应用NASBA定量检测HCV RNA的研究进展

NASBA（nucleic acid sequence-based amplification)即核酸序列依赖性扩增法，是由一对引物介导的、连续均一的、体外特异性核苷酸序列等温扩增的RNA新技术。反应在42℃进行，可在2h内将RNA模板扩增约10^9倍。本文综述NASBA在HCV RNA定量检测中的应用。     

手足口病肠道病毒核酸检测方法的比较研究

目的比较和评价肠道病毒、EV71、CoxA16核酸的检测方法。方法采用RT—PCR和荧光探针PCR（Realtime PCR）方法检测病人和正常人群粪便标本,并对检测结果进行统计学分析。结果在EV71病毒和CoxA16病毒核酸检测方面,RT—PCR和荧光探针PCR检测结果一致,其中荧光探针PCR敏感性更高,经统计学检验学分析,两法对EV71病毒和CoxA16病毒核酸的检测率无不同,两法的阳性率结果比较,无显著性差异,两种检测方法之间的吻合度较强,检测结果基本一致。但是,在肠道病毒核酸检测中,两种方法RT-PCR和荧光探针PCR检测结果有统计学意义（P〈0．05）。结论采用RT—PCR和荧光探针PCR对于EV71、CoxA16病毒临床诊断、研究、预防和控制具有重要意义,RT—PCR和荧光探针PCR诊断技术稳定、可靠,又可缩短检验时间。荧光探针PCR方法较RT—PCR方法更敏感,更能减少实验室的交叉污染。荧光探针PCR方法应进一步改进,以提高检出率。     

用原位杂交法检测肠道病毒基因组同源性的研究

人类肠道病毒属于微小RNA病毒科,包括脊髓灰质炎病毒(PV)、柯萨奇A组(CAV)、B组病毒(CBV),埃可病毒(EV)4组病毒和肠道病毒68-72型。72型为肠道病毒的新成员甲型肝炎病毒(HAV)。肠道病毒是一组与人类多种疾病密切相关较为复杂的病毒。属内各组病毒基因同源关系尚未完全清楚。而HAV与传统肠道病毒的     

双重实时荧光RT-PCR法检测肠道病毒方法的建立及应用

目的 建立检测肠道病毒(EV)和肠道病毒71型(EV71)的双重实时荧光RT-PCR法.方法 设计特异性引物和探针,建立双重实时荧光RT-PCR反应体系,绘制标准曲线,对该方法的灵敏度、精密度等进行评价.收集109例临床手足口病患者粪便和咽拭子标本用该法进行检测,并与EV71商品化试剂盒检测结果进行比较.结果 双重荧光PCR法建立的EV和EV71标准曲线相关系数(r)均为0.998;该法检测EV和EV71的灵敏度分别达到0.5 TCID50/mL和0.05 TCID50/mL;检测EV和EV71的批内精密度均小于3％,总精密度均小于或等于4％;对肠道病毒及其他人类非肠道病毒进行检测,显示了良好的特异性.109例临床样本用该法检测出84例EV病毒阳性样本,其中EV71阳性56例,EV71总阳性率为51.4％;与单重荧光PCR商品化试剂盒的检测结果完全一致(P=1.000).结论 建立的双重实时荧光RT-PCR法灵敏度高、稳定性好,对手足口病的早期高通量快速诊断具有重要意义.     

一种新型肠道病毒引起的脑膜炎——病原学,临床及血清流行病学研究

１９９１年２￣６月间江苏省徐州市辖邳县，发生１次中枢神经系统感染性疾病流行，病死率较高，发病者以学龄儿童为主，临床诊断为肠道病毒性脑膜炎。从１７例患者脑脊液、粪便等２３份标本中，分离出１８株相似病毒。该病毒为ＲＮＡ型，具有肠道病毒共有的理化特性和生物学性质，不被已知诊断血清中和，其抗血清也不能中和已知的肠道病毒。故可认为该病毒为一新型别的新型肠道病毒。血清流行病学调查表明，该病毒在毗邻疫区的未发病     

肠道病毒IgM抗体快速检测在手足口病护理管理中的应用

目的 探讨肠道病毒Ig M快速检测提升手足口病护理管理质量的作用。 方法 选择温州医科大学附属第二医院2015年5月份符合手足口病诊断的治疗病例126例纳入本次研究,进行随机对照试验(RCT),分别设立非病原学快速诊断组(Ⅰ组,62例)和病原学快速诊断组(Ⅱ组,64例)。Ⅰ组不进行肠道病毒Ig M抗体检测,仅采集咽拭子及粪便标本送检PCR检测,统一分配病房,并采取手足口病常规护理。Ⅱ组同时进行肠道病毒Ig M抗体(胶体金法)和PCR检测,根据病原学不同分别归入相应隔离病房,并采取不同的护理模式。比较2组患儿病原学的差异,比较Ⅱ组Ig M抗体和PCR检测结果的差异。比较2组患儿住院时间的差异,并调查出院2周内再次感染的情况。 结果 2组患儿病原学比较差异无统计学意义(P=0.927),Ⅱ组胶体金法与PCR法检测的对应准确率为98.4%。Ⅱ组患儿住院时间较Ⅰ组患儿时间缩短(P<0.001)。Ⅰ组再次感染例数为8例,而Ⅱ组则没有再次感染病例,差异有统计学意义(P<0.001)。 结论 胶体金法检测手足口病病毒Ig M的方法,可快速检测病原学,医护人员可据此分别隔离并进行相应的治疗和护理,提高治疗和护理的针对性,提升护理管理质量,缩短住院时间,同时可降低病房内的二次感染。      

肠道病毒的PCR检测方法评价与改进

目的研究分析PCR检测肠道病毒的方法评价及改进措施。方法择取2013年8月—2014年8月期间在常州第一人民医院接受检测治疗的50例心血管内科急性心肌梗塞患者作为观察组,并抽取同期在该院体检的20例健康者作为对照组。分别采集两组研究对象的血清,均接受PCR方法检测,病毒分离与鉴定,Cox B V中和抗体检测,ELISA检测,并且实施肠道病毒病原与抗体检测,然后对比不同检测方法的结果。结果观察组50例患者中,PCR检测得出EV-RNA阳性者20例,检出率为40%;病毒分离法分离出病毒4株,检出率为8%。通过ELISA检测得出的阳性者12例,阳性率为24%;Cox B V中和抗体检测出阳性为10例,阳性率为20%,二者之间存在显著性差异,P〈0.05有统计学意义。结论 PCR检测方法具有一定的优越性,其敏感度、特异性更高。     

用RT-PCR技术检测石蜡包埋组织中的肠道病毒RNA

目的:应用逆转录PCR技术(RT-PCR)在石蜡包埋的心肌组织切片中检测肠道病毒(柯萨奇病毒B3,CVB3)RNA.方法:用Trizol法从石蜡包埋的心肌组织切片中提取CVB3RNA,用适当的引物合成cDNA第一链,从中取出适量进行聚合酶链反应(PCR).PCR结果用琼脂糖凝胶电泳检测并将PCR产物做核苷酸序列分析.阳性对照采用CVB3感染的人羊膜细胞.结果:用RT-PCR技术可扩增出一条约500 bp(540 bp)的核苷酸片段,测序结果表明是CVB3的一个片段.结论:RT-PCR技术应用于长期保存的石蜡包埋的组织切片进行肠道病毒的检测可获得较满意结果,可将RT-PCR技术用于回顾性研究.     

浙江省急性腹泻患儿中肠道病毒检测分析研究

目的 探讨浙江省急性腹泻患儿的常见病毒组成.方法 采集5岁以下（≤5岁）急性腹泻患儿的811份粪便标本,采用ELISA方法检测A组轮状病毒（RV）,应用多重PCR方法同时检测B/C组RV、诺如病毒（NoV）、札如病毒（SaV）、肠道腺病毒（AdV）、星状病毒（AstV）,并利用RT-PCR对RV的阳性标本进行G、P分型.结果 811份粪便样本中,RV、NoV、SaV、AdV 及AstV总的阳性比例分别为25.52%、18.37%、4.44%、2.71%和1.23%;65份（8.01%）混合感染标本中以RV和NoV混合感染所占比例最大（56.92%）; 116份RV的G/P分型中,G3型（37.93%）、G1型（32.75%）和P[8]型（57.76%）是RV的优势型别,且G3/P[8]（27.59%）是混合感染最主要的组合.结论浙江省五种常见腹泻病毒及其混合感染的流行状况,为临床治疗和疾病监测提供参考价值.     

免疫磁珠技术检测大肠癌患者外周血微转移的临床应用研究

目的探讨检测大肠癌患者外周血微转移的免疫磁珠技术的方法及临床意义。方法采集大肠癌患者外周抗凝血5ml,加入6％HKS200／0．5,4℃下静置60min,取上清,加入抗CEA单克隆抗体,在4℃下作用90min,然后室温下与免疫磁珠作用60min,在磁性细胞分离器中静置30min,镜下观察玫瑰花环形成情况,HE染色,进行免疫磁珠技术敏感性测定。结果5ml外周血中的肿瘤细胞可被检测出来,大肠癌患者的阳性检出率为42．5％。结论免疫磁珠技术是一种有效检测肿瘤细胞的方法,可以从大肠癌患者外周血中分离出肿瘤细胞,监测微转移的存在,有助于临床对大肠癌的诊断及治疗。     

基于核酸适体的比色技术检测肿瘤标志物血管内皮生长因子

目的 基于核酸适体和磁珠,提出一种检测肿瘤标志物血管内皮生长因子(VEGF)的比色方法.方法 核酸适体与标记脲酶的单链结合,通过生物素-亲和素的特殊识别作用固定在链霉亲和素修饰的磁珠上;待检测的肿瘤VEGF标志物与适体结合形成茎环结构,使标记脲酶的单链脱落下来;经磁分离,转移上清液,加入到含一定量尿素和酚红试剂的溶液中.利用上清液中的脲酶水解尿素产生氨,使得溶液的pH值升高,导致溶液的颜色变化,通过肉眼或紫外分光光度计分析显色结果.结果 该检测体系在最佳条件下,检测VEGF的线性范围为0.1～10 pmol/L,检测限达0.06 pmol/L.并利用此体系,检测人肺癌患者血清中的VEGF浓度,其结果与ELISA方法检测出的结果基本一致.将本方法与ELISA方法同步盲法测定10例血清样本,结果显示本方法的准确率为90％,表明其具有较高的有效性和敏感性.结论 该检测方法操作简单方便,同时具有较高的灵敏度和选择性,在临床VEGF检测中具有潜在的应用前景.     

缺硒饲养ICR小鼠加快肠道病毒71型在体内的复制研究

目的观察硒蛋白对手足口病病原体肠道病毒71型（EV71）在感染动物体内复制的影响情况。方法将30只雌性ICR小鼠分为常规饲料组、缺硒饲料组和加硒饲料组,各种饲料饲养小鼠6周后,通过电感耦合等离子体质谱仪（ICP—MS）测定小鼠外周血中硒的含量以及荧光定量PCR方法测定动物体内肠道病毒EV71的载量．然后用病毒空斑实验测定病毒滴度并用酶促法来测定主要硒蛋白酶的活性。结果通过测定外周血中硒的含量发现,缺硒饲料组的ICR小鼠硒含量为0．081μg／g,显著低于常规饲料组0．135μg／g和加硒饲料组的0．128μg／g,差异有统计学意义（P〈0．01）;用荧光定量PCR方法测定EV71载量,加硒饲料组ICR小鼠体内EV71核酸扩增Ct值,明显高于缺硒饲料组（P〈0．05）;ICR小鼠体内主要硒蛋白酶（GPX1）的活力在缺硒饲料组的动物体内显著低于加硒饲料组：病毒空斑实验结果表明,缺硒饲料组的ICR小鼠体内EV71病毒复制活力显著高于其他两组。结论缺硒可能导致硒蛋白GPX1合成减少或其活力降低从而加快EV71在宿主内的复制。     

免疫磁珠分选法原代培养小鼠肺微血管内皮细胞

目的：探讨一种高效、稳定的小鼠肺微血管内皮细胞（PMVECs）原代培养方法。方法：选取45只1周龄Balb/c小鼠,随机分成3组,分别用酶消化法、组织贴块法、免疫磁珠分选法3种方法分离培养小鼠PMVECs,观察细胞形态学以及VIII因子相关抗原免疫荧光染色鉴定内皮细胞,计算各组原代培养成功率及从原代培养开始到首次传代所需时间,测定细胞纯度,MTT法绘制生长曲线。结果：3组原代培养的细胞在倒置显微镜下均能见到短梭形、多边形的微血管内皮细胞,血管内皮细胞特异性标志物VIII因子相关抗原表达阳性。免疫磁珠分选法组原代培养成功率及细胞活性显著高于其他2组,差异有统计学意义（P＜0.01）,从原代培养至首次传代所需的时间短于组织贴块法组,差异有统计学意义（P＜0.05）,细胞纯度显著高于酶消化法组,差异有统计学意义（P＜0.01）。结论：相比于酶消化法与组织贴块法,免疫磁珠分选法原代培养小鼠PMVECs具有重复性好,分离速度快,细胞纯度高及活性好的优点。     

SCARB2蛋白提高人肠道病毒71型对转基因小鼠的感染力

目的 细胞实验证实人清道夫受体B2（hSCARB2）是人类EV71的受体,本研究拟通过建立人SCARB2转基因小鼠,建立感染能力更高的小鼠模型.方法 构建CMV启动子的SCARB2转基因表达载体,通过显微注射法建立C57BL/6J背景的人SCARB2转基因小鼠,PCR筛选阳性首建鼠.通过Western Blot和免疫组化检测目的 蛋白在各组织中的表达.EV71感染转基因小鼠后,通过实时荧光定量PCR和免疫组化检测目的 蛋白表达对病毒感染的促进效果.结果 人SCARB2蛋白主要在转基因小鼠的骨骼肌和脑组织中表达,与野生型小鼠相比,转基因小鼠组织中的病毒载量显著提高4到5倍.结论 人SCARB2的体内表达可促进EV71对转基因小鼠的感染,该蛋白在体内具有EV71受体功能.     

量子点快速检测弓形虫IgG抗体方法的建立及初步应用

目的 建立一种简便、快速的人弓形虫(Toxoplasma,TOXO)IgG抗体检测新方法,并在临床初步应用.方法 应用TOXO抗原包被羧基磁珠作为固相载体,量子点标记羊抗人IgG作为检测抗体,建它TOXO IgG检测方法,同时优化检测条件;对255份临床血清标本进行了检测,并与意大利DiaSorin TOXO IgG ELISA试剂进行比较.结果 检测最佳条件为:抗原包被浓度100 μg/ml,量子点标记二抗工作浓度为1∶200,待测血清稀释度为1∶100.本方法的诊断敏感性、特异性分别为93.3%、96.7%,与进口试剂盒的总符合率为96.5%.结论 基于量子点标记及免疫磁珠技术检测TOXOIgG,操作简便、快速,具有较高的特异性、敏感性和有较好的临床应用价值.     

基于悬浮点阵技术的新型EGFR基因突变检测方法的建立和应用

目的构建基于悬浮点阵技术的新型表皮生长因子受体(EGFR)基因突变的检测方法,检测并分析非小细胞肺癌(NSCLC)组织中EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)相关的EGFR基因突变状况。方法选取61例经影像学和病理学检查确诊的NSCLC患者作为研究对象,手术后留取新鲜肺癌组织,提取基因组DNA,采用多重聚合酶链式反应(PCR)对组织样本的EGFR基因18、19、20和21号外显子中包含8种高频突变位点的特异片段进行扩增,并经多重连接酶检测反应(LDR)以特异性探针对扩增片段中的突变进行连接,再基于悬浮点阵技术平台对连接产物进行检测,最后通过DNA测序对检测结果进行验证。结果在61例NSCLC组织样本中,运用PCR-LDR联合悬浮点阵技术共检出EGFR基因突变19例,突变率为31.1%,其中外显子19缺失突变E746-A750 del(1)、E746-A750 del(2)各1例,外显子20点突变T790M 1例,外显子21点突变L858R 14例、L861Q2例,经DNA测序验证完全正确。结论运用PCR-LDR联合悬浮点阵技术初步建立了一种新型的EGFR基因突变检测方法,能同时准确检测EGFR基因中的8种高频突变...