登革2型病毒单克隆抗体的制备与鉴定

用登革2型病毒参考株免疫的BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞在PEG1000作用下进行融合,获得了10株分泌抗登革2型病毒单克隆抗体的杂交瘤。经间接免疫荧光鉴定,有4株杂交瘤产生的单克隆抗体对登革2型病毒是型特异的;2株对登革1型有交叉反应;1株对登革3型有交叉反应;1株对登革4型有交叉反应;另2株为黄病毒属特异的。经补体结合和血凝抑制试验鉴定,有2个单克隆抗体是黄病毒属血凝抑制特异的。这10个单克隆抗体对登革热的诊断是很有用的。     

登革1型病毒的单克隆抗体

我们用SP2/0-Ag14小鼠骨髓瘤细胞与用登革1型病毒免疫的BALB/C小鼠脾细胞在融合剂PEG-1000的诱导下进行融合,获得了15株产生抗登革1型病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞系。其中14株属登革病毒型特异,1株属登革病毒亚群特异,它们的荧光效价均在10,240以上。15株杂交瘤均无血凝活性,3株有补体结合活性。1D_4,1B_9的IgG亚类为IgG_1,1F_(11)为IgG_2a,轻链均为K型。1株杂交瘤(1D_4)的染色体数为87～115。用SDS-PAGE测定1D_4分子量,重链为54,000,轻链为24,000。15株杂交瘤连续传代3～6个月,冻存复苏后抗体水平未见下降。     

登革4型病毒的单克隆抗体

用SP2/0小鼠骨髓瘤细胞与用登革4型病毒免疫的鼠脾细胞,在PEG—1000的作用下进行融合,获得了8株产生抗登革4型病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞系。其中5株杂交瘤产生的抗体,对登革4型病毒具有荧光型特异性,1株对登革1型病毒有交叉反应;另2株对登革2型病毒有交叉反应。对上述8株杂交瘤分泌的抗体又进行了补体结合、空斑抑制中和及血凝抑制试验的鉴定,结果有2株是补体结合型特异,另4株有低度的中和活性。然后用3个荧光型特异的单克隆抗体对5个地方毒株进行试用的结果,进一步验证了它们的特异性。上述杂交瘤稳定传代7个月后,冻存于液氮中。     

森林脑炎病毒单克隆抗体的制备与鉴定

用森林脑炎病毒森张株免疫的BALB/c小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞在融合剂PEG-1000的作用下进行融合,用间接免疫荧光法筛选,获得了6株分泌抗森林脑炎病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株.通过免疫荧光交叉鉴定,6份单克隆抗体均与黄病毒属的登革4型病毒、流行性乙型脑炎病毒无属间交叉.与森林脑炎病毒COφ株、国内的森候株、森董株有交叉反应,属森林脑炎病毒种特异.6份单克隆抗体均无血凝抑制活性和补体结合活性.3株杂交瘤细胞培养上清浓缩物经抗鼠Ig免疫血清双扩鉴定为IgM.染色体数的检查为89～110条.6株杂交瘤细胞连续传代3～6个月,冻存复苏后仍能稳定地分泌特异的单克隆抗体.     

用单克隆抗体快速鉴定登革病毒

用登革病毒参考株免疫的BALB/C鼠的脾细胞与SP2/O鼠骨髓瘤细胞融合,成功地建立了分泌抗登革1～4型病毒单克隆抗体的杂交瘤31株。经免疫荧光交叉鉴定,其中17株杂交瘤的抗体是属登革型特异的。用4个型特异的单克隆抗体对国内分离的12令登革地方毒株进行了免疫荧光的快速鉴定,获得了高度敏感高度特异的结果。证明获得的单克隆抗体可以作为免疫荧光诊断制剂,提供登革热病原的快速鉴定应用。     

利用DNA免疫建立分泌登革2型病毒E蛋白单抗的杂交瘤细胞系

目的:利用DNA免疫建立分泌登革2型病毒E蛋白特异单抗的杂交瘤细胞系,为研究E蛋白的结构和功能及其抗原表位提供新手段.方法:以构建的病毒全长prM-E基因的真核重组质粒DNA作为免疫原,免疫BALB/c小鼠后将其脾细胞和SP2/0瘤细胞融合,通过IFA、间接ELISA和空斑减少中和试验对杂交瘤细胞系进行筛选和鉴定.结果:获得了4株分泌登革2型病毒E蛋白单抗的杂交瘤细胞系(2B4,6B4,4C10和2D5),它们结合的抗原表位均位于E蛋白Ⅲ区,其中4C10对登革2型病毒具有中和活性.这些单抗与登革1、3和4型病毒有强的交叉反应,但与黄病毒其他成员反应较弱.结论:DNA免疫法可用于分泌登革2型病毒E蛋白特异单抗的杂交瘤细胞系的建立,该结果有利于登革病毒E蛋白特异抗原表位的研究及新的登革病毒诊断试剂的研制.     

产生抗登革4型病毒单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立

用登革4型H241株病毒免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,获得了5个产生抗登革4型病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞系。这些杂交瘤细胞的上清液及小鼠腹水抗体均用间接免疫荧光法检测。其中两个杂交瘤细胞系产生的抗体对登革4型病毒具有型特异性,它们的荧光抗体滴度分别为1:10,240～1:20,480和1:2,560。另两个细胞系产生的抗体对登革2型病毒有交叉;另1个对登革1型病毒有交叉。     

登革2型病毒株抗原分析

本文试用标记分析法研究我国海南地区3年来(1985～1987)流行的登革2(DEN-2)型病毒株抗原的变化.用3种单克隆抗体(黄病毒属特异、亚属特异及DEN-2型型特异)分析了8个DEN-2型流行株并与标准新几内亚B株进行了比较.发现5株与标准株类似,3株显示出明显差异.标记分析法为病毒抗原分析提供了一个简便快速的方法,并且可用来监测一个地区病毒株群的变化及新株的引入.     

登革2型病毒包膜蛋白B区在大肠杆菌中的高效表达

目的：在大肠杆菌中对登革2型病毒包膜蛋白B区进行表达，为观察其抗原性和免疫原性奠定基础。方法：将通过PCR扩增的登革2型病毒包膜蛋白B区插入高效原核表达栽体pBAD／Topo ThioFusion，然后在大肠杆菌中利用阿拉伯糖进行诱导表达。时表达产物以免疲印迹和ELISA法进行检测。结果和结论：登革2型病毒包膜蛋白B区在大肠杆菌中的表达产物以可溶性形式存在，表达量约占细菌可溶性总蛋白的62％。表达产物可与登革2型病毒的特异多抗反应，但与登革1、3和4型病毒的特异多抗无交叉反应。登革2型病毒包膜蛋白B区可在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达。     

登革2型病毒PrM基因对不同型登革病毒复制的特异抑制作用

目的 :将我国登革 2型病毒PrM(D2 _PrM)基因导入甲病毒载体系统 ,探讨含正、反义PrM基因的重组病毒对不同血清型登革病毒复制的特异抑制作用。方法 :采用体外转录和电穿孔的方法 ,首先分别将构建的含正、反义PrM基因的重组质粒DNA和辅助载体DNA转录成RNA ,然后将这两种RNA共转染BHK细胞 ,进而包装成重组病毒颗粒。再将经激活的重组病毒感染宿主细胞 ,分别用不同型登革病毒攻击 ,然后通过免疫荧光法 ,观察对不同型登革病毒复制的抑制作用。结果 :含登革 2型正、反义PrM基因的重组甲病毒 ,不仅可完全抑制该型病毒在宿主细胞中的复制 ,而且对其他 3个型病毒的复制也具有不同程度的抑制作用。含反义PrM基因的重组病毒对 4个型登革病毒复制的抑制作用最强。结论 :登革 2型病毒的正、反义PrM基因在宿主细胞中通过重组甲病毒 ,可介导对登革 1～ 4型病毒复制的特异抑制作用     

用单克隆抗体分析鉴定登革3型病毒的不同抗原决定簇

登革病毒(DEN)抗原成分复杂,与许多虫媒披膜病毒都有严重的血清学交叉反应。杂交瘤单克隆抗体(Mcab)技术建立之后,Dittmar等人首先制备出了抗DEN-3病毒的McAb,可进行DEN-3病毒的鉴定分型。随后,Henchal等人制备出了抗DEN1-4型病毒的McAb,用这些McAb进行DEN病毒抗原决定簇研究,依据间接免疫荧光染色(IFA)证实了DEN病毒的四种不同抗原决定簇,即:黄病毒属特异的、DEN-1-4型病毒特异的、DEN-1、3型病毒特异的和DEN病毒各型型特异的。阎国珍等人在研究抗DEN-4病毒McAb时,获得了抗DEN-2、4型病毒特异的McAb,证明DEN-2和DEN-4病毒间有共同特异抗原决定簇。本文介绍通过用抗DEN-3病毒McAb对不同披膜病毒抗原交叉反应测定来分析鉴定     

登革1型病毒广州06株基因组全长感染性克隆的构建与鉴定

目的:构建本室新分离的登革1型病毒广州06株基因组全长感染性cDNA克隆,为深入研究登革病毒致病机制奠定基础.方法:根据登革1型病毒广州06株基因组全序列中单一酶切位点设计特异引物,分别扩增并克隆5个病毒亚基因组cDNA片段,将其逐一拼接连入pWSK 29低拷贝质粒载体,获得病毒全长cDNA克隆,并将其体外转录为RNA,再转染细胞获得恢复病毒.进一步通过RT-PCR扩增病毒5′和3′非编码区序列和特异性间接免疫荧光对其恢复病毒进行鉴定.结果和结论:构建获得登革1型病毒广州06株基因组全长感染性cDNA克隆,其恢复病毒与野生型病毒具有相似的生物学特性.     

产生抗登革4型病毒单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立

登革热是东南亚地区由虫媒病毒引起的重要传染病之一。在登革病毒1—4型中,以4型病毒引起的病情最严重,出血型病例多,病死率高。我国在1978—1980年间,曾连续发生了登革热的暴发流行。在病原诊断中,用白纹伊蚊C6/36细胞大大提高了病毒分离率,但在鉴定分型中,因交叉反应明显造成困难。由于登革病毒具有型间和组间的共同抗原,故用一般的动物免疫血清或免疫腹水进行鉴定分型时,交叉反应难以克服。采用淋巴细胞杂交瘤技术,能够制备出对病毒单一抗原决定簇的单克隆抗体,可以很好地解决上述交叉问题。国外已有登革3型和2型病毒单克隆抗体的报导。为了平时和战时提供登革病毒型特异的诊断制剂,解决     

登革4型病毒5''非编码区SLB元件对病毒复制和翻译的调控作用

目的探讨登革4型病毒5′非编码区SLB元件对病毒复制和翻译的调控作用。方法首先通过mfold3·2软件对登革4型病毒5′端RNA二级结构进行预测,确定了3个突变位点:SLB1,缺失位于短茎环82-87位5′UAR环化序列,并破坏其保守茎环结构;SLB2,在次环引入突变破坏其环状结构(M77G/C);SLB3,突变仅涉及核苷酸,不破坏该次环二级结构(M77-78AG/GA)。然后在含有海肾荧光素酶(Renilla Luciferase,R·luc)报告基因的复制子(DEN-R·luc2A-RP)基础上,利用重叠PCR构建上述突变体。将突变体(包括相关的阳性和阴性对照复制子)分别线性化并体外转录成RNA后,取等量各转录体RNA,以脂质体法分别转染BHK-21细胞。通过间接免疫荧光(IFA)、RT-PCR、R·luc报告基因技术和实时定量RT-PCR对突变体的复制和翻译水平进行检测。结果SLB1突变体的翻译水平并未受到显著影响,但其复制水平出现显著下调。SLB2突变体的翻译水平亦未受到显著影响,但其复制水平受到完全抑制;SLB3突变体的复制和翻译水平均受到了完全抑制。结论登革4型病毒5′非编码区SLB元件对基因组RNA复制和翻译具有重要的调控作用。     

含有海肾萤光素酶报告基因的登革4型病毒亚基因组复制子的构建

目的:构建含有海肾萤光素酶(Renilla luciferase, R.luc)报告基因的登革4型病毒亚基因组复制子,为探讨病毒基因组中保守序列和元件在复制和翻译调控机制中的作用提供新的手段.方法:利用定点诱变PCR技术构建prM-E基因缺失的登革4型病毒亚基因组复制子(DENRP),用顺式水解酶元件(cis-acting hydrolase element,CHYSEL)技术将R.luc报告基因插入到DENRP缺失的结构基因区,构建含有R.luc报告基因的复制子(DEN-R.luc2A-RP).将构建的复制子线性化并体外转录成RNA后,经电穿孔转染BHK-21细胞,通过间接免疫荧光、RT-PCR和R.luc检测技术对复制子进行鉴定.结果:所构建的prM-E基因缺失的复制子和含有海肾萤光素酶报告基因的复制子,均可在BHK-21细胞中自主复制并稳定表达病毒特异蛋白.DEN-R.luc2A-RP可持续表达外源R.luc报告基因21 d,在转染后24~96 h R.luc荧光信号呈线性增强.在该区间进行实时检测可显示复制子复制和翻译水平的变化.结论:获得了两株可在BHK-21细胞中稳定表达的复制子,为进一步研究登革4型病毒复制和翻译机制奠定了基础.     

登革3型病毒NS1基因重组质粒DNA的构建及其免疫原性观察

目的：构建登革3型病毒NS1基因的真核重组表达质粒，观察其免疫原性，为登革新型疫苗的研究提供依据。方法：从感染鼠脑中提取登革3型病毒RNA，经RT－PCR获得NS1基因片段，然后将其克隆到真核表达载体中。用电穿孔法将重组质粒NDA转入COS7细胞，通过免疫荧光法检测外源基因在真核细胞中的表达，将重组质粒DNA免疫BALB／c小鼠，观察其免疫原性。结果：通过酶切鉴定和序列测定证实了NS1基因片段已经插入真核表达载体，用免疫荧光法证明转染了重组质粒的COS7细胞的胞浆中有特异荧光。重组质粒DNA免疫小鼠后可观察到诱发产生的细胞免疫应答。结论：含有登革3型病毒NS1基因的真核重组表达质粒可以在COS7细胞中进行表达，而且能够诱导小鼠产生细胞免疫应答。     

我国登革2型病毒04株包膜蛋白基因的核苷酸及其相应的氨基酸序列

本文报告我国登革2型04株包膜蛋白基因的核苷酸及氨基酸序列,并与登革1、3、4型及其它2型毒株如几内亚C株(NGC)、牙买加株1409(JAM)、候选疫苗株S1以及马来西亚当地流行株M1(登革出血热)、M2(登革休克综合征)。 M3(登革热)进行比较。结果表明D_2-04株E蛋白基因的核苷酸序列与NGC,JAM和S1的同源性分别为95.0％、97.4％和90.0％;与M1、M2、M3的同源性分别为93.3％、92.1％和94.3％;与其它登革血清型的同源性大约为65％。登革2型04株蛋白的氨基酸序列与NGC、JAM、S1、M1、M2、M3的类似性分别为96.8％、97.2％、91.4％、95％、95.6％和94.3％。与其它登革血清型氨基酸类似性大约为62％～68％;与其它黄病毒的类似性范围为43％～47％。推断的氨基酸序列显示出7个保守的半胱氨酸残基及两个潜在的糖基化位点,分别位于Asn-67和Asn-153位。     

用碱性硼酸缓冲液制备登革病毒血凝抗原

目前制备登革热抗原的方法(庶糖-丙酮法)较烦,并需一定设备,在基层卫生单位不易办到。我们根据世界卫生组织东南亚和西太平洋登革热技术顾问委员会及 Chan的报告,用碱性硼酸绥冲液成功地制备出登革1～3型血凝抗原,并放普通冰箱观察了其稳定性。试验所用的登革热病毒1～4型分别是夏威夷株鼠传23代:新几内亚 B 株鼠传43     

基孔肯亚病毒中和单克隆抗体的筛选与鉴定

目的 :建立抗基孔肯亚病毒单克隆抗体细胞株 ,筛选具有中和活性的特异性单克隆抗体。方法 :利用细胞融合技术建立抗基孔肯亚病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株 ,用细胞培养中和试验初筛具有中和活性的单克隆抗体 ,用固定单克隆抗体稀释病毒方法进行乳鼠中和试验 ,进一步验证单克隆抗体的保护作用 ;用中和交叉试验鉴定中和单克隆抗体反应的特异性。结果 :用免疫荧光法检测建立了 9株能稳定分泌抗基孔肯亚病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ,初筛出 4株具有中和活性的单克隆抗体 ,其中 1F1单克隆抗体稀释 2 0 0倍时可保护 50 %细胞不产生细胞病变 ;乳鼠中和试验1F1单克隆抗体中和指数为 10 3.3,对试验小鼠有较强的保护作用。中和交叉试验表明 ,1F1单克隆抗体只中和基孔肯亚病毒 ,与其他病毒无交叉反应 ,特异性较高。结论 :制备了 9株抗基孔肯亚病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株 ,筛选得到了 1F1具有较强中和活性的特异性单克隆抗体 ,可望为基孔肯亚病毒病的诊断、紧急预防与治疗提供良好试剂     

肾综合征出血热病毒单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立与鉴定

用陕西省分离的肾综合征出血热(HFRS)病毒82-010H株免疫BALB/c纯系鼠和CxS/2小鼠,取免疫鼠脾细胞与SP2/O小鼠骨髓瘤细胞融合,获得10株分泌HFRS病毒特异性抗体的杂交瘤细胞系,对其中3H_4和4B_9两株单克隆抗体进行了鉴定。用各地分离的16株HFRS病毒抗原片与该两株单克隆抗体作了间接免疫荧光试验,结果表明:4B_9单克隆抗体只能与重型(黑线姬鼠型)HFRS疫区的病毒呈现阳性免疫荧光反应,而对轻型(褐家鼠及大林姬鼠型)HFRS疫区分离的病毒株不呈现免疫荧光反应;而3H_4单克隆抗体又能将重型和轻型HFRS毒株再行区分,这可能对HFRS病毒血清学分型和抗原分析以及流行病学调查研究等均有意义。