脂多糖经MyD88/NF-κB信号途径抑制Bewo细胞中乙型肝炎病毒复制

目的 探讨Toll样受体4(TLR4)配体脂多糖(LPS)抑制人滋养层细胞Bewo中乙型肝炎病毒( HBV)复制的作用机制,为防治HBV宫内感染提供依据.方法 首先将2μg 1.3倍HBV全基因重组质粒pcDNA3.1(+)-HBV1.3转染Bewo细胞12h后,以TLR4配体LPS处理3d.尔后用LPS处理Bewo细胞,观察IFN-β、TNF-α表达的动力学、NF-κB拮抗剂二硫代氨基甲酸吡咯烷( PDTC)对LPS诱导Bewo细胞产生细胞因子的作用.采用微粒子酶免疫分析法(MEIA)和荧光定量PCR法分别检测HBsAg、HBeAg和HBV DNA水平,并以ELISA和RT-PCR分别检测IFN-β、TNF-α水平及TIR结构域的转接蛋白(TRIF)、髓样分化蛋白(MyD88)表达.结果 与对照组比较,LPS可显著抑制Bewo细胞中HBV复制(P＜0.01),且LPS可显著诱导Bewo细胞产生TNF-α(P＜0.05),呈时间和剂量依赖性.PDTC可抑制LPS诱导细胞产生TNF-α,显著低于对照组(P＜0.01),但对IFN-β无显著作用(P＞0.05).与对照组比较,LPS可诱导HBV重组质粒转染的Bewo细胞表达MyD88(P＜0.01).结论 通过MyD88/NF-κB信号途径诱导Bewo细胞产生TNF-α,TLR4配体LPS可显著抑制HBV复制.     

polyⅠ:C诱导人胎盘滋养层细胞抗HBV感染的体外研究

目的:探讨体外polyⅠ:C对人胎盘滋养层细胞乙型肝炎病毒(HBV)感染的作用.方法:将2μg或8μg HBV重组质粒pcDNA3.1(+)-HBV1.3转染人胎盘滋养层细胞Bewo,12 h后以Toll样受体3(TLR3)配体polyⅠ:C处理3天,同时设对照组.采用微粒子酶免疫分析法(MEIA)和荧光定量PCR法分别检测细胞上清液HBsAg、HBeAg及HBV DNA水平,并以荧光定量RT - PCR和ELISA分别检测细胞TLR3 mRNA表达及细胞上清IFN -β水平.结果:与对照组比较,polyⅠ:C均可显著抑制Bewo细胞HBV复制(P＜0.01或0.05),但与2μgHBV重组质粒转染组比较,转染8μgHBV重组质粒组polyⅠ:C对HBV复制的抑制率显著下降(P＜0.01),且polyⅠ:C诱导Bewo细胞TLR3 mRNA表达及IFN -β水平显著下降,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:polyⅠ:C可诱导人胎盘滋养层细胞抗HBV感染,但随着HBV感染量的增大,通过下调细胞TLR3 mRNA表达及IFN -β产生,其抗HBV感染的作用被显著削弱.     

喉鳞癌组织NF—kB的表达和淋巴管计数的临床意义及相关性研究

目的研究喉鳞癌组织中核因子-kB（NF—kB）表达水平和淋巴管计数,探讨两者在喉鳞癌中的临床病理意义及相互关系。方法收集50例喉鳞癌手术切除组织标本,另取10例声带息肉组织作对照,常规制作石蜡包埋切片,NF-kB表达的检测和淋巴管计数均采用SP免疫组化法。结果喉鳞癌NF-KB表达阳性率和淋巴管计数为明显高于声带息肉组[60％vs10％,P〈0．05,（13．3±3．4）个／HP vs（6．1±3．8）个／HP,P〈0．01];高分化喉鳞癌和未转移病例NF—KB表达阳性率和淋巴管计数明显低于低分化喉鳞癌和转移病例[33．3％vs84．2％,（9．6±2．7）个／HP vs（16．9±3．4）个／HP,P〈0．05或P〈0．01];NF—KB表达阳性的喉鳞癌淋巴管计数明显高于阴性表达者[（14．9±4．1）个／HP vs（9．8±3．1）个／HP,P〈0．01]。结论NF—kB表达和淋巴管计数均为反映喉鳞癌进展、转移等生物学特性及预后的重要标记物,喉鳞癌细胞分泌的NF—kB可能促进淋巴管生成。     

MyD88高表达腺病毒对小鼠自发性免疫性心肌炎的影响

目的通过对自发性免疫性心肌炎的Balb／c小鼠尾静脉注射MyD88高表达腺病毒来观测髓样分化因子88（Myeloid Differentiation Factor88,MyD88）对心肌炎症的影响。方法将所购得的90只小鼠随机分为MyD88组、心肌炎组和对照组,各30只。MyD88组小鼠皮下注射心肌肌球蛋白混合液,3d后给予尾静脉注射MyD88高表达腺病毒混合液0．1ml;心肌炎组在相同部位注射等体积的心肌肌球蛋白混合液,3d后注射与实验组同剂量的PBS溶液;对照组仅皮下注射0．2ml的PBS。21d后处死动物并制作切片,观测炎症浸润程度,并取眼球血测心肌坏死标志物cTnI及IgG、IgM抗体。结果免疫后第21天,炎症评分心肌炎组显著高于对照组（2．39±1．23VS0．68±0．65,P〈0．05）,表明自发性免疫性心肌炎小鼠建模成功。MyD88组炎症评分显著升高（F=94．194,P〈0．01）,高于心肌炎组（3．56±1．34V82．39±1．23,P〈0．05）和对照组（3．56±1．34V80．68±0．65,P〈0．01）;MyD88组小鼠血清cTnI、IgG和IgM检测值也明显高于心肌炎组和对照组（P〈0．01,P〈0．05）。结论MyD88参与了自发性免疫性心肌炎的发生发展。     

乙肝病毒携带者PBMCs中 TLR2表达水平的研究

目的探讨乙肝病毒携带者（ASC）外周血单核细胞（PBMCs）中Toll样受体2（TLR2）的表达水平。方法选取40例ASC和健康志愿者20例为研究对象,分为乙肝病毒（HBV）复制不活跃组、HBV复制活跃组和健康组,分析各组患者的PBMCs中TLR2及血清中肿瘤坏死因子（TNF-a）水平。结果HBV复制活跃组的TLR2阳性细胞百分比和TLR2平均灰度比值均高于健康组,差异具有统计学意义（P〈0．05）;HBV复制不活跃组与健康组比较则差异不明显。HBV复制活跃组、HBV复制不活跃组的TNF-a水平均高于健康组,差异均有统计学意义（P〈0．05）;HBV复制活跃组TNF-a水平高于HBV复制不活跃组,差异具有统计学意义（P〈0．05）。结论AsC外周血单核细胞TLR2的表达水平高于健康人群,且与HBV的增殖存在一定的相关性。     

RIG-I配体poly(dAT:dAT)诱导Bewo细胞抑制乙型肝炎病毒复制的研究

目的探讨维甲酸诱导基因-I(retinoic acid inducible gene I,RIG-I)配体poly(d AT:d AT)抑制人滋养层细胞Bewo中乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)复制的作用及机制,为防治HBV宫内感染提供依据。方法首先将2μg 1.3倍HBV全基因重组质粒pc DNA3.1(+)-HBV1.3转染Bewo细胞12 h后,以RIG-I配体poly(d AT:d AT)处理24 h。然后,以poly(d AT:d AT)处理Bewo细胞,观察干扰素-β(interferon-β,IFN-β)表达的动力学。采用微粒子酶免疫分析法和荧光定量聚合酶链反应法分别检测HBs Ag、HBe Ag和HBV DNA水平,并以酶联免疫吸附测定和逆转录PCR分别检测IFN-β水平,RIG-I、线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein,MAVS)、干扰调节因子3(interferon regulatory factor 3,IRF 3)和核因子-κB(NF-κB)的表达。结果 poly(d AT:d AT)可显著诱导Bewo细胞产生IFN-β(P0.05),呈时间和剂量依赖性。与对照组比较,poly(d AT:d AT)处理组HBs Ag、HBe Ag和HBV DNA水平显著下降(P0.05),可显著抑制Bewo细胞中HBV复制。且poly(d AT:d AT)可诱导HBV重组质粒转染的Bewo细胞表达RIG-I、MAVS、IRF 3和NF-κB mRNA。结论通过RIG-I/MAVS信号途径诱导Bewo细胞产生IFN-β,RIG-I配体poly(d AT:d AT)可显著抑制HBV复制。     

polyI:C诱导人胎盘滋养层细胞抗HBV感染的体外研究

目的:探讨体外polyI:C对人胎盘滋养层细胞乙型肝炎病毒(HBV)感染的作用。方法:将2μg或8μg HBV重组质粒pcDNA3.1(+)-HBV1.3转染人胎盘滋养层细胞Bewo,12 h后以Toll样受体3(TLR3)配体polyI:C处理3天,同时设对照组。采用微粒子酶免疫分析法(MEIA)和荧光定量PCR法分别检测细胞上清液HBsAg、HBeAg及HBV DNA水平,并以荧光定量RT-PCR和ELISA分别检测细胞TLR3 mRNA表达及细胞上清IFN-β水平。结果:与对照组比较,polyI:C均可显著抑制Bewo细胞HBV复制(P<0.01或0.05),但与2μg HBV重组质粒转染组比较,转染8μg HBV重组质粒组polyI:C对HBV复制的抑制率显著下降(P<0.01),且polyI:C诱导Bewo细胞TLR3 mRNA表达及IFN-β水平显著下降,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:polyI:C可诱导人胎盘滋养层细胞抗HBV感染,但随着HBV感染量的增大,通过下调细胞TLR3 mR-NA表达及IFN-β产生,其抗HBV感染的作用被显著削弱。     

生脉散对大肠杆菌脂多糖诱导慢性肝衰竭大鼠细胞因子水平的影响

目的探讨生脉散对慢性肝衰竭大鼠大肠杆菌脂多糖（LPS）诱导细胞因子水平的影响。方法采用CCl。混合液腹腔注射复制慢性肝衰竭大鼠模型,观察LPS诱导2h后生脉散后对血清内毒素、细胞因子水平的影响。结果CCl。混合液能明显增加大鼠血清IL-6[（64．50±18．79）pg／mlVS（4．79±0．57）pg／m1]、ICAM-1[（25100．00±5258．85）pg／mlVS（4215．50±942．79）pg／m1]和TNF-α[（17．55±2．39）pg／mlVS（10．92±5．02）pg／m1]水平（P〈0．05）,但对血清LPS水平无明显影响[（0．058±0．007）EU／mlVS（0．040±0．002）EU／ml,P〉0．05];中药生脉散能显著降低CCl。慢性肝衰竭大鼠血清IL-6、ICAM-1和TNF-α水平[分别为（17．20±3．12）pg／ml、（9490．00±2725．78）pg／ml、（3．00±1．00）pg／ml,P〈0．05]。LPS攻击2h后能明显升高CCI。混合液大鼠血清LPS、TNF-α、IL-6、ICAM-1水平[分别为（0．501±0．019）EU／ml、（19750．00±9655．17）pg／ml、（5615．00±490．50）pg／ml、（41000．00±589．88）pg／ml,P〈0．01]。结论在慢性肝衰竭模型中,LPS能增加TNF-α,IL-6和ICAM-1等炎症因子水平,中药生脉散可降低LPS水平,并抑制LPS诱导的炎症因子水平,阻断了炎性介质及LPS本身对机体的损伤。     

大黄素对人膀胱癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用及其机制

目的探讨大黄素对人膀胱癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用,并探讨其作用机制。方法建立人膀胱癌细胞株BIU87裸鼠移植瘤模型,并随机分为4组：对照组、大黄素组、Z—VAD—FMK组、大黄素＋Z—VAD—FMK组。观察各组裸鼠移植瘤生长情况并绘制肿瘤生长曲线,4周后处死全部裸鼠,取出肿瘤组织,称瘤质量;HE染色观察肿瘤细胞形态,流式细胞分析仪细胞凋亡,RT-PCR检测各组肿瘤组织中AIF和EndoGmRNA的表达,Western blot检测各组肿瘤组织中AIF和EndoG蛋白的表达。结果大黄素组肿瘤生长速度明显慢于其他3组,大黄素组[（0．41±0．05）g]和大黄素＋Z-VAD—FMK组[（0．69±0．07）g]肿瘤较其他2组[（1．08±0．13、1．04±0．09）g]轻,差异有统计学意义（F=90．56、27．49,P〈0．01）,大黄素组与大黄素＋Z—VAD—FMK组相比差异也有统计学意义（t=10．01,P〈0．01）。流式细胞仪检测凋亡显示大黄素组细胞凋亡率[（42．71±2．69）％]明显高于大黄素＋Z-VAD—FMK组[（34．38±1．73）％]（t=6．38,P〈0．01）。RT—PCR和Western blot结果显示,大黄素＋Z—VAD—FMK组中AIF和EndoG的表达水平显著上调,与其他各组比较[（1．65±0．12）vs（1．24±0．08）、（0．51±0．07）、（0．48±0．04）;（2．12±0．16）vs（1．75±0．13）、（0．57±0．06）、（0．59±0．07）;（2．42±0．13）vs（1．73±0．11）、（0．78±0．07）;（0．75±0．08）;（3．13±0．25）vs（2．15±0．18）、（0．85±0．09）、（0．81±0．14）],差异均有统计学意义（F=303．22,319．32,409．38,258．53,P〈0．01）。结论大黄素能够明显抑制人膀胱癌裸鼠移植瘤的生长,其机制可能部分与大黄素可上调膀胱癌细胞BIU87中AIF和EndoG的表达,通过启动非Caspase依赖途径诱导细胞凋亡有关。     

HBV基因瞬时和稳定转染HepG2细胞的TLR4表达

目的观察HBV基因瞬时和稳定转染HepG2细胞后表达TLR4的变化。方法采用免疫荧光流式细胞术检测TLR4在肝癌细胞株HepG2和HepG2．2．15上表达的平均荧光强度（MFI）及阳性细胞率,将前期试验获得的HBV全基因组,采用脂质体瞬时转染肝癌细胞株HepG2,采用免疫荧光流式细胞术检测TLR4在细胞上表达的MFI及阳性细胞率,台盼蓝计数检测细胞增殖活性,并分析其与细胞表达TLR4的关系。结果HepG2．2．15细胞上TLR4表达的MFI及阳性细胞率均明显高于HepG2（均为P’〈0．01）,HepG2细胞于转染HBVDNA各剂量组48h后TLR4表达的MFI和阳性细胞率与无HBVDNA脂质体转染对照组相比均显著升高（均P’〈0．01）,并且MFI和阳性细胞率与转染剂量均呈正相关（均P〈0．01）,与细胞存活数均呈负相关（均尸〈0．01）。结论瞬时和稳定转染HBV的HepG2细胞,都存在细胞TLR4的上调,这种上调伴随着细胞存活的减少,并可能参与了急慢性乙型肝炎的免疫损伤。     

重组人生长激素对内毒素诱导人巨噬细胞产生TNF-α、IL-1β含量的影响

目的研究重组人生长激素（rhGH）对内毒素（LPS）诱导巨噬细胞产生炎性因子的影响。方法培养人单核巨噬细胞株U937细胞，体外经PMA（phorbol 12-myristate 13-acetate）诱导成熟后，设为5组：空白对照组、LPS组（给予40μg／mL LPS）、rhGH低剂量组（给予2U／L rhGH＋40μg／mL LPS）、rhGH中剂量组（给予4U／L rhGH＋40μg／mL LPS）及rhGH高剂量组（给予8U／L rhGH＋40μg／mL LPS），采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定各组细胞上清液中炎性因子肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1β的含量。结果经PMA分化成熟后的U937细胞在LPS诱导下，TNF-α、IL-1β的含量明显增加，LPS组与空白对照组比较，差异有显著性（P〈0．05）；rhGH各组TNF-α、IL-1β的含量则明显下降，与LPS组比较，差异有显著性（P〈0．05）。结论rhGH可抑制LPS刺激巨噬细胞分泌炎性因子TNF-α、IL-1β，故rhGH对LPS所致疾病如脓毒血症等可能有潜在的治疗作用。     

不同类型干扰素对Toll样受体在Huh7细胞中表达的影响

目的 探讨不同类型干扰素对肝细胞Toll样受体(toll like receptor,TLR)3、4、7、9表达的影响.方法 感染丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV) JFH-1病毒的Huh7细胞分别加入干扰素α(interferon,IFN-α)、IFN-β、IFN-γ、IFN-λ1处理24h,以实时定量聚合酶链反应(real time polymerase chain reaction,RT-PCR)分析Toll样受体3、4、7、9以及HCV复制水平的变化.结果 各干扰素均能抑制HCV的复制(t分别为-45.699、-68.165、-70.994、-67.111,均有P＜0.001).方差分析显示各干扰素处理组间TLR3、TLR4、TLR7及TLR9的相对表达量差异有统计学意义(F分别为125.901、263.537、163.289、31.774,均有P＜0.001),进一步两两比较可知,IFN-α、IFN-β能上调TLR3(t分别为21.312、25.420,均有P＜0.001)、TLR7(t分别为26.456、24.289,均有P＜0.001)的表达,同时下调TLR9的表达,而对TLR4的表达没有影响;IFN-γ可上调TLR4、TLR7的表达,对TLR3和TLR9的表达没有影响;IFN-λ1可上调TLR3、TLR7、TLR9的表达水平,但对TLR4的表达没有影响.结论 不同干扰素对肝细胞不同Toll样受体表达的作用不同,反映出不同干扰素具有不同的抗病毒作用机制.     

TLR4 and MyD88 control protection and pulmonary granulocytic recruitment in a murine intranasal RSV immunization and challenge model

An intranasal vaccine composed of Toll-like receptor 2 (TLR2) ligand Neisseria meningitidis outer membrane proteins and Toll-like receptor 4 (TLR4) ligand Shigella flexneri lipopolysaccharide (LPS) (Protollin) and enriched respiratory syncytial virus (RSV) proteins (eRSV) has been demonstrated to promote balanced Th1/Th2 responses without eosinophil recruitment and to protect against challenge in mouse models. We used TLR2, TLR4 and myeloid differentiation factor 88 (MyD88) knock-out (-/-) mice to investigate the roles of these signalling pathways on immunogenicity, protection and pulmonary infiltrates following RSV immunization and challenge. Antigen-specific systemic and mucosal antibody production was significantly impaired only in TLR4-/- mice following Protollin–eRSV immunization. In contrast, an intact MyD88 pathway was crucial to elicit a balanced type 1:type 2 immune response, characterized by increased splenocyte production of antigen-induced IFNγ and IL-10 with concomitant reduction of IL5, IgG2a isotype switching and abrogation of pulmonary eosinophil recruitment following challenge. MyD88-dependent signalling also contributed to neutrophil recruitment to the lungs following immunization with eRSV antigen, in the presence or absence of Protollin, compared to a mock antigen or vaccine. Both TLR4 and MyD88-signalling were required for optimal protection against challenge. The upregulation of early signalling molecules IFN-β, TNFα, CD40 and CD86 were studied in splenocytes isolated from naïve TLR2, TLR4 and MyD88-/- mice following stimulation with vaccine components. Splenocytes from TLR4-/- mice displayed reduced IFN-β while those of MyD88-/- mice elicited less TNFα and lower expression of CD40 and CD86 on CD11c+ cells. Together, our results suggest that optimal immunogenicity and protection against RSV without risk of enhanced pulmonary inflammation requires intact TLR4/MyD88-dependent signalling.     

Fas/FasL系统激活对LPS诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞分泌MCP-1、TNF-α的影响

目的探讨Fas/FasL系统对LPS诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞分泌炎症因子(MCP-1、TNF-α)的影响。方法原代培养肺泡Ⅱ型上皮细胞,随机分为四组(每组平行6孔):对照组、LPS组、LPS+FasL组、FasL组,加入LPS、FasL调节终浓度为LPS:10μg/ml,FasL:5 ng/ml。培养48 h后,ELISA检测MCP-1、TNF-α浓度。结果与对照组比较,LPS组、FasL+LPS组、FasL组TNF-α与MCP-1浓度增加(P0.01);与LPS组比较,FasL+LPS组TNF-α与MCP-1浓度增加(P0.05)。结论 Fas/FasL使LPS诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞MCP-1与TNF-α分泌增加。     

肺结核合并慢性乙型肝炎患者T淋巴细胞免疫应答研究 FREE

目的研究结核病合并慢性乙型肝炎（乙肝）患者血清中Th1型细胞的细胞因子水平变化以及Th1、Th2的表达水平及意义。方法对21例肺结核并乙肝表面抗原（HBsAg）阳性患者、30例单纯肺结核患者及30例健康对照者,应用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定其血清中肿瘤坏死因子（TNF） α、干扰素（IFN） γ、白细胞介素（IL） 12水平;运用流式细胞术检测外周血中CD4＋T淋巴细胞及细胞内Th1、Th2的表达水平。结果单纯肺结核及肺结核并HBsAg阳性组TNF α水平均显著高于健康对照组（均P＜0.01）;单纯肺结核组IFN γ、IL 12水平均显著低于健康对照组（均P＜0.05）,而肺结核并HBsAg阳性组IFN γ、IL 12水平均显著低于单纯肺结核组（均P＜0.01）。单纯肺结核组外周血CD4＋T淋巴细胞及细胞内Th1表达水平均显著低于健康对照组（分别P＜ 0.05,P＜0.01）;细胞内Th2表达水平显著高于健康对照组（P＜0.05）。肺结核并HBsAg阳性组CD4＋T淋巴细胞及细胞内Th1表达水平显著低于单纯肺结核组(分别P＜ 0.05,P＜ 0.01)。结论肺结核患者存在细胞内Th1反应减弱,Th2反应增强;而肺结核合并慢性乙肝的患者则进一步致细胞内Th1反应减弱,Th2反应增强。