人胃癌细胞株Rb抗癌基因缺失的研究

以Ｒｂ基因ｃＤＮＡ３．８Ｋｂ片段做探针，经非放射性地高辛－ｄＵＴＰ及放射性同位素α－＾３２Ｐ－ｄＣＴＰ两种标记方法标记，对６株人胃癌细胞株的ＤＮＡ进行点杂交和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交，显示５株细胞Ｒｂ基因完全缺失，１株不全缺失伴突变。     

地高辛标记探针与生物素标记探针用于斑点杂交检测HBV DNA的初步研究

为研究地高辛标记和生物素标记核酸探针斑点杂交检测ＨＢＶ ＤＮＡ的敏感性、特异性和稳定性，用两种探针和＾３２Ｐ标记探针进行平行检测对照。结果表明，地高辛探针检测灵敏度为０．１Ｐｇ，已达到＾３２Ｐ标记探针水平。生物素探针为１￣１０Ｐｇ。两种探针与＾３２Ｐ标记探针相比。符合率分别９６．６５％和８９．１３％；敏感性分别为９４．４４％和８３．３３％；特异性分别为９６．４３％和９２．８６％。两种探针在－２０℃     

人胃癌细胞株Rb抗癌基因缺失的研究

以Ｒｂ基因ｃＤＮＡ３．８Ｋｂ片段做探针，经非放射性地高辛—ｄＵＴＰ及放射性同位素α－３２Ｐ－ｄｃＴＰ两种标记方法标记，对６株人胃癌细胞株的ＤＮＡ进行点杂交和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交，显示５株细胞Ｒｂ基因完全缺失，１株不全缺失伴突变。     

小鼠性决定基因SRY探针的制备

目的 研究制备地高辛标记的小鼠性决定基因SRY探针,用于检测小鼠体内SRY基因表达的研究。方法 按已知的雄性小鼠Y染色体上性决定蛋白基因(SRY)的序列,请上海博亚公司合成四条oligoDNA,采用PCR技术连接并扩增,地高辛标记的方法制备基因探针。结果 用细胞原位杂交方法证实这种探针具有较高的敏感性和特异性。结论 小鼠性决定基因SRY探针的制备成功为进一步研究异体雄性小鼠骨髓移植到雌性小鼠体内后的分布和表达提供了实验基础。     

随机扩增多态DNA技术在地高辛标记HCMV DNA探针中的应用研究

应用ＲＥＡＰＤ－ＰＣＲ技术结合地高辛非放射生标记制备了人巨细胞病毒ＤＮＡ探针，并与常规随机引物法进行对照。ＲＡＰＤ－ＰＣＲ制备的ＨＣＭＶ ＤＮＡ探针长度呈多态性，扩增过程中不需合成特异引物，探针特异性强，产量高，用５０ｍｇ ＨＣＭＶ ＤＮＡ模板即可制备８．０μｇ探针；标记体系中ＲＡＰＤ－ＰＣＲ方法Ｄｉｇ－ｄＵＴＰ浓度为５．２％。     

随机扩增多态DNA技术在地高辛标记HCMV DNA探针中的应用研究

应用ＲＡＰＤ－ＰＣＲ技术结合地高辛非放射性标记系统制备了人巨细胞病毒ＤＮＡ探针，并与常规随机引物法进行对照。ＲＡＰＤ－ＰＣＲ制备的ＨＣＭＶＤＮＡ探针长度呈多态性，扩增过程中不需合成特异引物，探针特异性强，产量高，用５０ｎｇＨＣＭＶＤＮＡ模板即可制备８．０μｇ探针；标记体系中ＲＡＰＤ－ＰＣＲ方法Ｄｉｇ－ｄＵＴＰ浓度为５．２％。表明ＲＡＰＤ－ΡＣＲ技术可用于少量ＤＮＡ模板制备大量ＤＮＡ探针，适用于原位杂交等需高浓度探针的核酸杂交及临床大量标本的测试，是一种经济方便的探针制备技术     

地高辛标记DHBVDNA探针的制备及应用

采用随机引物法制备地高辛标记含鸭乙型肝炎病毒（ＤＨＢＶ）基因片段的质粒ＰＢＲ３２２作为探针，建立ＤＨＢＶＤＮＡ斑点杂交试验，结果：探针可检出１．０ｐｇ同源ＤＮＡ片段，不与人乙肝病毒（ＨＢＶ）及鸭肝细胞ＤＮＡ发生杂交，与￣３５Ｓ－ＤＨＢＶＤＮＡ探针的灵敏度相似。该探针检出重庆地区２－３月龄麻鸭血清ＤＨＢＶ自然感染率为２５．４８％；用ＤＨＢＶ血清经腹腔感染１－２日龄雏鸭，１周后阳性感染率为８２．９０％，并可持续感染至少２月。     

斑点杂交法检测SEN病毒感染

目的:探讨斑点杂交法检测SEN病毒(SENV)感染的应用价值.方法:应用地高辛标记、制备SENV部分基因探针并用斑点杂交技术检测SENV DNA,与聚合酶链反应(PCR)检测结果相比较. 结果: 在191份血清中,采用斑点杂交法检出6份阳性,检出率为3.1%. PCR方法检测出11份阳性,阳性率5.8%. 结论: 制备的地高辛探针具有SENV特异性,以地高辛标记的SENV探针可用于检测SENV感染.     

标记肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体-2地高辛探针

目的：标记肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）受体-2的地高辛探针。方法：查阅核酸序列数据库上TRAILR-2的基因全序列，计算机辅助设计引物，RT-PCR扩增目的条带，用地高辛（Digoxin，DIG）进行标记，制作TRAILR-2的探针。结果：地高辛标记的TRAILR-2电泳能力下降，标记成功。结论：TILCILR-2地高辛探针的标记成功为进一步研究肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体-2与喉鳞状细胞癌的关系奠定了一定的基础。     

牙龈卟啉菌全染色体探针的制备

（1）目的 探讨利用化学发光地高辛标记法制备牙龈卟啉菌47A-1的全染色体探针的方法并测定标记效率。（2）方法 采用苯酚-氯仿-溴化十六烷基三甲胺（CTAB）法制备牙龈卟啉菌47A-1基因组DNA,随机引物地高辛标记法制备核酸探针。在尼龙膜上直接点样,化学发光法检测。（3）结果 CTAB法可获得高质量的牙龈卟啉菌47A-1染色体DNA,地高辛标记0.3μg的牙龈卟啉菌核酸可获得10ng探针DNA,化学发光法检测最低可测出0.002pg标记探针的存在。（4）结论 随机引物地高辛标记法是快速获得牙龈卟啉菌全染色体探针的有效途径。     

S-100 和PTA1在垂体前叶共存的形态学证据

目的观察S-100 和血小板-T细胞活化抗原1(PTA1)在正常大鼠垂体前叶细胞的表达和共存. 方法免疫荧光双标记结合激光扫描共聚焦显微镜技术进行观察. 结果首次证实PTA1免疫反应阳性物质主要位于脑垂体血窦壁,与S-100免疫反应阳性细胞密切接触,并有一定程度的共存关系. 结论本结果为进一步明确PTA1分子在体内的分布及其功能提供了形态学依据.     

S－100和PTA1在垂体前叶共存的形态学证据

目的：观察S－100和血小板－T细胞活化抗原1（PTA1）在正常大鼠垂体前叶细胞的表达和共存。方法：免疫荧光双标记结合激光扫描共聚焦显微镜技术进行观察。结果：首次证实PTA1免疫反应阳性物质主要位于脑垂体血窦壁，与S－100免疫反应阳性细胞密切接触，并有一定程度的共存关系。结论：本结果为进一步明确PTA1分子在体内的分布及其功能提供了形态学依据。     

心钠素基因甲基化状态与表达调控

目的 :研究在大鼠老化过程中心钠素 ( ANF)基因的甲基化状态和该基因表达与调控的关系。方法 :采用限制性核酸内切酶 Hpa 和 Msp 消化大鼠基因组 DNA,用 [α- 3 2 P]d CTP进行ANF- c DNA标记探针 ,Southern blot杂交。结果 :老化过程中大鼠心房和心室 ANF基因内部至少存在一处未甲基化的序列。结论 :在老化过程中 ,大鼠心房和心室组织中的 ANF基因甲基化状态在转录水平上可能未参与该基因的表达调控 ,ANF基因表达调控的机制有待进一步研究     

SMAD7基因rs4939827位点多态性对下肢动脉PTA+STENT术后再狭窄的影响

目的：探讨SMAD7基因rs4939827位点多态性对下肢动脉经皮腔内血管成形术（PTA）+支架植入术（STENT）术后再狭窄的影响。方法：选择2015年7月-2019年6月于本院血管外科接受下肢动脉PTA+STENT的患者200例为研究对象,术后9个月出现再狭窄者90例为观察组,未出现再狭窄者110例为对照组。收集两组患者一般资料,酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测两组血清SMAD7表达水平,聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术测定SMAD7基因rs4939827位点多态性,分析影响下肢动脉PTA+STENT术后再狭窄的危险因素。结果：与对照组相比,观察组患者术后血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇水平、血管管腔直径再狭窄程度、SMAD7基因rs4939827位点C等位基因、CC基因型频率显著升高（P＜0.05）,血清中SMAD7表达水平、SMAD7基因rs4939827位点T等位基因和TT基因型频率显著降低（P＜0.05）。Logistic回归分析显示血清中总胆固醇＞4.85mmol/L、低密度脂蛋白胆固醇＞2.81mmol/L、血清SMAD7水平＜118.34 ng/mL、SMAD7基因rs4939827位点CC基因型为下肢动脉PTA+STENT术后再狭窄的危险因素(P＜0.05),SMAD7基因rs4939827位点TT基因型为下肢动脉PTA+STENT术后再狭窄的保护因素(P＜0.05)。结论：SMAD7基因rs4939827位点CC基因型和TT基因型与下肢动脉PTA+STENT术后再狭窄有关。     

PKD2基因在正常人和2型常染色体显性遗传性多囊肾病患者肾组织中的表达

目的 :观察 PK D2基因在正常人和 2型常染色体显性遗传性多囊肾病 (ADPKD)患者肾组织中的不同表达 ,探讨多囊肾病的发病机制。 方法 :抽提正常人肾组织细胞总 RNA ,通过 RT- PCR法获得 PK D 2基因第 12～ 13外显子 c DNA片段 ,以此为探针 ,用地高辛标记 ,对正常人和 2型 ADPKD患者肾组织分别进行原位杂交 ,并结合图像分析系统观察 PK D2基因表达情况。 结果 :正常人肾组织中 PK D2基因在 Henle襻的厚升支、远曲小管和皮质集合管有较强的表达 (平均光密度为 1.2 3± 0 .0 4 ) ;而 2型ADPKD患者肾组织中 PKD2基因仅在部分囊壁中有少量表达 (平均光密度为 0 .5 6± 0 .0 3)。 结论 :正常人肾组织中 PK D2基因表达量明显高于 2型 ADPKD患者 ,提示 PK D2基因表达降低在 2型 ADPKD的发生和发展中起着一定的作用     

应用70mer Oligo基因芯片从限制性cDNA片段中钓取目的基因

目的 探讨采用单一探针寡核苷酸阵列从经限制性显示方法制备的cDNA片段中钓取目的基因片段的方法。方法 酵母经常规培养，抽提mRNA逆转录成cDNA后，经限制性显示技术制备成限制性cDNA片段，根据目的基因SSAl设计70mer特异性oligo片段并打印成为寡核苷酸阵列。采用荧光标记的通用引物对上述经限制性显示技术获得的限制性cDNA片段进行标记，与oligo阵列杂交，洗脱，扫描：然后进行杂交后剥除．收集剥除液．采用限制性通用引物扩增，产物克隆于PUC18T载体中，并转化至JM109大肠杆菌中培养，抽提质粒，进行测序鉴定。结果 测序结果BLAST同源性比较表明，用该方法成功的克隆出了目的基因片段。结论 采用70mer寡核苷酸芯片可以直接从限制性显示方法处理的cDNA片段中钓取目的基因，而无需构建cDNA文库。另外，本方法也可用于oligo芯片的杂交后对有表达差异的基因的获取及研究中。     

幽门螺杆菌omp11基因与麦芽糖结合蛋白基因融合表达载体的构建与表达

目的：构建幽门螺杆菌(H．pylori)外膜蛋白基因(omp11)与麦芽糖结合蛋白基因融合表达载体,并进行诱导表达,为幽门螺杆菌疫苗和诊断抗原的筛选奠定基础。方法：提取H．pylori郑州分离株MEL-Hp27染色体DNA,用自行设计的PCR引物,从染色体DNA上扩增出omp11基因,将其克隆到表达载体pMAL-c2x中,用重组质粒转化大肠杆菌(E．coli TB1)。对重组质粒进行酶切鉴定,对目的基因片段进行测序。用IPTG诱导目的基因表达,用SDS-PAGE方法对表达产物进行分析。结果：用PCR方法扩增的omp11基因长度为561bp;经酶切鉴定和测序,插入到载体的基因片段与文献报道相一致;SDS-PAGE的结果显示,目的基因表达产物的相对分子质量为28000,融合蛋白的表达量占全菌总蛋白的30％。结论：作者构建的pMAL-c2x与omp11基因重组质粒在E．coli TB1中能够高效表达目的基因,该重组质粒的构建为H．pylori omp11基因的研究建立了重要的基础。     

多药耐药基因RNAi重组腺病毒构建

目的 构建抑制多药耐药基因(MDR1)表达的RNAi腺病毒载体,探讨基因治疗改善癫痫多重耐药现象的可行性.方法 根据大鼠MDR1基因序列,选择3个19nt的靶序列,设计并合成3对66nt含编码短发夹RNA(shRNA)序列的寡核苷酸,构建pSIREN-shuttle-MDR1重组质粒,测序分析正确后转染通过马桑内酯诱导的已表达多重耐药蛋白的大鼠星形胶质细胞,通过RT-PCR法测定多药耐药蛋白(P-gp)表达量,判断所设计的3条DNA序列对于P-gp表达的抑制作用.选择抑制效率最高的1个重组质粒,将其中的MDR1 shRNA表达结构酶切后插入腺病毒载体pAdeno-X,构建的pAdeno-MDR1经Pac1酶切后与脂质体共转染HEK293细胞进行病毒包装扩增纯化,所得病毒液作酶切电泳及测序分析正确后再转染大鼠星形胶质细胞模型.RT-PCR及免疫组织化学法分别测转染前后星形胶质细胞模型的MDR1及P-gp表达量.结果 重组质粒及pAdeno-MDR1病毒经PCR、酶切、测序分析证实构建正确.病毒滴度为6×109 pfu/mL.重组腺病毒转染星形胶质细胞后MDR1及P-gp表达量减少,干扰效率接近100%.结论 成功构建针对大鼠MDR1基因的RNAi腺病毒载体,并通过体外实验证实其对大鼠MDR1基因的高效抑制作用.为进一步探索难治性癫痫的多药耐药机制和基因治疗奠定了基础.     

Polycomb家族基因Nspc1在斑马鱼早期发育的表达

目的探讨Polycomb家族基因Nspc1在模式生物斑马鱼发育早期的表达模式。方法根据GenBank中斑马鱼Nspc1的cDNA序列设计Nspc1原位杂交探针片断,并制备地高辛标记的探针。收取单细胞期、双细胞期、胚芽期及不同时间点的体节期斑马鱼胚胎,用制备好的探针作原位杂交,显微镜下拍照,获得信号适当的杂交结果。结果在斑马鱼体节期前,Nspc1在全身表达;从体节期开始,其表达逐渐表现出特异性,主要在头部的神经系统中表达。结论Nspc1在模式生物斑马鱼的早期发育、尤其是神经系统发育的过程中可能扮演重要角色。