幽门螺杆菌cagA基因片段原核表达载体的构建及其cagA基因和CagA蛋白及感染者血清抗体的检测

目的:构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)cagA基因片段的原核表达系统,建立ELISA检测CagA及其抗体,了解表达CagA的Hp菌株(CagA Hp)感染与所致疾病种类的关系.方法:从快速尿素酶试验阳性的156例患者胃黏膜活检标本中分离Hp.采用PCR检测109株Hp cagA基因,并从临床菌株Y06中扩增2 148 bp的cagA基因片段(cagA1).构建cagA1原核表达系统,用SDS-PAGE检查目的重组蛋白(rCagA1)的表达情况,用Western blot和免疫双扩散试验鉴定rCagA1的免疫反应性和抗原性.建立ELISA,检测109株Hp CagA表达和相应患者血清中CagA抗体.分析CagA Hp感染与胃炎和消化性溃疡的关系.结果:80.8%胃黏膜活检标本中分离出Hp(126/156),97.2%的Hp菌株(106/109)cagA基因阳性.与文献报道比较,所克隆的cagA1片段核苷酸和氨基酸序列同源性分别为94.83%和93.30%.所构建的原核表达系统表达的rCagA1量约为细菌总蛋白的30.0%.rCagA1能与Hp全菌抗体发生结合反应,免疫家兔产生双扩散效价为1∶4的抗体.92.6%菌株(101/109)可表达CagA,88.1% 患者(96/109)血清CagA抗体阳性.消化性溃疡标本中CagA Hp菌株分离阳性率(97.9%)高于胃炎标本(88.5%),但无统计学差异(χ2=3.48,P>0.05).结论:本实验构建的原核表达系统表达的rCagA1有良好的免疫反应性和抗原性,建立的ELISA可用于Hp CagA及其抗体的检测,分离的Hp菌株cagA基因携带率和CagA表达率均很高.消化性溃疡和胃炎与其感染的Hp是否表达CagA无明显关系.     

幽门螺杆菌CagA抗原性多态性分析

目的 了解我国幽门螺杆菌CagA抗原性的多态性，为临床血清学诊断CagA阳性菌株感染提供实验依据，以及是否存在特定胃十二指肠疾病相关的CagA抗原性型提供线索。方法 采用Western blots方法，比较38株我国幽门螺杆菌分离株的CagA与3种不同胃肠疾病分离株兔免疫血清的反应强度。分析不同抗原性类型CagA与疾病的关系。结果 任何一种血清均不能识别所有CagSA，但任一CagA至少可被一种血清识别，多数菌株CagA的抗原性与CAPM N62接近；抗原性与NCTC11637接近的CagA可能与消化性溃疡相关，但不显著。结论 我国不同幽门螺杆菌菌株CagA抗原性存在明显多态性，血清学方法诊断CagA阳性菌株感染时应至少使用3种抗原或抗体，不同抗原性类型CagA与胃十二指肠疾病的关系有待进一步研究。     

人幽门螺杆菌26 000外膜蛋白与热休克蛋白双价疫苗的构建和表达及抗原性研究

目的构建含人幽门螺杆菌(Hp)热休克蛋白A(HspA)和26 000外膜蛋白(OMP)编码基因的重组载体,进行核苷酸序列分析,并在大肠杆菌BL21中表达,研究其抗原性,为疫苗的开发奠定基础.方法利用分子克隆技术从Hp DNA染色体中,扩增HspA编码基因片段,将目的基因HspA与载体pET32a(+)经kpnⅠ、BamH I 双酶切后,进行连接、测序;同时将重组载体pET32a(+)/HspA和pET32a(+)/Omp26分别经Hind Ⅲ、BamH I 双酶切, 通过凝胶电泳回收pET32a(+)/HspA和26 000 OMP DNA片段,经T4连接酶将HspA和26 000 OMP编码基因通过酶切粘端进行连接,而后转化并筛选含有两种目的基因的重组载体,并在大肠杆菌BL21(DE30)中表达,表达产物经纯化后,以western 印迹法检测其抗原性.结果经酶切、测序分析表明,插入的基因片段为Hp HspA和26 000外膜蛋白编码基因,由951bp组成,与GenBank报道的相比较,有1.15%的bp发生变异,1.26%的氨基酸残基改变;经SDS-PAGE分析发现,融合基因表达的蛋白相对分子质量(Mr)为59×103 ,其中pET32a(+)表达的蛋白Mr约为20×103,可溶性表达产物占全菌总蛋白的19.96 %;重组蛋白经含Ni2+琼脂糖树脂纯化后,其纯度达95%以上;western 印迹法检测显示,该重组蛋白可被Hp阳性患者的血清及抗26 000 OMP单克隆抗体所识别,具有良好的抗原性.结论成功地克隆并融合表达了Hp HspA和26 000 OMP,为Hp蛋白质疫苗和核酸疫苗的研制和快速诊断试剂盒的研究奠定了良好的基础.     

幽门螺杆菌CagA基因的原核表达及抗原性测定

目的：合成胃癌相关幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)的 CagA基因片段,建立原核表达系统,鉴定重组表达产物的抗原性。方法：选取前期研究确定的与胃癌相关的H.pylori CagA基因片段,优化设计并合成CagA基因,将合成的CagA基因从pUC57-CagA质粒中切出,用表达载体pET32a携带该基因转化宿主菌BL21(DE3),通过氨苄青霉素抗性筛选和菌落PCR挑选出阳性克隆pET32a-CagA;以IPTG诱导含pET32a-CagA的宿主菌表达融合蛋白,经SDS-PAGE凝胶电泳分析CagA蛋白表达情况,用Western印迹鉴定融合蛋白的抗原性。结果：设计并人工合成了CagA基因片段,序列测定结果显示,合成的CagA基因序列与设计的序列（AF289435）基本一致;成功构建pET32a-CagA原核表达质粒,对应蛋白序列与AAG09884同源性为100%;含pET32a-CagA的BL21(DE3)宿主菌经IPTG诱导后能表达CagA融合蛋白,经SDS-PAGE凝胶电泳分析结果表明,融合蛋白相对分子质量大小与预期一致(45 kD);Western印迹检测结果显示该融合蛋白可与抗H.pylori全菌抗体结合反应。结论：本实验构建的原核表达系统表达的CagA融合蛋白具有良好的抗原性,为临床胃癌相关H.pylori菌株的筛选和针对性治疗奠定了基础。     

幽门螺杆菌粘附素基因alpA的克隆与高效表达

目的 克隆并表达幽门螺杆菌粘附素AlpA基因。方法 提取幽门螺杆菌染色体基因，用PCR方法扩增alpA基因，将其克隆至表达载体pET-22B( ),转化大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导表达。结果 分离得到了1.5kb的alpA基因片段，并在大肠杆菌中实现了该基因的高效表达，在37℃诱导表达3h后，表达产物占细菌总蛋白的31．9％。表达以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在，其中主要是包涵体的形式，目的蛋白占不溶性蛋白的64．8％。结论 幽门螺杆菌alpA基因的克隆与表达为Hp疫苗的研制打下了基础。     

幽门螺杆菌外膜蛋白的基因克隆及表达

目的：克隆及表达幽门螺杆菌（Hp)相对分子质量为18000的外膜蛋白基因,为Hp的疫苗开发,快速诊断试剂盒的研究奠定基础。方法：用PCR从Hp染色体DNA扩增该外膜蛋白的基因片段,将目的基因,pQE30质粒同时分别经限制性内切酶BamHⅠ,HindⅢ酶切,纯化,连接,转染,筛选以及表达含插入片段的重组载体。结果;经酶切,测序分析插入的基因片段为表达Hp相对分子质量为18000外膜蛋白基因,与文献相比：有2％碱基发生变异,以1．68％氨基酸残基改变,同源性可达到98％以上,SDS－PAGE显示;表达产物相对分子质量为18000,可溶性表达占全菌的18％以上;ELISA法显示：该蛋白可被Hp全菌抗血清识别。结论：Hp外膜蛋白基因克隆表达产物具有良好的抗原性,将有可能成为一种有效蛋白质疫苗以及快速诊断试剂盒用于Hp感染的防治和检测。     

幽门螺杆菌尿素酶A基因的克隆、表达及其抗原性的鉴定

目的构建幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)标准株NCTC11639尿素酶A(UreaseA,UreA)编码基因的重组质粒,测定、分析其核酸序列,并在E.coli中表达,研究其抗原性。方法应用PCR技术从HpDNA染色体中扩增UreA编码基因片段,将其克隆至pMD18-T载体上进行序列测定,并与GenBank上公布的其它Hp菌株基因序列进行比较,再将目的基因克隆至表达载体pGEX-4T-1上进行表达和纯化,用Western-blot检测产物的抗原性并用于对24株抗Hp全菌小鼠单克隆抗体的鉴定。结果扩增的UreA基因全长675bp(登录号为DQ141577),与GenBank上公布的其它Hp菌株的UreA核酸序列的同源性为95%～98%,表达的UreA融合蛋白分子量为52000,表达产物可被病人血清和全菌免疫的小鼠血清识别,29株抗Hp小鼠单克隆抗体中有4株是针对UreA抗原的。结论重组UreA具有较好的抗原性,为Hp检测试剂和疫苗的研究奠定基础。     

幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A绿色荧光蛋白真核表达载体的构建

目的构建含幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A（CagA）基因片段的绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-CagA。方法从幽门螺杆菌细胞株中扩增出CagA基因片段,经回收、纯化,连接到质粒pGEM-T上,测序、酶切后与质粒pEGFP-C3连接,脂质体法将pEGFP-C3-CagA转染入胃癌细胞株BGC823,用荧光显微镜观察转染的细胞。结果通过测序、酶切证明CagA插入质粒正确,构建出载体pEGFP-C3-CagA,转染后经荧光显微镜观察到胃癌细胞株BGC823中有绿色荧光。结论成功构建表达CagA的真核绿色荧光载体。     

幽门螺杆菌细菌毒素VacA和CagA研究进展

<正>幽门螺杆菌(Helicobacter Pylori,HP)感染很常见,大约一半以上的世界人口感染了HP。HP被认为是慢性胃炎、消化性溃疡的主要病因,且与胃癌的发生密切相关,WHO将HP列为第1类致病因子。空泡细胞毒素(Vacuolating Cytotoxin,VacA)和细胞毒素相关蛋白(Cytotoxin associated Protcin A,CagaA)是HP的两个重要的毒力因子,在HP的致病过程中起重要作用。重视HP细菌毒素的研究,对消化性溃疡和胃癌的防治都有十分重要的意义。     

不同幽门螺杆菌临床分离株的菌体蛋白

目的：了解不同幽门螺杆菌的菌体蛋白构成及其免疫印迹条带与胃十二指肠疾病的关系。方法：将６株幽门螺杆菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ，Ｈｐ）临床分离株的菌体蛋白进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳＰＡＧＥ），以免疫印迹技术分析其免疫原性；以６株Ｈｐ菌体蛋白的等量混合物为抗原，检测了６２例胃十二指肠疾病患者血清抗ＨｐＩｇＧ的免疫印迹条带。结果：凝胶上６株Ｈｐ的菌体蛋白条带非常相似，均含６７．０ｕ、６５．０ｕ、５７．０ｕ３条主要蛋白条带，但各主要蛋白条带的含量在６株Ｈｐ中各不相同（薄层扫描法）；除共同含有６７．０ｕ、５７．０ｕ、５５．０ｕ、５２．０ｕ４条免疫反应条带外，６株Ｈｐ的其余免疫反应条带的检出率及颜色深浅有明显差异；２４．８ｕ免疫反应条带在胃癌组的检出比例（１１／１２）显著高于胃溃疡组（４／１３）、十二指肠溃疡组（７／１４）和慢性胃炎组（１／１２）。结论：不同Ｈｐ临床分离株的菌体蛋白结构相似，但其蛋白含量和免疫原性有差异；２４．８ｕ蛋白可能与胃癌有相关性。     

贵州省幽门螺杆菌CagA基因表达与甲硝唑耐药性

目的:探讨贵州地区上消化道疾病患者幽门螺杆菌(H pylori)细胞毒素相关蛋白(CagA)基因的表达及其与甲硝唑(MTZ)耐药的相关性。方法:从上消化道疾病患者胃黏膜分离50株H pylori,经聚合酶链反应(PCR)检测CagA基因,E-test法检测MTZ耐药情况,测序并应用BLAST分析MTZ敏感株(MTZS)与耐药株(MTZR)CagA基因的分子差异。结果:50株H pylori中有92%的菌株表达CagA,其阳性表达率在消化性溃疡患者与慢性胃炎患者无差异;50株H pylori对MTZ总耐药率为54%,CagA阳性及阴性菌株耐药率分别为54.3%及50.0%(P>0.05);基因测序结果显示MTZS及MTZR两组间CagA基因突变无统计学差异。结论:贵州地区CagA阳性菌株与上消化道疾病密切相关,但与疾病的严重程度无明显关系,CagA基因表达及基因变异与MTZ耐药性之间无明显关系。     

幽门螺杆菌尿素酶B基因的克隆、表达及其抗原性的鉴定

目的构建含人幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)尿素酶B(UreaseB,UreB)编码基因的重组质粒,测定、分析其核苷酸序列,并在E.coliTop10中表达,研究其抗原性。方法应用PCR技术从HpDNA染色体中扩增UreB编码基因片段,将其T-A克隆和测序,并与GenBank公布的其它Hp菌株基因序列比较,再将目的基因克隆至表达载体pGEX-4T-1中进行表达,用GST亲和层析对其进行纯化,纯化产物用于对29株小鼠抗Hp-全菌单克隆抗体(mAb)的鉴定及与Hp感染患者血清进行Westernblot。结果扩增的UreB基因全长1704bp,并在GenBank上登录(No.DQ141576),与GenBank公布的其它Hp菌株的核酸同源性为97%～99%,表达的UreB融合蛋白的相对分子量为91000。29株小鼠抗Hp-全菌mAb中有6株是针对UreB抗原的,纯化产物可被病人血清和抗UreB的鼠单克隆抗体识别。结论重组UreB具有较好的抗原性,为Hp检测诊断和疫苗的研究奠定了基础。     

幽门螺杆菌尿素膜通道基因的克隆和表达

目的 克隆幽门螺杆菌(Hp)尿素膜通道基因(ureI)和构建能表达UreI蛋白的原核表达工程菌,并初步研究产物的表达特性和免疫特性.方法 用PCR方法从Hp基因组中克隆ureI基因,构建原核表达重组质粒pET32a/ureI,双酶切和测序鉴定正确后,重组质粒转染大肠杆菌BL21 (DE3),构建高效表达UreI的工程菌BL21 /UreI.不同温度条件下用1.0 mmol/LIPTG诱导重组蛋白表达,用SDS-PAGE和Gel-Pro Analyzer 4分析重组蛋白的表达,并用Western blotting对其免疫原性进行分析.结果 克隆到约650 bp的基因片段,测序结果与GENBANK中对应菌株的ureI序列100%同源,与其他Hp的序列同源性不低于98.5%.工程菌BL21 /UreI含完整的ureI基因.在37℃、1.0 mmo1/LIPTG诱导14 h后,重组蛋白表达量可达菌体总蛋白的20.2%.分析表明重组蛋白主要以包涵体形式表达,经免疫印迹证实该重组蛋白有一定的免疫反应性和特异性.结论 成功构建了Hp ureI基因的原核表达载体,该载体可高表达有免疫特性的重组蛋白,为进一步研究Hp在胃的定植机制和抗Hp新药奠定了基础.     

幽门螺杆菌尿素酶C基因的克隆表达及其免疫原性的鉴定

目的　利用 PCR方法扩增 Hp ure C基因 ,将其克隆入表达载体 p BV2 2 0中以表达 Hp ure C重组蛋白 ,并验证其抗原性和免疫原性 .方法　用 PCR方法从 Hp临床株中扩增Hp ure C基因 ,经 Eco R 和 Bam H 双酶切后克隆入 p GEM-3Zf(- )中 ,用全自动测序仪进行双向测序 .然后将目的片段克隆入表达载体 p BV2 2 0中 ,温度诱导表达 Hp ure C重组蛋白 .用 Western Blot实验验证表达蛋白的抗原性 ,用免疫动物实验验证其免疫原性 .结果　用 PCR方法从 Hp临床株中扩增得到了一段 1173bp的 Hp ure C基因片段 ,对其进行测序 ,经BL AST分析证明所得 DNA序列与 Hp标准菌株 M6 0 398的同源性为 95 % .通过温度诱导 ,获得了 Mr为 4 4× 10 3的 Hpure C重组蛋白质 .经 Western Blot实验和免疫动物实验证实表达的蛋白质有较强的抗原性和免疫原性 .结论　成功地在E.coli中表达了 Hp ure C重组蛋白并证明其有较强的抗原性和免疫原性 .     

幽门螺杆菌空泡毒素、毒素相关蛋白的表达及分型

目的 :分析分离自我国临床患者的幽门螺杆菌 (Hp)毒力因子空泡毒素 (VacA)和毒素相关蛋白 (CagA)的表达状况及其分型分布。方法 :从临床分离培养 19株Hp ,用细胞测毒法检测VacA ,用Westernblot法分析CagA ,根据毒力因子表达情况进行分型。结果 :VacA阳性率为 5 7 9% ,CagA表达阳性率为 89 48% ;Ⅰ型 ,Ⅱ型 ,中间型Hp分别占 5 2 6 3% ,5 2 7% ,42 10 %。结论 :所研究的临床分离Hp菌株的毒力因子属高表达。     

幽门螺杆菌cagA蛋白的克隆表达与鉴定

目的　构建表达幽门螺杆菌 (Hp)毒素相关基因A蛋白 (cagA)的重组质粒 ,并在大肠杆菌中表达获得基因重组蛋白 ,为检出幽门螺杆菌致病株和运用于临床检测Hp感染奠定基础。 方法　PCR扩增出编码毒素相关基因蛋白DNA片段后构建出重组质粒 pET -cagA ,并经质粒酶切筛选、DNA测序、IPTG诱导DE3 表达融合蛋白和Western blot予以证实。表达的融合cagA蛋白经过纯化和凝血酶酶切验证cagA蛋白抗原性。 结果　克隆的cagA核苷酸序列与GeneBank(AB116 74 4 )公布的序列相比较 ,同源性达 99.34% ,推定氨基酸序列同源性为 99.0 1%。SDS -PAGE和Western blot检测到带有His tag的约 4 0kD融合蛋白中表达。融合蛋白酶切后能与抗cagA人抗血清发生阳性反应。 结论　重组cagA的原核表达质粒构建正确 ,蛋白表达成功 ,具有反应原性     

幽门螺杆菌黏附素基因babA2的克隆表达及定位

目的: 克隆并表达H.pylori黏附素babA2基因. 方法: 提取H.pylori染色体基因,用PCR方法扩增babA2基因,将其克隆至表达载体pET-22b( ),并在BL21(DE3)大肠杆菌中表达及定位分析. 结果: 分离得到了2.2 kb的babA2基因片段,在37℃诱导表达3 h后,重组蛋白表达量占菌体总蛋白的34.8%,其中分泌表达占周质总蛋白的22.7%,可溶性表达占上清的15.0%,包涵体占沉淀的86.7%. 结论: H.pylori babA2基因的克隆与表达为H.pylori黏附机制研究及疫苗的研制打下了基础.