利用冰冻切片和荧光成像技术研究接菌法沉香的显微结构

目的：利用冰冻组织切片和荧光成像技术对接菌法沉香不同显微特征进行比较,分析挥发油分布的规律,了解白木香结香过程中显微组织的变化。方法：显微观察接菌法沉香层、内含层及白木层(未结香)结构特征,测量不同结香部位内涵韧皮部和木射线的显微参数,检测不同结香部位的荧光平均光密度,并进行统计学分析。结果：接菌法沉香的沉香层、内含层与白木层相比,在晶体、树脂及挥发油分布数量发生变化,不同部位的显微参数差异显著(P<0.05)。沉香层和内含层的木间韧皮部、射线细胞及部分导管中存在黄棕色油状物,相同部位在荧光显微镜下存在绿色自发荧光。结论：冰冻切片结合荧光成像可准确显示沉香挥发油定位,不同结香部位显微结构及其显微参数存在差异,该结果为深入研究白木香结香的生理过程及机制积累了重要的实验基础。     

两批接菌法所产沉香挥发油化学成分的气相色谱-质谱联用分析

目的 研究接菌法半年及一年结香的沉香挥发油成分.方法 采用接菌法进行人工结香,并用乙醚提取接菌法半年及一年结香的沉香挥发油组分,通过气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术对其进行分析和鉴定.结果 两批沉香样品均主要由倍半萜、芳香族化合物和脂肪酸组成,并从接菌法一年结香的沉香样品中检出了2-(2-苯乙基)色原酮类成分.结论 通过对比两批沉香样品挥发油的特征性成分与含量,对其质量进行了评价,结果证明接菌法一年结香的沉香质量较好.     

三批人工结香一年沉香挥发性成分研究

目的:对采用结香剂涂抹法和输液法结香1年的沉香进行质量评价。方法:采用乙醚超声法提取两批结香剂涂抹法和一批输液法所产沉香的挥发油,并应用GC-MS法分析其化学成分及相对含量。结果:共鉴定了42个化合物,3批样品均以色酮和倍半萜类为主要成分,品质较好。结论:沉香中化合物类型受树种的影响较大,与结香方法关系不明显。白木香植物经人工结香一年后所产的沉香中色酮类成分的相对百分含量大于倍半萜类成分的相对百分含量。     

不同树龄对火烫法所得沉香的质量比较研究

目的对不同树龄白木香经火烫法处理所获得沉香药材进行质量评价,探讨树龄对结香效果的潜在影响。方法采用气质联用(GC-MS)对6年、9年及20年树龄火烫法结香沉香样品挥发油进行化学成分分析,按2015年《中国药典》版比较性状、显微、薄层色谱鉴别及浸出物含量。结果 GC-MS结果显示三组样品均具有苄基丙酮等沉香特征性成分及4种色酮,但相对含量有所不同。三组样品性状、显微、薄层色谱鉴别及浸出物含量均符合《中国药典》,但20年树龄组醇浸出物含量达到20.35%,显著高于对照药材,且其薄层色谱更接近对照药材。结论不同树龄白木香经火烫法处理所得沉香品质有一定差异,树龄可能为影响结香品质的重要因素之一。     

人工结香法所产沉香挥发性成分的GC-MS分析

目的:对3种人工结香法所产沉香的挥发性成分进行研究。方法:采用乙醚浸提法提取3批沉香样品的挥发油,并应用GC-MS分析测定其化学成分及相对含量。结果:3批沉香样品均主要由倍半萜、芳香族化合物和脂肪酸组成。结论:通过比较3批沉香样品中的特征性成分及其含量,对其质量进行了评价,其中打钉法及凿洞法所产沉香质量较好。     

稻黑孢霉A8及其诱导的人工沉香次生代谢产物分析

目的:分析稻黑孢霉(Nigrospora oryzae)A8及其诱导的人工沉香次生代谢产物。方法:三氯甲烷萃取白木香内生真菌及其诱导的人工沉香,气相-质谱联用法(GC-MS)分析代谢产物,自动质谱退卷积定性系统(AMDIS)结合保留指数(RI)法鉴定挥发性成分。结果:N.oryzae A8发酵液共检出58个色谱峰,鉴定其中30种化合物,检出相对含量最高的化合物是β-苯乙醇;N.oryzae A8人工诱导白木香生产的3批沉香药材共鉴定出38种化合物,主要为倍半萜类、芳香族类、2-(2-苯乙基)色酮类等沉香特征性成分。结论:N.oryzae A8发酵液可高效诱导白木香结香,其次生代谢产物可能参与沉香形成过程。     

不同熟化时期白木香果皮挥发性成分的研究

目的:对白木香果皮6个不同熟化时期的挥发性成分进行分析,以期发现白木香非药用部位中沉香类成分,挖掘白木香果皮潜在价值,为实现白木香非药用部位的可持续开发利用奠定理论基础。方法:本实验采用超声提取技术提取白木香果皮中挥发性成分,借助气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)分析不同熟化程度果皮的挥发性成分。结果:共检测到207种化合物,包括萜类、甾类、脂肪酸、生物碱、烷烃及烯烃等;其中,检测到的倍半萜类成分包括桉叶烷型、愈创木烯型和螺旋烷型倍半萜,均为沉香的特征性成分;进一步分析表明白木香果皮熟化的第Ⅲ期倍半萜类成分及单萜相对质量分数最高分别达1.17%、0.66%,而生育酚则在Ⅲ期后下降到检测限下。结论:本研究将为全面合理开发白木香非药用部位及白木香可持续利用奠定基础。     

3种不同方法形成的沉香药材色酮含量测定

目的建立沉香药材中色酮类成分含量测定方法,考察不同白木香结香方法的药材质量,为评价沉香质量提供实验依据。方法采用可见分光光度法(VS)以磷钨酸钼-硫酸锂为显色剂,以Aquilarone E色酮作为对照品溶液,在760 nm波长下测定沉香药材试液中沉香总色酮的含量。HPLC法测定沉香5种色酮含量,采用Waters Symmetry Shield C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸水(B),流速1m L·min-1,检测波长为252 nm,柱温30℃。结果所建立的可见分光光度法在5 h内稳定性良好,加样回收率为96.71%(RSD=2.12%)。HPLC法测定5种色酮含量在进样量0.1432~7.16、0.00884~0.442、0.01536~0.768、0.01264~0.632、0.0154~0.77μg范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。5种色酮平均加样回收率分别为96.98%、97.19%、96.19%、96.52%及95.69%。不同批次沉香含量差异显著,与自然结香组(对照)比较,差异有统计学意义(P0.05,P0.01),人工诱导组白木香的结香质量优于传统火烫法,与结香周期较长的自然结香组相近。结论两种检测方法均简便、快速、准确,重复性好,可用于沉香中色酮类成分含量测定。人工诱导白木香快速结香可作为进一步开发利用其资源的重要方法。     

不同树龄对火烫法所得沉香色酮类成分的影响

目的:比较不同树龄的白木香经火烫法处理所得沉香样品的色酮类成分含量,探讨树龄对结香效果的影响。方法:采用HPLC法同时测定不同沉香样品中7种色酮含量。结果:20年树龄组有5种色酮含量最高,其中沉香四醇含量为9.0212 mg/g,远高于6年树龄组(5.4773 mg/g)。但6年树龄组沉香Aquilarone D含量最高(0.1561 mg/g)。结论:不同树龄白木香经火烫法处理所得沉香品质有一定差异,树龄可能为影响结香品质的重要因素之一。     

基于GC-MS技术的不同结香方法沉香聚类及灰色关联度分析

目的:探索不同结香方法所得沉香的鉴别与质量评价方法。方法:利用GC-MS法检测不同结香方法的沉香样品中挥发性成分,运用相似度评价、聚类分析及灰色关联度分析法进行区分,并初步评价其质量。结果:GC-MS分析结果表明不同结香方法的沉香样品中挥发性成分存在一定的差异,图谱相似度为0.275～1.000,从15批沉香样品中检测出622个化合物,包括4个共有成分,分别为苄基丙酮、2-(2-苯基乙基)色酮、6-甲氧基-2-苯乙基色酮及6,7-二甲氧基-2-(苯基乙基)色酮;聚类分析法难以区分不同结香方法所产的沉香样品;灰色关联度分析结果表明各结香方法得到的沉香样品的质量排序为物理伤害法沉香接菌法沉香天然虫漏法沉香火烫法沉香。结论:灰色关联分析能较好地区分不同结香方法的沉香,并能通过排序反映出样品质量。     

筛选诱导白木香产生沉香的真菌的研究

 目的 筛选诱导白木香产生沉香的活性真菌。 方法 野外条件下用真菌接种白木香,利用光学显微镜和扫描电子显微镜分别观察真菌诱导白木香树产生沉香过程中的真菌侵染、定植、真菌与植物的互作情况;用GC-MS检测诱导产生沉香材料中挥发油的主要成分。结果 筛选到三株具有诱导白木香产生沉香的活性真菌,这些真菌的诱导效果尚属首次报道。真菌菌丝能够侵入白木香组织细胞,诱导白木香产生的沉香与天然沉香的化学成分类似。结论 利用本实验得到的3株真菌诱导白木香结香具有重要的理论意义和实际应用价值。
     

镰刀菌诱导白木香结香部位总RNA提取方法的研究

目的白木香树在自然条件下不产生树脂,以自然、微生物或人工方式可使之形成沉香树脂。"小孔滴注法"接种镰刀菌人工诱导白木香结香,8个月后野外采集白木香结香部位(分泌黑色树脂的树干组织),提取其总RNA,为阐明沉香特征产物的代谢途径、揭示人工诱导白木香结香的分子机制奠定基础。方法 "小孔滴注法"人工造香,手工割取白木香结香部位。分别采用CTAB-Li Cl法、Trizol试剂法、RN09试剂盒法、改良异硫氰酸胍-CTAB法和Qiagen试剂盒法提取总RNA并检测完整性。结果与其它四种提取方法相比,Qiagen试剂盒法提取的RNA条带清晰,OD260/OD280比值在1.8~2.0的范围内。结论 Qiagen试剂盒法适用于镰刀菌人工诱导白木香结香部位总RNA提取,对其它次生代谢物质含量较高的植物中提取总RNA具有一定的借鉴意义。     

一种新型人工结香沉香挥发性成分GC-MS分析

目的：采用多种方法处理“白木香通体造香技术”所结沉香,全面分析其挥发性成分。方法：分别采用固相微萃取法、动态顶空吹扫捕集法、丙酮萃取法三种前处理方法提取沉香药材中的挥发性成分并进行GC—MS分析。结果：三种方法共检测出113个化学成分,以倍半萜类、芳香族类成分为主,其中有67个成分是未报道过的;同时检出了沉香特征性有效成分沉香螺旋醇、苄基丙酮、甲基色酮。结论：通过对沉香样品中挥发性成分的全面分析,发现新方法所结沉香的化学成分与天然沉香相似,且含有天然沉香中的主要有效成分。     

白木香内生真菌的分离鉴定及诱导结香作用研究

目的 分离、纯化经通体结香技术诱导的白木香木质部真菌,筛选能够高效促进白木香产生优质沉香的菌株。方法 采用组织块分离法分离、纯化菌株,通过形态学特征结合内转录间隔区（ITS）序列分析鉴定真菌;将真菌菌液接种到白木香树4个月后进行功能验证;依据《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020年版沉香项下薄层色谱、浸出物含量测定、沉香四醇含量测定及特征图谱方法分析菌株诱导效果。结果 从白木香木质部中分离出48株真菌,优势菌株为镰刀菌;经刺盘孢菌属（Colletotrichum sp.）、黑曲霉Aspergillus niger、渐进绿木霉Trichoderma paraviridescens诱导的沉香薄层色谱斑点与对照药材一致;经镰刀菌属（Fusarium sp.）、黑曲霉、渐进绿木霉诱导的沉香浸出物质量分数均大于10%,与对照组差异有统计学意义（P<0.05）;经可可毛二孢菌Lasiodiplodia theobromae、黑曲霉、渐进绿木霉等6株菌诱导的沉香特征图谱与对照药材一致,沉香四醇质量分数均大于0.1%,与对照组差异有统计学意义（P<0.05）。结论 从白木香木质部分离出的内生真菌可诱导沉香形成,其中黑曲霉和渐进绿木霉能够较快速诱导白木香结香,结香所得的树脂品质符合《中国药典》2020年版标准。     

通体结香技术处理30 d产沉香的品质监测

目的 研究通体结香技术诱导沉香形成的作用过程。方法 根据《中华人民共和国药典》2020年版沉香质量标准,对通体结香技术处理30 d内产生的沉香样品进行性状、沉香四醇质量分数、结香面积比率、特征图谱分析,并对部分特征型倍半萜类和芳香类化合物进行含量测定。结果 通体结香技术处理白木香第4～5天,木间韧皮部和射线细胞出现树脂类物质,形成环形沉香层,沉香结香率由4.31%急剧上升至8.11%。结香30 d可形成明显的沉香层结构,薄层色谱和特征图谱结果与对照药材一致。沉香四醇质量分数在结香30 d内由0.001%增长至0.034%,整体呈上升趋势。部分芳香类化合物和沉香特征性倍半萜类化合物分别在第1~8天和第9~16天开始产生并累积。结论 通体结香技术处理30 d能够诱导沉香快速形成和稳定积累。     

沉香中苄基丙酮与浸出物含量相关性研究

目的:研究白木香结香过程中苄基丙酮与浸出物含量(%)之间的相关性。方法:采用气相色谱法测定样品中苄基丙酮含量。按中国药典(2010年版)一部沉香鉴别项下相关要求测定样品醇溶性浸出物的含量,并进行理化鉴别;应用"小孔滴注法"进行人工造香试验。结果:苄基丙酮浓度在5.780～104.0μg/mL(r=0.9997)及0.07500～28.20μg/mL(r=0.9995)范围内有良好的线性关系;加样回收率为99.9%～101.6%(n=6),RSD=0.65%。沉香商品药材中苄基丙酮与浸出物含量之间不呈正比关系。随着人工造香时间的增加,有些白木香结香部位的醇溶性浸出物和苄基丙酮含量均呈增加趋势;有些白木香结香部位醇溶性浸出物含量增加,而苄基丙酮含量呈下降趋势。结论:气相色谱法测定沉香中苄基丙酮含量操作简便,测定结果准确、重复性好;"小孔滴注法"人工造香技术快速可行,为沉香形成机理研究提供基础。     

沉香的醇浸出物和沉香四醇含量测定及品质分类

目的:分析与评价国内外沉香药材的质量,对沉香品质进行分类。方法:按2015年版《中国药典》一部沉香鉴别项下相关要求测定样品醇浸出物的含量;采用HPLC法,Altima C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,5μm),流动相乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)梯度洗脱,流速0.7 mL·min~(-1),检测波长252 nm,柱温30℃,测定样品中的沉香四醇含量;结合醇浸出物和沉香四醇含量结果探讨沉香品质分类。结果:沉香四醇在2.0~750.0μg(r=0.999 6)与其峰曲线下面积呈良好的线性关系,平均回收率为102.1%,RSD 2.8%。52种沉香样品中沉香四醇质量分数在0.10%~6.60%,醇浸出物质量分数为6.07%~57.06%。沉香醇浸出物与结香方式、种源无相关性。沉香四醇含量高低与种源、结香方式有一定的相关性。种源为白木香的人工和天然沉香2种结香方式中沉香四醇平均质量分数分别为0.67%,0.15%,两者比较有显著差异(P0.01);天然沉香种源为Aquilaria malaccensis与A.crassna,沉香四醇平均质量分数分别为2.57%,0.70%,两者有差异(P0.05);与白木香(0.15%)有显著差异(P0.01))。结论:沉香按沉香四醇含量高低进行品质分类具有一定的合理性。     

真菌诱导白木香产生沉香的野外实验与分析

 目的 采用野外小规模实验和室内分析相结合的方法验证3株真菌YNAS04、YNAS06和YNAS08诱导白木香产生沉香的可行性。方法 采用真菌诱导法诱导白木香产生沉香,利用气相-质谱联用技术（GC-MS）对诱导结香材料挥发油成分中的化合物进行检测,通过比对诱导材料高频菌与原接入菌的形态及核糖体基因内部转录间隔区序列（internal transcribed spacer,ITS）一致性来验证接入菌的有效性。结果 3株真菌定植于白木香6个月,YNAS04、YNAS06和YNAS08诱导产生材料的重量分别为（1.786±0.473）,（2.964±0.492）和（3.615±0.591） g,高于空白对照（1.325±0.407） g和阴性对照（1.462±0.417） g。GC-MS检测到3株活性真菌诱导材料含有代表沉香品质的主要化学成分倍半萜类化合物和色原酮类似物。菌种验证结果表明,3株活性真菌在诱导材料中为优势菌,分别占分离菌种的90.0%,97.5%和91.25%。结论 利用3株活性真菌诱导白木香产生沉香可以应用于实际生产,是可持续、高效生产沉香的良好方法。     

基于PCR-DGGE技术分析白木香结香前后内生细菌的变化

目的比较结香与未结香白木香内生细菌群落结构及变化,探讨内生细菌在白木香结香过程中的作用。方法分别提取结香与未结香白木香总DNA,采用细菌16s r DNA通用引物进行扩增,聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳(Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,PCR-DGGE)比较各样品内生细菌群落结构差异,结合样品薄层色谱(TLC)分析,研究活性成分与内生细菌的关联。结果多食鞘氨醇杆菌Sphingobacterium multivorum在未结香白木香中普遍存在。结香后,内生细菌丰富度和多样性明显增加,PCR-DGGE图谱聚类表明,绝大部分结香样品细菌群态相似性较高,聚在一起;非结香样品间的细菌群态相似性也较高。结论白木香结香前后内生细菌群落存在明显差异,内生细菌可能参与白木香的结香过程。     

高压输液法沉香通体结香技术的结香效果及所产沉香品质分析

目的：评价高压输液法用于通体结香技术的可行性。方法：分别在常压和10、20、30 MPa压力下采用通体结香技术处理白木香,记录输液时间,筛选最佳高压输液压力;在晴天、夜晚、雨天和低温4种不同结香环境条件下采用常压和高压输液处理,记录输液时间,根据《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》） 2020年版沉香质量标准,对处理6个月的沉香样品进行性状、显微观察,浸出物、结香率、沉香四醇质量分数、特征图谱分析。结果：20 MPa为高压输液法通体结香技术最佳输液压力,可显著缩短通体结香技术不同结香环境条件下的输液时间,输液效率提高129%～497%。20 MPa压力下通体香品质均符合《中国药典》 2020年版标准,沉香层呈棕黑色,环形沉香层外有棕色星点状沉香外溢现象;平均结香率、浸出物平均质量分数和沉香四醇平均质量分数分别为11.69%、15.14%和0.45%,与常压差异无统计学意义;薄层色谱和特征图谱检测结果与对照药材一致。结论：高压输液法通体结香技术能明显提高该技术的输液效率,既不受天气和气候影响,也不降低结香品质。该技术具有较强的可行性,可在实际生产中推广应用。