个高度敏感的大肠癌标志物和基因治疗新靶点。     

人乳头瘤病毒16 L1/CFA CTL表位融合蛋白的原核表达研究

目的:构建人乳头瘤病毒(HPv)16型衣壳蛋白L1与癌胚抗原(CEA)细胞毒T细胞(CTL)表位嵌合基因,探讨其在原核表达系统中的表达情况.方法:选择CEA CTL表位(CEA691 IMIGVLVGV),以HPVl6阳性宫颈癌组织提取的DNA为模板,通过PCR方法扩增出HPVl6 LI/CEA CTL表位嵌合基因,克隆入pET32a( )表达载体,转化大肠杆茵BL21(DE3),经IPTG诱导表达融合蛋白,通过Ni-NAT离子交换柱层析纯化,进一步采用SDS.PAGE和Western-blot分析鉴定.结果:pET32a( )/HPVl6 L1/cEA CTL表位重组质粒构建成功,并在大肠杆菌中得到表达.SDS·PAGE分析表明表达产物分子质量(Mr)约为83 X 10.,与预期相符,Western-blot方法进一步证实其为目的蛋白.结论:利用pET32a( )表达载体能表达HPVl6 L1/cEA CTL表位重组蛋白,为其进一步的免疫效应研究打下了基础.     

人乳头瘤病毒16 L1/CEA CTL表位融合蛋白的原核表达研究

目的:构建人乳头瘤病毒(HPV)16型衣壳蛋白L1与癌胚抗原(CEA)细胞毒T细胞(CTL)表位嵌合基因,探讨其在原核表达系统中的表达情况。方法:选择CEA CTL表位(CEA691 IMIGVLVGV),以HPV16阳性宫颈癌组织提取的DNA为模板,通过PCR方法扩增出HPV16 L1/CEA CTL表位嵌合基因,克隆入pET32a( )表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达融合蛋白,通过Ni-NAT离子交换柱层析纯化,进一步采用SDS-PAGE和Western-blot分析鉴定。结果:pET32a( )/HPV16 L1/CEA CTL表位重组质粒构建成功,并在大肠杆菌中得到表达。SDS-PAGE分析表明表达产物分子质量(Mr)约为83×103,与预期相符,Western-blot方法进一步证实其为目的蛋白。结论:利用pET32a( )表达载体能表达HPV16 L1/CEA CTL表位重组蛋白,为其进一步的免疫效应研究打下了基础。     

乳腺癌患者外周血CEA mRNA的表达

目的　检测乳腺癌患者外周血CEAmRNA的表达 ,建立取材于外周血早期诊断乳腺癌转移的方法。方法　用巢式RT -PCR检测乳腺癌患者和乳腺良性肿瘤患者的外周血中CEAmRNA的表达。结果　 5 6例乳腺癌患者CEAmRNA有 2 1例表达 ,阳性率为 3 7.5 0 % ;42例乳腺良性疾病者CEAmRNA没有一例表达。两组有高度显著性差异 (χ2 =2 0 .0 4 ,P <0 .0 1 )　结论　巢式RT -PCR检测CEAmRNA阳性结果提示其具有形成转移的倾向 ,并可作为判断预后的辅助参考指标     

应用流式细胞术检测10种细胞株癌胚抗原表达的比较分析

目的为了解10种细胞株的癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)表达,以便选择合适的靶细胞用于进一步研究。方法用抗CEA全人单克隆抗体C2-45(IgG1)以流式细胞术检测分析了10种细胞株。结果MKN-45、CHO-CEA、QGP-1和KATOⅢ为CEA阳性表达的细胞株,KNS-62和Hela-CEA为CEA表达稍弱的细胞株,HT-29和CaCO2为CEA微量表达的细胞株,CHO-MK1和MKN-74为CEA不表达的细胞株。大部分细胞株的CEA表达结果与文献报告基本一致,部分细胞株的CEA表达与文献不尽相同。结论CEA表达特性的改变有可能影响细胞株体外生物学行为从而导致实验结果的偏差,本实验结果可作为肿瘤细胞免疫研究重要的参考指标。     

乳腺癌患者D-双功能蛋白表达与肿瘤标志物CEA和CA153关系的临床研究

目的探讨乳腺癌组织中D-双功能蛋白(DBP)表达及其与血清肿瘤标志物CEA、CA153水平的相关性,及对乳腺癌诊断和治疗的临床意义。方法选取2012年1月-2015年12月唐山市妇幼保健院住院的20例乳腺癌切除术患者作为试验组,同期20例健康体检的正常者作为健康对照组,应用化学发光法检查血清肿瘤标志物CEA和CA153的表达水平,免疫组织化学法检测乳腺癌组织和癌旁组织DBP的表达水平,分析比较其差异、相关性。结果试验组血清肿瘤标志物CEA、CA153水平均显著高于正常对照组,差异均有统计学意义(t=39. 22、42. 87, P均<0.01),乳腺癌组织中DBP表达水平高于癌旁组织,乳腺癌组织DBP的灰度值为(96.3±11.4),癌旁组织为(29. 8±5.7),差异具有统计学意义(t=2.301,P<0.05)。试验组患者中,DBP的表达与血清CEA和CA153水平均呈正相关(r=0.800,P<0.01;r=0.709,P<0.01)。结论 DBP表达在乳腺癌的发展进程中具有重要的意义,并为乳腺癌的诊疗提供了一个新的研究靶点。     

TGF-β1和CEA在大肠癌组织中的表达及其意义

目的检测癌胚抗原(CEA)和转化生长因子β1(TGF-β1)在大肠癌组织中的表达,结合临床病理资料探讨其相关意义.方法应用免疫组织化学方法检测大肠癌、大肠腺瘤、癌近旁粘膜及正常粘膜中CEA、TGF-β1表达情况.结果CEA、TGF-β1在大肠癌中的阳性表达率分别为74.19%和69.35%,明显高于两者在大肠腺瘤、正常粘膜中的表达(P＜0.05, P＜0.01),同时癌近旁粘膜中两者的表达高于正常粘膜(P＜0.05);CEA和TGF-β1在大肠癌各组间表达无统计学差异;Dukes A+B期中两者的表达低于Dukes C+D期(P＜0.05);两者在大肠癌中的表达有相关性(P＜0.01).结论大肠癌能同时分泌CEA、TGF-β1,两者的过度表达与大肠癌发生、发展、Dukes分期、癌组织浸润、转移范围有关;CEA、TGF-β1在大肠癌各组间表达无明显差异;少部分大肠癌近旁粘膜已偏离正常细胞生长状态,具有肿瘤细胞生长代谢的某些特征.