通络救脑注射液对Aβ_(1-40)致脑微血管内皮细胞损伤的保护作用

目的探讨通络救脑注射液及其有效成分对脑微血管内皮细胞的保护作用及机制。方法建立β淀粉样蛋白(Aβ_(1-40))致人脑微血管内皮细胞(h BMECs)损伤模型,用通络救脑注射液及其有效单体成分京尼平苷、人参皂苷Rg1干预,采用CCK-8染色法测定细胞活性,检测条件培养液中乳酸脱氢酶(LDH)漏出量,Western blot法检测h BMECs高度糖基化终产物受体(RAGE)的表达。结果通络救脑注射液及其有效单体成分京尼平苷、人参皂苷Rg1可显著提高Aβ_(1-40)损伤的h BMECs活性,减少细胞损伤后LDH的漏出和h BMECs RAGE的表达,与模型组比较,差异均有统计学意义(P0.05,P0.01)。结论通络救脑注射液及其有效单体成分京尼平苷、人参皂苷Rg1可提高Aβ_(1-40)损伤的h BMECs的活性,对其具有保护作用,其机制可能与减少血管内皮细胞RAGE的表达有关。     

通络救脑注射液对Aβ1-42诱导原代大鼠脑微血管内皮细胞氧化应激反应及细胞凋亡的影响

目的：探讨通络救脑注射液对Aβ诱导下原代大鼠脑微血管内皮细胞氧化应激反应及细胞凋亡因子Caspase-3蛋白表达的影响。方法：模型组以Aβ1-42加入内皮细胞培养基中制备阿尔茨海默病（AD）内皮细胞损伤模型,通络救脑注射液（简称TLJN）组在造模前先行加入通络救脑注射液干预。采用生化法检测各组内皮细胞中MDA含量、SOD活性,运用Western Blot法检测各组Caspase-3蛋白表达。结果：TLJN组能明显降低AD内皮细胞损伤模型中MDA含量、提高SOD活性;抑制Caspase-3蛋白表达。结论：在本实验观察范围内,通络救脑注射液对Aβ诱导下原代大鼠脑微血管内皮细胞的凋亡有抑制作用,其作用机制可能是通过提高SOD抗氧化酶活性、降低MDA含量,进而下调Caspase-3蛋白表达以抑制细胞凋亡。     

通络救脑注射液及其组分对拟缺血损伤脑微血管内皮细胞GluR3表达及其功能的影响

目的:观察通络救脑注射液及其有效组分对拟缺血损伤脑微血管内皮细胞谷氨酸受体3(glutamate receptor 3,GluR3)表达及其功能的影响。方法:采用大鼠原代培养脑微血管内皮细胞,氧糖剥夺法制备拟缺血模型,分别用通络救脑注射液及其2组分栀子苷、三七总皂苷对细胞进行干预,采用PCR和免疫蛋白印迹法检测各组细胞中GluR3 mRNA及蛋白表达水平,并用免疫蛋白印迹法检测GluR3调节的下游分子基质金属蛋白酶诱导因子CD147、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的蛋白表达情况。结果:通络救脑注射液及其组分能够从基因到蛋白水平显著下调GluR3的表达,对CD147、MMP-9也有显著下调作用,且通络救脑注射液疗效优于2组分。结论:通络救脑注射液及其组分可调节拟缺血损伤脑微血管内皮细胞GluR3的表达及其功能,这可能是其在脑缺血性损伤中保护血脑屏障、减轻炎症反应的机制之一。通络救脑注射液效果优于2组分,显示了复方配伍发挥整合调节的疗效优势。     

不同状态的大鼠星形胶质细胞条件培养液对脑微血管内皮细胞血脑屏障特征性酶的影响

目的：探讨不同状态下大鼠星形胶质细胞（AS）条件培养液对脑微血管内皮细胞（BMEC）活性和血脑屏障特征性酶的影响,以及通络救脑注射液对此过程的干预作用。方法：收集正常、激活、激活合并通络救脑注射液处理、损伤、损伤合并通络救脑注射液处理5种不同状态的星形胶质细胞条件培养液,分别作用于拟缺血损伤的脑微血管内皮细胞,采用MTT法检测细胞活性,微量酶标仪法和上机比色法检测碱性磷酸酶（AKP）、γ-谷氨酰胺转肽酶（γ-GT）的活性。结果：正常星形胶质细胞条件培养液能明显提高受损内皮细胞活性,诱导AKP、γ-GT活性增强,激活的星形胶质细胞条件培养液上述作用下降,而损伤后的星胶条件培养液对受损内皮细胞几乎无作用。通络救脑注射液作用于激活和损伤星形胶质细胞后,其条件培养液提高内皮细胞活性和AKP、γ-GT活性的作用显著增强。结论：正常AS的分泌产物对提高BMEC的活性和维持血脑屏障特性具有重要意义,AS受损后,该作用减弱或消失,通络救脑注射液可显著提高AS对受损BMEC活性和功能的保护作用,这可能是该药物发挥脑缺血性损伤后血脑屏障稳定作用的内在机制之一。     

通络救脑注射液对氧糖剥夺大鼠脑微血管内皮细胞分泌巨噬细胞炎性蛋白-1β的影响

[目的]观察通络救脑注射液对氧糖剥夺损伤(OGD)的大鼠脑微血管内皮细胞条件培养液中巨噬细胞炎性蛋白-1β(MIP-1β)分泌情况及其受体--趋化因子受体5(CCR5)表达的影响.[方法]氧糖剥夺法建立内皮细胞OGD模型,酶联免疫银光法(ELISA)法检测脑微血管内皮细胞条件培养液中MIP-1β含量的变化,免疫组化法及Western blot法观察内皮细胞中MIP-1β及其受体CCR5的表达情况.[结果]OGD组的内皮细胞分泌大量MIP-1β至上清液,该组内皮细胞胞浆大量表达MIP-1β,同时CCR5的蛋白表达量亦随之上升,加入通络救脑注射液的OGD组,其上清液中MIP-1β分泌量显著性下降(P<0.01),MIP-1β及其受体CCR5在内皮细胞上的表达也有不同程度的下降.[结论]通络救脑注射液能够抑制OGD损伤时内皮细胞M1P-1β的分泌,减少MIP-1β和CCR5的表达,对内皮细胞缺氧损伤后趋化因子释放的抑制是其发挥解毒通络药效的途径之一.     

大鼠脑微血管内皮细胞条件培养液对皮层神经元活性的影响以及通络救脑注射液的干预作用

目的:探讨脑微血管内皮细胞条件培养液对神经元活性的影响,以及通络救脑注射液对此过程的干预作用。方法:制备正常、正常用药、拟缺血损伤、拟缺血损伤用药4种脑微血管内皮细胞条件培养液(N-CM、NT-CM、I-CM、IT-CM),分别作用于培养的皮层正常神经元和拟缺血损伤神经元,通过四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法、乳酸脱氢酶(LDH)漏出率检测分析各个条件培养液对神经元活性的影响特征。结果:①N-CM对正常神经元无明显影响,但对拟缺血损伤的神经元表现出一定的保护作用,尤其是NT-CM可明显提高受损的神经元活性;②I-CM可降低正常神经元活性,对已受损的神经元则进一步加重损伤,IT-CM可明显改善这种损伤状态。结论:脑微血管内皮细胞的旁分泌作用可能在中枢系统缺血性损伤中起重要作用,有可能是不能透过血脑屏障的中药成分发挥治疗作用的靶点。     

脑微血管内皮细胞条件培养液对体外培养正常神经元的影响

目的:探讨体外模拟脑缺血再灌注损伤条件下及通络救脑注射液干预下脑微血管内皮细胞条件培养液(CMEX-CM)对体外正常培养神经元的影响.方法:先分别进行大鼠大脑微血管内皮细胞和神经元的分离纯化培养及建立体外模拟脑缺血再灌注损伤模型,然后用收集的CMECs～CM 1:1和1:5的浓度作用于体外培养的神经元,MTT法测定神经元的活性、存活率,western～blot检测NF-KB的表达.结果:脑微血管内皮细胞条件培养液可影响神经元生存活性,应用中药通络救脑注射液作用于脑微血管内皮细胞后收集的条件培养液可明显提高神经元的生存活性,可以提高神经元中NF-KB的表达.     

脑微血管内皮细胞条件培养液对体外培养正常神经元的影响

目的:探讨体外模拟脑缺血再灌注损伤条件下及通络救脑注射液干预下脑微血管内皮细胞条件培养液(CMEX-CM)对体外正常培养神经元的影响.方法:先分别进行大鼠大脑微血管内皮细胞和神经元的分离纯化培养及建立体外模拟脑缺血再灌注损伤模型,然后用收集的CMECs～CM 1:1和1:5的浓度作用于体外培养的神经元,MTT法测定神经元的活性、存活率,western～blot检测NF-KB的表达.结果:脑微血管内皮细胞条件培养液可影响神经元生存活性,应用中药通络救脑注射液作用于脑微血管内皮细胞后收集的条件培养液可明显提高神经元的生存活性,可以提高神经元中NF-KB的表达.     

通络救脑口服液对快速老化模型小鼠RAGE和Aβ的影响

目的探讨通络救脑口服液对快速老化模型(SAMP8)小鼠晚期糖基化终末产物受体(RAGE)和淀粉样蛋白β(Aβ)表达的影响。方法 24只SAMP8小鼠随机分为模型组、通络救脑高、低剂量组(9,6 m L·kg~(-1)·d~(-1)),另设抗快速衰老亚系1(SAMR1)小鼠对照组(正常对照组),连续灌胃给药21 d。取海马区脑组织,分别采用酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫组织化学法检测小鼠大脑海马内Aβ以及RAGE的表达。结果与模型组比较,通络救脑高、低剂量组海马区脑组织RAGE和Aβ表达降低(P0.01),RAGE蛋白含量明显降低(P0.01)。结论通络救脑口服液可通过抑制海马区脑组织RAGE和Aβ的表达,以减轻RAGE和Aβ介导的神经病理损伤作用。     

不同内皮细胞条件培养液对皮层神经元线粒体功能的影响及通络救脑注射液的保护作用

目的探讨脑微血管内皮细胞条件培养液对损伤神经元线粒体功能的影响,以及通络救脑注射液对此过程的干预作用。方法制备（1）正常内皮细胞条件培养液（N—CM）：正常培养的内皮细胞不作任何处理;（2）正常用药内皮细胞条件培养液（NT—CM）：通络救脑注射液按1μl／ml浓度作用10h;（3）缺氧损伤内皮细胞条件培养液（I-CM）;（4）缺氧损伤用药内皮细胞条件培养液（IT—CM）：于损伤前4h,加入通络救脑注射液1μl／ml;分别作用于糖氧剥夺损伤的神经元模型,通过测定神经元线粒体活性、线粒体膜电位（MMP）及细胞色素C（CytC）,分析各个条件培养液对损伤神经元线粒体功能的影响。结果（1）与模型组比较,N—CM组与NT—CM组（P〈0．05）均可阻抑损伤神经元线粒体活性的下降,尤其是NT—CM保护作用更为明显。（2）与正常组比较,模型组MMP明显下降;I-CM使受损神经元的线粒体功能进一步下降;I-CM组可进一步降低受损神经元MMP,IT—CM可逆转神经元MMP下降,明显改善这种损伤状态。（3）N-CM组与NT—CM组均可降低损伤神经元的CytC释放,分别与模型组、I—CM组比较,差异均有显著性（P〈0．05）。结论脑微血管内皮细胞的旁分泌功能对损伤神经元的存活有重要的调节作用,该作用的实现可能与维持神经元线粒体功能有关,通络救脑注射液可促进该作用的发挥。     

Semaphorin 3A在局灶性脑缺血大鼠脑组织中的表达特征及通络救脑注射液的保护作用

目的:观察局灶性脑缺血损伤后大鼠脑组织中Semaphorin 3A(Sema 3A)蛋白表达水平,以及通络救脑注射液对该因子表达的影响.方法:以线拴法制作大鼠大脑中动脉缺血模型(MCAO),设正常组、模型组及通络救脑注射液组,分别在造模后12h、24h、3d、7d,共4个时间点采取动物脑组织,测定脑梗死体积及脑组织中GAP43的表达水平,及Sema 3A的表达部位和蛋白表达水平.结果:通络救脑注射液能够减少脑缺血动物脑梗死体积,与模型组相比均有显著差异.结论:大鼠脑缺血损伤后Sema 3A表达增加与神经元的坏死有相关性,通络救脑注射液能够降低其表达水平,对缺血损伤的脑组织发挥保护作用.     

Semaphorin 3A在局灶性脑缺血大鼠脑组织中的表达特征及通络救脑注射液的保护作用

目的：观察局灶性脑缺血损伤后大鼠脑组织中Semaphorin 3A（Sema 3A）蛋白表达水平,以及通络救脑注射液对该因子表达的影响。方法：以线拴法制作大鼠大脑中动脉缺血模型（MCAO）,设正常组、模型组及通络救脑注射液组,分别在造模后12h、24h、3d、7d,共4个时间点采取动物脑组织,测定脑梗死体积及脑组织中GAP43的表达水平,及Sema 3A的表达部位和蛋白表达水平。结果：通络救脑注射液能够减少脑缺血动物脑梗死体积,与模型组相比均有显著差异。结论：大鼠脑缺血损伤后Sema 3A表达增加与神经元的坏死有相关性,通络救脑注射液能够降低其表达水平,对缺血损伤的脑组织发挥保护作用。     

通络救脑口服液对SAM鼠RAGE-Aβ途径的影响

摘要 目的：探讨通络救脑口服液(TLJN)对快速老化模型（SAM）小鼠晚期糖基化终末产物受体（RAGE)和淀粉样蛋白β(Aβ)表达的影响。方法：以雄性快速老化模型小鼠-8（SAMP8）为实验动物,随机分为：模型组（model）、TLJN低剂量组(TLJNmin)、TLJN高剂量组(TLJNmax),SAMR1小鼠为正常对照组(control),每组10只,连续给药21天,处死后,分别采用酶联免疫吸附测定（ELISA）和免疫组织化学的方法检测SAMP8小鼠脑内Aβ以及RAGE的表达。结果：与模型组相比,TLJN用药组脑内海马区RAGE和Aβ表达降低,且高剂量组降低程度较低剂量组明显,但二者之间没有显著差异。结论：TLJN可以通过影响脑组织RAGE和Aβ的表达,从而减轻RAGE-Aβ途径介导的神经病理损伤作用。     

六味地黄丸和通络救脑滴丸对2种痴呆模型小鼠脑组织Aβ降解的影响

目的：分析六味地黄丸和通络救脑滴丸对“肾精不足”和“毒损脑络”2种不同痴呆症模型动物脑组织Aβ降解的影响。方法：通过SAMP8小鼠和在SAMR1小鼠双侧海马区注射Aβ1-40分别复制痴呆动物模型,采用水迷宫测定行为功能学,免疫组织化学染色（IHC）法检测海马和皮层中Aβ的表达,Western Blotting法检测海马和皮层中胰岛素降解酶（IDE）、低密度脂蛋白相关蛋白1（LRP1）和晚期糖基化终末产物受体（RAGE）蛋白的表达。结果：2种痴呆模型在游速、避暗错误次数、错误区时间、脑组织海马和皮层中IDE、RAGE和海马中LRP1等蛋白的表达,差异均有统计学意义（均P<0.05）;与双侧海马区注射Aβ1-40模型小鼠比较,SAMP8模型小鼠的游速和避暗错误次数下降,脑组织中RAGE表达升高,IDE和LRP1表达降低;通络救脑滴丸对改善双侧海马注射Aβ1-40模型小鼠的避暗潜伏期、脑组织海马区IDE和RAGE的表达水平作用明显;六味地黄丸对改善SAMP8模型小鼠水迷宫寻台成功率、避暗潜伏期、脑组织皮层和海马区IDE表达和海马Aβ的表达水平作用明显。结论：六味地黄丸可改善“肾精不足”证痴呆模型小鼠脑组织Aβ清除障碍,通络救脑滴丸可改善“毒损脑络”证痴呆模型小鼠脑组织Aβ清除障碍。     

复方通络救脑促进神经细胞突触可塑性

目的: 检测中药复方通络救脑及其主要成分三七总皂苷和京尼平苷对神经突触可塑性有无促进作用。 方法: 实验分为对照组和给药组,采取细胞活力检测法,即CCK-8检测法检测药物对稳转的过表达的瑞典型突变淀粉前体蛋白(swAPP)突变的人神经母细胞瘤(SY5Y)细胞的增殖曲线的影响;通过Western blotting检测药物对于神经细胞突触相关蛋白树突棘肌动蛋白结合蛋白(drebrin)和突触后密度蛋白-95(PSD-95)的表达的变化;用神经生长因子(NGF)诱导PC12细胞长出神经突起后,检测药物对于细胞突起的作用。 结果: 复方通络救脑及其主要组成成分京尼平苷和三七总皂苷不影响过表达的瑞典型突变淀粉样前体蛋白的神经母细胞瘤(swAPP-SY5Y)的细胞增殖曲线,且复方通络救脑中京尼平苷能够显著增加swAPP-SY5Y细胞drebrin和PSD-95的表达(P<0.01),显著增加PC12细胞总突起数(P<0.01);而三七总皂苷没有相应的作用。 结论: 复方通络救脑能促进神经细胞的突触可塑性,初步断定起主要作用的成分是京尼平苷而不是三七总皂苷。     

Aβ1-40脑内注射对大鼠海马超氧化物歧化酶丙二醛的影响及通络救脑口服液的干预作用

目的 观察通络救脑口服液对β-淀粉样蛋白1 - 40 (Aβ1-40 )诱导的AD模型大鼠海马SOD活性和MDA蛋白表达的影响.方法 选用140只SD雄性大鼠随机分为空白对照组、假手术组、模型组、盐酸多奈哌齐组、通络救脑口服液各剂量组(12,24,48 mg·kg-1·d-1)共7组,每组20只.采用海马立体定向注射凝聚态Aβ1 - 40建立老年性痴呆(Alzheimer's disease, AD)动物模型.药物干预4周,第5周应用分光光度法检测大鼠大脑海马组织SOD、MDA蛋白的表达.结果 与空白对照组比较,模型组SOD活性明显降低(P<0.05),而MDA含量明显升高(P<0.05);与模型组比较,盐酸多萘哌齐组、通络救脑口服液各剂量组SOD活性明显升高(P<0.05),而MDA含量明显降低(P<0.05).结论 通络救脑口服液通过上调SOD的活性和抑制MDA的表达而发挥其抗氧化治疗老年性痴呆的作用.     

通络救脑注射液对大鼠脑缺血再灌注损伤脑保护的IGF-1途径分析

目的:观察通络救脑注射液对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用及探讨其发挥保护作用的可能途径.方法:以线栓法构建大鼠大脑中动脉局灶缺血再灌注损伤模型,实验动物随机分为假手术组、模型组、通络救脑药物组、阳性药对照(依达拉奉)组.各设3个时间点,分别为脑缺血再灌注后24h、3d和7d,以TTC染色法测定脑组织梗死体积;以酶联免疫(ELISA)、免疫组化法分别检测血清、脑组织匀浆IGF-1表达水平及表达部位.结果:通络救脑注射液能显著减小各时间点的大鼠脑梗死体积比;缺血再灌注3d通络救脑组大鼠血清IGF-1水平显著升高,模型组和通络救脑组大鼠脑匀浆IGF-1水平与假手术组比较显著提高;免疫组化亦提示缺血侧皮层IGF-1的阳性表达面积比在通络救脑组均显著高于相应时间点的模型组.结论:通络救脑注射液能显著减小局灶性脑缺血再灌注大鼠的脑梗死体积,且与提高IGF-1的表达有关.     

三七总皂苷对拟缺血脑微血管内皮细胞RIG-I表达的影响

目的:研究三七总皂苷对拟缺血损伤的脑微血管内皮细胞维甲酸诱导基因-I(Retinoic Acid-inducible Gene-I,RIG-I)的影响。方法:采用原代培养大鼠脑微血管内皮细胞(Brain Microvascular Endothelial Cell,BMEC),氧糖剥夺法制备拟缺血损伤模型,首先用不同浓度梯度的三七总皂苷进行干预,筛选出三七总皂苷的最佳用药浓度,然后分别采用荧光定量PCR和免疫蛋白印迹法检测各组细胞中RIG-I mRNA及蛋白的表达水平。结果:三七总皂苷在22μg/m L浓度时能够显著提高拟缺血损伤脑微血管内皮细胞的活性,同时能够从基因和蛋白水平下调RIG-I的表达。结论:三七总皂苷对拟缺血损伤脑微血管内皮细胞具有保护作用,提示三七总皂苷在缺血性脑损伤中使RIG-I的表达下调可能是其发挥抗炎作用的内在分子机制之一。     

通络救脑注射液对大鼠脑缺血再灌注损伤脑保护的IGF-1途径分析

目的:观察通络救脑注射液对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用及探讨其发挥保护作用的可能途径。方法:以线栓法构建大鼠大脑中动脉局灶缺血再灌注损伤模型,实验动物随机分为假手术组、模型组、通络救脑药物组、阳性药对照(依达拉奉)组。各设3个时间点,分别为脑缺血再灌注后24h、3d和7d,以TTC染色法测定脑组织梗死体积;以酶联免疫(ELISA)、免疫组化法分别检测血清、脑组织匀浆IGF-1表达水平及表达部位。结果:通络救脑注射液能显著减小各时间点的大鼠脑梗死体积比;缺血再灌注3d通络救脑组大鼠血清IGF-1水平显著升高,模型组和通络救脑组大鼠脑匀浆IGF-1水平与假手术组比较显著提高;免疫组化亦提示缺血侧皮层IGF-1的阳性表达面积比在通络救脑组均显著高于相应时间点的模型组。结论:通络救脑注射液能显著减小局灶性脑缺血再灌注大鼠的脑梗死体积,且与提高IGF-1的表达有关。     

通络救脑注射液对脑缺血大鼠脑皮质梗塞灶Glu及其NMDA受体表达的影响

目的 :观察通络救脑注射液对脑缺血大鼠脑皮质梗塞灶Glu及其NMDA受体表达的影响。方法 :采用三氯化铁致大脑中动脉血栓形成大鼠脑缺血模型 ,免疫组织化学方法及图像分析 ,统计使用t检验。结果 :模型组大鼠脑皮质梗塞灶Glu及其NMDA受体表达与假手术对照组比较明显增强 ,通络救脑注射液各组大鼠脑皮质梗塞灶Glu及其NMDA受体表达与模型组比较明显降低。结论 :通络救脑注射液能明显降低Glu及NMDA受体在脑缺血大鼠脑皮层梗塞灶的表达