雷公藤片中5种有效成分同时测定及其质量评价研究

[目的]建立雷公藤片中雷公藤甲素、雷公藤红素、雷公藤内酯甲、雷公藤定碱和雷酚内酯5种成分的液相色谱串联质谱法的同时定量测定的方法。[方法]采用液相色谱质谱联用技术(LC-MS/MS)测定含量,使用Zorbax XDB-C18(2.1 mm×50 mm,3.5μm)色谱柱,流动相采用40 mmol/L甲酸铵水溶液和0.1%甲酸甲醇溶液梯度洗脱,采用正离子模式大气压化学电离源(APCI源)。检测成分的离子对质荷比分别为:雷公藤甲素(361.0/105.0)、雷公藤红素(451.2/201.0)、雷公藤内酯甲(455.3/409.7)、雷公藤定碱(884.4/856.5)、雷酚内酯(313.2/225.2)。[结果]雷公藤甲素、雷公藤红素、雷公藤内酯甲、雷公藤定碱和雷酚内酯的线性关系良好(r0.999),加样回收率分别为105.67%、94.07%、101.90%、99.28%、101.92%,RSD分别为2.65%、5.17%、2.68%、2.65%、3.27%。[结论]本研究所建立的LC-MS/MS分析方法稳定可靠、简便易行,可用于雷公藤片中雷公藤甲素、雷公藤红素、雷公藤内酯甲、雷公藤定碱和雷酚内酯5种成分的同时定量分析,为雷公藤片的质量评价和质量控制奠定了基础。     

一测多评法同时测定雷公藤提取物中6种成分含量

目的建立一测多评法(QAMS)同时测定自制雷公藤提取物6种有效成分的含量。方法采用QAMS法,以雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷酚内酯、雷公藤次碱、雷公藤红素和雷公藤内酯甲6种成分为研究对象,对外标法和校正因子法的实测值及计算值的差异进行分析。结果 6种指标成分在一定范围内线性关系良好,以雷公藤甲素为内参物,雷公藤内酯酮、雷酚内酯、雷公藤次碱、雷公藤红素和雷公藤内酯甲的fk/s分别为0.654、1.221、0.347、1.238、0.079,且在不同条件下重复性良好;3批样品中各成分含量分别为雷公藤甲素0.037～0.038mg/g、雷公藤内酯酮0.245～0.253 mg/g、雷酚内酯6.165～6.325 mg/g、雷公藤次碱14.439～15.065 mg/g、雷公藤红素1.699～1.856 mg/g、雷公藤内酯甲20.946～21.825 mg/g,且计算所得量与实测量测得结果无显著差异。结论QAMS法适用于雷公藤提取物的含量测定,可为雷公藤的质量控制提供参考。     

雷公藤不同炮制品中雷公藤甲素与雷公藤红素含量的高效液相色谱法测定

目的采用高效液相色谱法,比较雷公藤饮片炮制前后雷公藤甲素、雷公藤红素的含量变化。方法色谱柱为Ultimate XB-C18(4.6×250 mm,5μm),流动相为乙腈-水(33∶67),检测波长218 nm,柱温30℃,流速1 ml/min,测定雷公藤甲素的含量;流动相:甲醇-1%醋酸水溶液(87∶13),检测波长425 nm,柱温30℃,流速1 ml/min,测定雷公藤红素的含量。结果各炮制品中雷公藤甲素含量按降序依次为:清炒品、酒炙品、醋炙品、蒸制品、莱菔子汁煮品、水煮品、甘草汁煮品;雷公藤红素含量按升序依次为:水煮品、莱菔子汁煮品、甘草汁煮品、清炒品、蒸制品、酒炙品、醋炙品。结论炮制后,几种主要的炮制品雷公藤甲素和红素含量较生品有所降低,推测炮制能降低雷公藤的毒性。     

Beagle犬口服雷公藤片血浆中雷公藤红素LC-MS/MS测定及药动学研究

建立Beagle犬血浆中雷公藤红素的LC-MS/MS检测方法,用于Beagle犬口服雷公藤片的药代动力学研究。血浆样品经二氯甲烷提取,色谱条件为Phenomenex Luna C8色谱柱(2.0 mm×50 mm,3μm),流动相为甲醇-乙腈异丙醇溶液(1∶1)-0.1%甲酸15∶55∶30;多反应监测(MRM)雷公藤红素([M+H]+,m/z 451.3/201.1)和内标泼尼松龙([M+H]+,m/z 361.1/147.1);DAS 1.0软件对雷公藤红素药-时曲线进行拟合,并计算药代动力学参数。在0.680 0~136.0μg·L-1,雷公藤红素与内标的峰面积比值与浓度的线性关系良好,定量限为0.680 0μg·L·(-1),日内日间精密度小于6.15%,提取回收率为50.42%~51.65%。Beagle犬口服雷公藤片(1片/kg),血浆中雷公藤红素经时变化符合一室模型(w=1/cc),主要药动学参数分别为Cmax(35.64±9.540)μg·L~(-1),Tmax(2.62±0.69)h,T1/2(2.93±0.29)h,CL(0.308±0.056)L·kg~(-1)·h~(-1),AUC0-12(131.16±31.94)μg·L·h~(-1),AUC0-∞(142.83±37.57)μg·L·h~(-1)。建立的LC-MS/MS分析方法准确灵敏,适于雷公藤片中雷公藤红素药代动力学研究。     

清络通痹精简方中雷公藤“异类相制”减毒机制的化学基础

目的:通过测定清络通痹精简方、单味雷公藤、雷公藤配伍三七、雷公藤配伍地黄组合中雷公藤3种毒性成分雷公藤甲素、雷公藤红素、雷公藤内酯甲的溶出含量,从化学成分角度探索"异类相制"减毒的规律,为雷公藤的临床配伍减毒应用提供实验依据。方法:利用高度选择性和灵敏度的三重四级杆质谱(LC-MS/MS)同时对3种有效成分——雷公藤甲素、雷公藤红素和雷公藤内酯甲进行检测,比较单味雷公藤组、雷公藤配伍三七组、雷公藤配伍地黄组、清络通痹精简方组中3种有效成分的溶出变化。结果:雷公藤药材水提液中雷公藤甲素的含量最高,雷公藤内酯甲次之,雷公藤红素的含量最低。而当雷公藤药材用量相同的情况下,雷公藤中3种有效成分在不同配伍环境下的溶出趋势一致,溶出顺序为单味雷公藤组雷公藤配伍地黄组雷公藤配伍三七组清络通痹精简方组。结论:在配伍组合中三七对雷公藤3种有效成分的溶出有显著地抑制作用,地黄的抑制作用较弱,而清络通痹精简方中雷公藤3种有效成分的溶出明显降低。该研究结果为雷公藤的临床"异类相制"配伍减毒理论提供了实验依据。     

基于多组分评价的雷公藤提取物固体分散体的制备及体外表征

目的制备雷公藤提取物(ETW)固体分散体(ETW-SD),提高其体外溶出度。方法通过溶剂-熔融法,以聚乙二醇6000(PEG 6000)、泊洛沙姆188(F68)为载体制备ETW-SD。以雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷公藤次碱、雷公藤红素以及雷公藤内酯甲为评价指标,通过体外溶出度、电子扫描电镜(SEM)、差示热量扫描(DSC)和X-射线衍射(XRD)对ETW-SD进行表征。结果 ETW-SD的最优处方为ETW-PEG 6000-F68(1∶2∶1)。与原料药相比,在60 min内雷公藤内酯酮、雷公藤甲素的溶出度分别提高了3.32倍,雷公藤次碱提高了2倍,而雷公藤红素和雷公藤内酯甲的溶出度均达到83%以上。     

雷公藤属植物叶片中萜类成分的差异性

目的:测定雷公藤属植物叶片中5种萜类成分的含量并比较差异,研究3个物种间的化学亲缘关系。方法:采用HPLC法测定28批雷公藤属植物叶片中雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷酚新内酯、雷酚内酯和雷公藤红素5个成分的含量,并进行方差分析和聚类分析。结果:雷公藤属植物叶片中,雷公藤甲素、雷酚内酯和雷公藤红素的含量差异有统计学意义(P0.05);雷公藤内酯酮和雷酚新内酯含量差异无统计学意义(P0.05)。运用系统聚类将28批雷公藤属植物聚为4类:第I类为东北雷公藤和昆明山海棠;第II类为雷公藤;第III类为雷公藤;第IV类为雷公藤和昆明山海棠。结论:雷公藤属植物叶片中部分萜类成分含量差异明显。东北雷公藤与雷公藤化学亲缘关系较远;昆明山海棠混在2者之间,与2者无明显区分。     

基于雷公藤配伍前后雷公藤内酯酮含量变化探讨其减毒机制

目的以雷公藤内酯酮为指标,考察黄芪配伍雷公藤前后的雷公藤毒性成分的含量变化,以期推断其可能配伍减毒机制。方法采用高效液相色谱法比较分析黄芪配伍雷公藤前后毒性成分雷公藤内酯酮含量变化,从化学成分层次分析其减毒的物质基础变化,并结合中药七情中"相畏相杀"理论,推断其可能配伍减毒机制。结果含量测定试验中黄芪配伍雷公藤的雷公藤内酯酮平均含量(0.42×10~(-3) mg/m L)明显低于单味雷公藤的雷公藤内酯酮含量(0.54×10~(-3) mg/m L),说明黄芪配伍雷公藤后降低了雷公藤内酯酮的含量。结论黄芪与雷公藤配伍可降低雷公藤毒性。     

不同浓度脱落酸对雷公藤悬浮细胞萜类次生代谢产物累积的影响

目的:研究不同浓度脱落酸(Abscisic acid,ABA)对雷公藤悬浮细胞中萜类次生代谢产物的诱导效应,探讨脱落酸的毒物效应(Hormesis)。方法:雷公藤悬浮细胞继代培养10 d后,分别加入不同浓度(10μM,20μM,50μM,100μM,150μM,200μM,500μM)的ABA诱导,并设置空白对照组,每组生物学重复4次。分别采用HPLC和UPLC检测诱导后0 h和240 h的样品,测定悬浮细胞中雷公藤甲素、雷酚内酯、雷公藤红素和雷公藤内酯甲4种萜类成分的含量。结果:当ABA浓度为10μM和20μM时,诱导组与对照组无差异;50μM时,与对照组比较,雷酚内酯含量明显升高,雷公藤红素含量升高至2.4倍,雷公藤内酯甲含量升高至4.7倍;当诱导浓度超过100μM时,与对照组比较,除雷公藤内酯甲外,雷公藤甲素、雷酚内酯、雷公藤红素含量均显著降低。结论:ABA在10~500μM范围内对不同的雷公藤萜类成分影响作用不同,从整体趋势看,呈现为β曲线,符合Hormesis效应特点;50μM时ABA对雷公藤红素含量的积累有显著促进作用,为后期研究ABA影响雷公藤红素合成机制奠定基础。     

雷公藤药材中雷公藤甲素及总二萜内酯的含量测定

目的 建立雷公藤药材中雷公藤甲素及总二萜内酯含量测定的方法.方法 采用高效液相色谱法,色谱柱：Platisil ODS柱（250mm×4.6mm,5μm）,以甲醇-水（45∶55）为流动相进行洗脱,于218nnm波长处检测,测定雷公藤甲素的含量;采用Kedde显色法,在550nm波长处测定吸光度,测定总二萜内酯的含量.结果 以高效液相色谱法测定雷公藤甲素,在0.58～46.40μg·mL-1（r=0.9999）范围内线性关系良好,平均回收率为100.52％ （n =6）;比色法测定雷公藤总二萜内酯（以雷公藤甲素计）在0.49-39.36μg·mL-1（r =0.9999）范围内线性关系良好,平均回收率为93.28％（n=6）;雷公藤药材中雷公藤甲素平均含量为4.20μg·g-1,总二萜内酯为86.64μg·g-1.结论 本实验所建立的方法稳定,精密度良好,适合于雷公藤甲素及总二萜内酯的含量测定,可用于雷公藤药材的质量控制.     

甘草对雷公藤甲素与雷公藤内酯酮体内代谢成分的影响

目的:研究甘草对雷公藤甲素与雷公藤内酯酮体内代谢成分的影响.方法:采用LC-MS/MS研究雷公藤甲素和雷公藤内酯酮单独给药及与甘草联合给药后在大鼠血浆中相应代谢成分,比较单独给药及联合给药后代谢产物种类和生成量的差异.结果:在雷公藤甲素单独给药组及其与甘草联合给药组的大鼠血浆中,均发现4个代谢产物:m/z([M+H]+)359,359,375,377,其中羟基氧化代谢产物(m/z359)生成量较大.在雷公藤内酯酮单独给药组及其与甘草联合给药组的大鼠血浆中,均发现代谢产物3个:m/z([M +H]+)375,397,413,其中羟基化代谢产物(m/z 375)生成量较大,在联合给药组的大鼠血浆中还发现1个单独给药组中没有的代谢产物m/z([M +H]+)413.联合给药组比单独给药组的各代谢产物生成量大.结论:雷公藤甲素和雷公藤内酯酮单独给药及其与甘草联合给药后,大部分代谢产物相同,其中氧化代谢产物为主要代谢产物.甘草可加速雷公藤甲素和雷公藤内酯酮的体内代谢,为阐明甘草对雷公藤的减毒增效作用机制提供参考.     

不同部位、来源雷公藤药材的雷公藤红素含量比较

目的:建立雷公藤药材中雷公藤红素的HPLC测定方法,并对不同部位、来源雷公藤药材中雷公藤红素的含量进行比较。方法:采用高效液相色谱法,选用Welch Ultimate XB-C_(18)色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);以乙腈-0.1%磷酸(80∶20)为流动相;流速1mL·min~(-1);柱温25℃;进样量10μL;在波长425nm处检测。结果:该方法能在16min内简便快速的实现雷公藤红素的良好分离,雷公藤红素在0.47～189.4μg·mL~(-1)之间呈良好的线性关系(r=0.999 9),平均回收率为98.3%,RSD为1.9%(n=6)。结论:该法简便、快速、准确,可用于测定雷公藤药材中雷公藤红素的含量。各部位的雷公藤红素含量高低顺序为根皮﹥全根﹥根心,雷公藤红素含量高低与来自野生或栽培无必然联系,企业间与企业内部各药材的含量参差不齐,研究结果可为原药材的优选提供参考。     

LC-MS/MS法同时测定十一味益肾降糖片中马钱苷和莫诺苷的含量

目的:采用高效液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)技术建立同时测定十一味益肾降糖片中马钱苷和莫诺苷含量的方法。方法:以水-乙腈溶液为流动相梯度洗脱,以Thermo Scientific Hypersil ODS色谱柱为分析柱,通过电喷雾离子源,正离子模式,选择离子监测。结果:马钱苷和莫诺苷的线性范围均为10~2000 ng·mL~(-1),相关系数分别为0.998 2和0.999 1,加样回收率在97.28%~100.41%,RSD均低于1.10%。结论:通过LC-MS/MS技术建立的十一味益肾降糖片中马钱苷和莫诺苷的含量测定方法专属性强,快速、灵敏、准确,可用于其质量控制。     

雷公藤甲素阿魏酸醇质体凝胶的制备与经皮渗透性研究

采用改良后的Franz扩散池法,以小鼠腹部皮肤为模型进行体外透皮扩散,收集不同时间点的接收液,用HPLC测定其中阿魏酸的浓度、用LC-MS/MS测定雷公藤甲素的浓度,比较醇质体凝胶、普通凝胶、乳膏3种剂型的透皮速度、透皮量与皮肤储量的差别,以探索雷公藤甲素阿魏酸醇质体凝胶中阿魏酸、雷公藤甲素的体外透皮特性并与普通凝胶组和乳膏组比较。结果,雷公藤甲素阿魏酸醇质体凝胶、普通凝胶和乳膏中阿魏酸稳态透皮速率分别为5.268 5,8.990 9,12.042 0μg·cm~(-2)·h~(-1),皮肤滞留量分别(30.234 8±1.525 4),(20.402 6±0.402 6),(7.635 3±1.094 2)μg·cm~(-2);雷公藤甲素阿魏酸醇质体凝胶中雷公藤甲素的稳态透皮速率为67.238 0 ng·cm~(-2)·h~(-1)约为乳膏的1.24倍,普通凝胶的3.28倍,皮肤滞留量为(371.351 4±35.317 1)ng·cm~(-2)约为乳膏的3.35倍,普通凝胶的5.25倍。故雷公藤甲素阿魏酸醇质体凝胶透皮效果良好,有助于临床安全给药。     

乌参醒脑滴丸中银杏萜类内酯成分的质量控制研究

目的控制银杏叶提取物原料质量并建立乌参醒脑滴丸中萜类内酯成分的含量测定方法。方法采用AB-8大孔吸附树脂进行银杏叶萜类内酯提取优化,HPLC-ELSD法检测4种萜类内酯白果内酯及银杏内酯仁、A、B的含量,优选提取部位入药。优化色谱条件,采用Diamonsil-C_(18)(250 mm×4.6 mm,5.0μm)色谱柱,柱温34℃;以甲醇-0.2%甲酸水为流动相进行梯度洗脱,流速为0.7 mL·min~(-1);蒸发光散射检测器检测,载气压力为30 psi,漂移管温度为80℃,同时测定乌参醒脑滴丸中白果内酯、银杏内酯仁、银杏内酯A、银杏内酯B的含量。结果乌参醒脑滴丸优选60%乙醇提取部位干浸膏进行成药制剂,滴丸制剂中4种成分(白果内酯及银杏内酯C、A、B)分别在4.77~47.70mg·mL~(-1),2.31-23.10mg·mL~(-1),4.79~47.94mg·mL~(-1),2.32~23.25mg·mL~(-1)浓度的常用对数(X)与峰面积的常用对数(Y)呈良好的线性关系。其4种萜类内酯成分的平均回收率分别为92.1%,91.5%,93.7%,93.7%;RSD分别为2.31%,2.77%,2.12%,1.36%。结论 HPLC-ELSD法测定乌参醒脑滴丸4种萜类内酯分离度好,专属性强。该研究可保证乌参醒脑滴丸萜类内酯成分原料可控,成分可控。     

雷公藤药材中6种有效成分以及总二萜内酯、总生物碱、总三萜的含量测定

目的:建立HPLC同时定量雷公藤药材中6种有效成分的方法,以及用紫外可见分光光度法测定雷公藤总二萜内酯、总生物碱、总三萜3个有效部位含量的方法,并研究不同产地的雷公藤药材中上述成分的含量差异。方法:①采用高效液相色谱法,色谱柱:Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6mm×250mm,5μm),以乙腈-磷酸(0.1%)-三乙胺(0.2%)为流动相进行梯度洗脱;柱温35℃;检测波长:0-65min为225nm;65min后转换为210nm;流速0.75mL/min,运行时间80min,测定11个不同产地雷公藤药材中6种有效成分的含量。②分别以雷公藤甲素、雷公藤次碱、雷公藤红素为对照,用紫外可见分光光度法测定雷公藤总二萜内酯、总生物碱及总三萜的含量。结果:不同产地的雷公藤药材有效成分及有效部位的含量差异悬殊,如雷公藤晋碱的含量相差291.6倍,总二萜内酯类高低含量之间相差34.7倍。结论:本研究所建立的方法稳定性、精密度、重复性良好,适用于雷公藤有效成分和有效部位的含量测定;不同来源的药材成分含量差异显著,对雷公藤实施多指标的含量控制是保证其临床药用安全可控的必要途径。     

雷公藤内酯三醇通过Nrf2/Keap1信号通路抑制氧化应激和炎症减轻雷公藤甲素诱导的肝损伤

目的 基于Nrf2/Keap1信号通路探讨雷公藤内酯三醇对雷公藤甲素诱导小鼠肝损伤模型的肝脏氧化应激和炎症的影响。方法 将SPF级Balb/c雄性小鼠随机分空白对照组、雷公藤甲素组及雷公藤甲素+雷公藤内酯三醇组。雷公藤内酯三醇(28 mg·kg^-1)灌胃预处理7 d，最后1次灌胃后，单次腹腔注射雷公藤甲素(1 mg·kg^-1)复制小鼠肝损伤模型。检测小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)水平并使用苏木素-伊红(HE)综合评估小鼠的肝损伤程度；试剂盒检测小鼠肝脏中活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)和超氧化物歧化酶(SOD)含量，观察肝脏氧化应激状态；采用ELISA试剂盒检测小鼠肝脏中白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素10(IL-10)的水平，评估炎症反应；Western Blot法检测肝脏组织中细胞核因子-红细胞相关因子2(Nrf2)、KELCH样ECH关联蛋白1(KELCH-like ECH-associated protein 1,Keap1)、血红素氧合酶(HO-1)、醌氧化还原酶1(NQO1)的蛋白表达...     

关黄柏炒炭前后饮片化学成分的变化规律分析

目的:探究关黄柏炒炭前后饮片化学成分的变化规律,为关黄柏和关黄柏炭饮片的质量标准制定提供依据。方法:采用HPLC测定,流动相乙腈-0.4 mol·L~(-1)氯化铵水溶液梯度洗脱,柱温35℃,流速1.0 m L·min~(-1),检测波长215 nm。分析关黄柏炒炭前后饮片化学成分组成及含量的变化,对其中7种主要化学成分进行定量分析。结果:10批关黄柏饮片中,木兰花碱、盐酸黄柏碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、黄柏内酯、黄柏酮的质量分数分别为2.468~6.783,1.947~4.197,0.209~0.506,3.049~4.557,5.869~13.168,5.141~7.337,1.798~4.975 mg·g~(-1)。关黄柏炒炭后,除个别企业样品外,各化学成分含量均有减少,其中盐酸小檗碱、盐酸巴马汀等生物碱类成分几乎殆尽;黄柏酮、黄柏内酯等小极性成分保存较多,9批关黄柏炭饮片中,黄柏内酯、黄柏酮的质量分数分别为3.164~6.483,0.281~1.614 mg·g~(-1)。结论:关黄柏饮片炒炭后,外观性状和内在成分变化明显,关黄柏饮片的质量标准难以应用于关黄柏炭。所购关黄柏炭饮片也因此难以做到炒炭程度统一,应根据关黄柏炒炭后的成分变化规律控制炒炭程度,进一步规范关黄柏和关黄柏炭饮片的质量标准。     

高效液相色谱法测定雷公藤片含量的方法研究

目的提高雷公藤片的质量标准,摸索高效液相色谱(HPLC)法测定雷公藤片含量的方法。方法采用高效液相色谱法,C18柱,流动相为甲醇-水(40∶60),检测波长218 nm。结果雷公藤甲素线性范围为0.047 6~0.476 0μg,r=0.9991,平均回收率为101.2%,RSD为2.1%(n=6)。结论雷公藤片含量测定限度暂定为:每片含雷公藤以雷公藤甲素(C37H22O14)计,不得少于0.01 mg/片。     

LC-MS/MS测定大鼠血浆中白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的浓度及苍术-香附提取物在大鼠体内的药动学研究

目的 建立液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)检测大鼠血浆中白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ浓度,研究苍术-香附提取物灌胃后大鼠体内3种活性成分的药动学特征。方法 以苯海拉明为内标,血浆样品采用乙酸乙酯液-液萃取法处理,采用ACQUITY UPLC BEH-C₁₈色谱柱(2.1 mm×50 mm, 1.7μm),流动相为乙腈-体积分数0.05%甲酸水,通过电喷雾离子源进行正离子扫描,多反应监测技术(multiple reaction monitoring, MRM)检测模式。检测离子：m/z 231.2→185.1(白术内酯Ⅰ)、m/z 233.2→187.1(白术内酯Ⅱ)、m/z 249.2→231.1(白术内酯Ⅲ)、m/z 256.2→167.1(苯海拉明)。利用DAS 3.2.2软件计算药动学参数。结果 白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ的线性范围分别为0.315 0～20.00、0.315 0～20.00、3.150～200.0 ng·mL^-1,方法学的各项指标均符合要求。苍术-香附提取物灌胃给药后的3种活性成分的药-时曲线呈双...