问号钩端螺旋体致病物质及其作用机制研究进展

问号钩端螺旋体(简称钩体)感染引起的钩体病是全球流行最广的人兽共患病.由于问号钩体无外毒素,所含有的内毒素样物质也不能合理地解释其致病性,故问号钩体致病机制至今未明.近年国外学者分别报道了问号钩体内鞭毛、一些糖脂或糖肽类物质、溶血素、部分外膜蛋白分别与体外生存、侵袭力、粘附宿主细胞、细胞膜损伤、诱导炎症因子和细胞凋亡等有关,从而与问号钩体致病密切相关.研究资料还提示,问号钩体致病机制可能与传统的细菌主要以内、外毒素致病有明显差异.     

问号钩端螺旋体对主要细胞外基质分子黏附作用及其差异性研究

目的：了解问号钩端螺旋体（简称钩体）对细胞外基质（ECM）分子的黏附作用及其差异。方法：建立问号钩体黄疸出血群赖型56601株对J774A．1、L929和Vero细胞感染模型，采用Fontana镀银染色法及显微镜检查法，了解问号钩体56601株黏附细胞ECM的效果。建立多种ELISAs，检测问号钩体56601株黏附ECM分子层粘连蛋白（LN）、纤维纤连蛋白（FN）、核心蛋白多糖（DEN）及胶原蛋白1、2、4（COL1，2，4）的作用，采用竞争性抑制试验对上述实验结果进行验证。结果：问号钩体56601株能以一端或两端黏附于L929、J774A．1和Vero细胞的ECM部位。问号钩体56601株可与上述6种ECM分子发生黏附，其中对COL1、LN、COL4的黏附作用较强。问号钩体56601株分别与上述6种ECM分子预孵育后，对相应ECM分子的黏附作用明显下降。结论：ECM是问号钩体黏附宿主细胞的主要部位。LN、FN、DEN、COL1、COL2、COL4均是问号钩体黏附的受体分子，但问号钩体对不同ECM分子的黏附效果有一定差异。     

问号钩体趋化相关基因特征分析

目的 预测问号钩体黄疸出血群赖型赖株的趋化信号传导途径，并深入分析趋化相关基因。方法 使用ProtParam tool，NCBI／Blastp进行蛋白参数分析和结构域分析，使用Clustalw软件进行多序列对比，与大肠埃希菌K-12趋化相关基因进行比较。结果 问号钩体趋化相关基因共30个，分为MCPs和che两组基因，功能与大肠埃希菌趋化相关基因相似，并预测出问号钩体趋化信号传导途径。结论 问号钩体趋化相关基因较大肠埃希菌、苍白密螺旋体和伯氏疏螺旋体多，提示其趋化传导途径更为复杂，适应宿主的能力也更强，可能是钩体的重要毒力因子之一。     

问号钩端螺旋体诱导J774A.1细胞凋亡及caspase-3、-6活化对凋亡的影响

目的：了解问号钩端螺旋体（钧体）诱导小鼠单核巨噬样细胞（J774A．1）凋亡的作用，以及caspase-3、-6活化对凋亡的影响。方法：建立问号钩体黄疸出血群赖型56601株J774A．1细胞感染模型。采用FITC—AnnexinV／PI荧光标记流式细胞术检测细胞凋亡或坏死情况。分别采用荧光比色法和Western Blot，检测感染细胞caspase-3、-6活性及其底物（PARA和LaminA／C）剪切情况。结果：多种不同浓度的问号钩体赖株感染均可使J774A．1细胞发生凋亡，其中以问号钩体：细胞=100：1的比例感染时凋亡率最高（48．81％±5．950o）。感染细胞caspas-3和-6最大活性分别为（1453．41±36．07）FU和（618．65±39．82）FU，是未感染细胞的16．38和9．98倍。感染细胞的PARP和LaminA／C均被剪切。Caspase-3、-6抑制剂对问号钩体赖株诱导的J774A．1细胞凋亡有明显的阻断作用。结论：问号钩体可诱导J774A．1细胞凋亡，easpase-3和-6与该细胞凋亡密切相关。     

问号钩端螺旋体诱导J774A.1细胞FasL/Fas表达上调及FasL/Fas相关细胞凋亡的研究

目的：了解FasL／Fas途径参与问号钩端螺旋体（简称钩体）诱导细胞凋亡及其FasL／Fas表达水平变化。方法：建立问号钩体黄疸出血群赖型56601株感染小鼠单核一巨噬细胞J774A．1模型。采用DAPI染色法观察问号钩体56601株感染细胞凋亡的形态学特征，流式细胞术定量检测感染细胞的凋亡率及FasL中和抗体对细胞凋亡的阻断作用。PE标记抗小鼠FasL或Fas单克隆抗体染色法，观察问号钩体56601株感染细胞FasL／Fas表达情况。采用流式细胞术定量检测感染细胞的FasL／Fas表达水平。结果：问号钩体56601株感染J774A．1细胞4h时，部分细胞出现染色质浓缩及边缘化现象；感染24h时上述病变现象更加明显且有部分细胞核裂解。问号钩体56601株感染J774A．1细胞4h和24h的凋亡率分别为53．6％和64．31％。FasL中和抗体预处理细胞后，问号钩体56601株感染细胞4h或24h的凋亡率分别为10．27％和15．90％。J774A．1细胞被问号钩体56601株感染后4和24h，FasL表达率分别从感染前的4．19％上升至21．69％和65．70％，Fas表达率分别从感染前的12．88％上升至91．96％和88．01％。结论：诱导细胞凋亡是问号钩体56601株损伤J774A．1细胞的重要机制。问号钩体可上调靶细胞FasI。／Fas表达水平；并通过FasL／Fas途径诱导J774A．1细胞凋亡。     

问号钩体趋化相关基因特征分析

目的预测问号钩体黄疸出血群赖型赖株的趋化信号传导途径,并深入分析趋化相关基因.方法使用ProtParamtool,NCBI/Blastp进行蛋白参数分析和结构域分析,使用Clustalw软件进行多序列对比,与大肠埃希菌K-12趋化相关基因进行比较.结果问号钩体趋化相关基因共30个,分为MCPs和che两组基因,功能与大肠埃希菌趋化相关基因相似,并预测出问号钩体趋化信号传导途径.结论问号钩体趋化相关基因较大肠埃希菌、苍白密螺旋体和伯氏疏螺旋体多,提示其趋化传导途径更为复杂,适应宿主的能力也更强,可能是钩体的重要毒力因子之一.     

赖型钩端螺旋体基因文库的构建及重组质粒pDC38的初步研究

应用质粒载体ｐＵＣ１８购建了黄疸出血群赖型钧体的基因文库，重组率８６％，重组子约１２０００个。以ＯｍｐＬ１基因片断作探针从该基因文库中筛出１０个阳性克隆，其中重组质粒ｐＤＣ３８与７型８株致病钩体（黄疸出血群赖型、大型、致热型、秋季型、澳大利亚型、波摩那型、流感伤寒群临海型）ＤＮＡ杂交有杂交信号；与非致病的双曲钩体、细丝体，大肠杆菌和２型问号钩体（爪哇型、拜伦型）ＤＮＡ无杂交信号。     

fliR基因与问号钩端螺旋体黏附及损伤细胞功能相关性的研究

目的：了解问号钩端螺旋体（简称钩体）fliR基因的致病性。方法：分别从问号钩体黄疸出血群56601株DNA和pET42a质粒中扩增fliR基因和kana基因。构建fliR基因自杀质粒，并设计和合成特异性siRNA。采用分别基于自杀质粒的基因敲除、基于siRNA的基因沉默技术构建问号钩体fliR基因突变株，并用PCR、测序、半定量RT-PCR进行鉴定。采用小鼠单核-巨噬细胞J774A．1黏附试验和流式细胞术，检测敲除fliR基因的问号钩体突变株56601^fliR-Kana、siRNA阻断fliR基因的问号钩体突变株56601^siRNA-R2株黏附细胞，及诱导细胞坏死或凋亡能力的变化。结果：所克隆的fliR基因与GenBank中相应基因的核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99．9％和100％，所克隆的kana基因核苷酸序列与pET42a图谱完全相同。56601^fliR-Kana可在含氨苄青霉素和卡那霉素的EMJH培养基中生长，PCR和测序结果证实56601^fliR-Kana株fliR基因中插入了kana基因。56601“睢‰“株fliR基因mRNA水平明显下降（P〈0．01），56601”RNA。砣株fliR基因mRNA水平也低于野生株（P〈0．05）。56601^fliR-Kana和56601^siRNA-R2黏附J774A．1细胞的能力基本消失，诱导J774A．1细胞坏死或凋亡的能力也明显减弱（P〈0．01）。结论：fliR基因是问号钩体毒力相关基因，其功能与问号钧体黏附细胞、诱导细胞凋亡或坏死密切相关。     

不同血清群问号钩端螺旋体mce基因序列分析及表达模式的研究

目的：确定问号钩端螺旋体（简称钩体）株携带侵袭相关mce基因情况，原核表达mce基因并制备其抗血清，了解问号钩体感染细胞前后mce基因转录水平的变化。方法：采用PCR扩增13株问号钩体和1株双曲钩体全长mce基因片段，T—A克隆后测序。采用基因工程技术构建mce基因原核表达系统，SDS—PAGE联合Bio—Rad凝胶图象分析系统检查目的重组蛋白rMce表达情况，采用Western Blot对表达的rMce进行鉴定。采用皮内免疫法制备兔抗rMce血清，免疫双扩散试验测定其效价。采用实时荧光定量RT—PCR，检测问号钩体黄疸出血群赖型56601株感染J774A．1细胞前后mce基因转录水平的变化。结果：我国13株问号钩体株均携带mce基因，双曲钩体三宝垄群patoc型PatocI株则否。与报道的序列（GenBank accession No．：NP_712236）比较，所克隆的mce基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99．02％～100％和97．91％～100％。所构建的mce基因原核表达系统能表达rMce，其产量为细菌总蛋白的5％。问号钩体56601株全菌抗血清能有效识别rMce。问号钩体56601株感染细胞后mce基因转录水平明显上调。结论：mce基因仅存在于致病性的问号钩体中，且其转录水平呈细胞接触上调模式，表明该基因与问号钩体致病性密切相关。mce基因产物是序列保守的外膜蛋白。所构建的mce基因原核表达系统及所制备的rMce抗血清为深入研究该基因功能提供了有效的手段。     

感染过程中钩端螺旋体外膜蛋白抗原表达水平变化及其调控机制

目的：了解感染人巨噬细胞过程中问号钩端螺旋体（简称钩体）黄疸出血群赖型赖株主要外膜蛋白（OMP）抗原表达水平变化及其OmpR相关基因调控机制。 方法：采用生物信息学技术预测问号钩体赖株OmpR及其组氨酸激酶（HK）基因和结构功能域。采用实时荧光定量RT-PCR检测钩体感染人THP-1巨噬细胞前后钩体主要OMP编码基因mRNA水平的变化。采用HK胞外区多肽抗血清封闭试验及氯氰碘柳胺阻断试验,检测OmpR及其HK对感染过程中问号钩体OMP编码基因mRNA水平变化的影响。 结果：生物信息学分析结果显示,LB015和LB333可能是问号钩体赖株OmpR编码基因,LB014可能是其HK编码基因。问号钩体赖株感染THP-1细胞后,lipL21、lipL32、lipL41基因mRNA水平迅速并持续下降（P<0.01）,groEL、mce、loa22、ligB基因mRNA水平瞬时迅速升高（P<0.01）。氯氰碘柳胺或HK抗血清处理可使感染THP-1细胞而显著下降的问号钩体lipL21和lipL48基因mRNA水平明显回升（P<0.01）,氯氰碘柳胺处理可使感染THP-1细胞而显著升高的groEL、mce、loa22、ligB基因mRNA水平明显下降（P<0.01）。 结论：问号钩体赖株感染人巨噬细胞后主要OMP抗原表达水平发生明显变化。问号钩体赖株染色体中存在一组编码OmpR及其HK的基因,其主要功能可能是下调感染过程中部分OMP抗原表达水平。     

经络腧穴理论的形成与发展

从<脉书·十一脉><黄帝内经>等文献人手,梳理了血气、经络、腧穴理论的形成与发展,简要介绍了四肢部的基本腧穴、躯体部要穴,以及腧穴配伍的基本要义.     

析议痰瘀同源、互结、同治

目的:探讨痰瘀相关,意在梳理痰瘀知识、并强调痰瘀相关的重要性。方法:通过多角度地分析、刍议"痰瘀同源"、"痰瘀互结"、"痰瘀同治"等痰瘀经典理论的方式论述痰瘀相关。结果:痰与瘀是中医界里重要的元素,痰与瘀互结是许多疾患共同的病机,痰瘀同治是常用治法。结论:痰瘀同源、互结、同治,不但在临床上有着实用的指导意义,又能与时俱进、在探究中创新。     

载脂蛋白的结构和功能与病毒病的预防和治疗

载脂蛋白（apo）是脂蛋白的重要组成成分,其主要功能是调节酶活性,介导细胞受体与脂蛋白结合,保持脂蛋白结构的稳定性。目前已发现数十种载脂蛋白,其结构的显著特点是分子中具有多个双性alpha螺旋及Beta-折叠结构。载脂蛋白的这种双性alpha螺旋结构是其结合及转运脂质的结构基础。在HIV外壳结构中的一种糖蛋白（gP）也具有这种alpha螺旋结构。近年研究表明,载脂蛋白和由载脂蛋白组成的脂质体还具有抗肝炎病毒、抗HIV病毒、抗单纯疱疹和中和细菌内毒素的功能。以脂蛋白和载脂蛋白为主要成分构成的脂质体已成为运载抗病毒和抗肿瘤药物受体的靶向性载体。     

神经病学与神经解剖学优化整合的评价与分析

目的评价神经病学与神经解剖学优化整合教学法的教学效果,寻找存在的问题及解决对策,为今后的神经病学教学改革提供参考。方法采用问卷调查、访谈的方式,分析神经病学教改后的教学效果、对学生学习态度的影响、教学中存在的不足。结果教改班的教学效果、对学生学习态度的改善优于非教改班(P<0.01)。结论神经病学与神经解剖学优化整合的教学改革效果显著,达到了预期的目的。     

教考合一与教考分离的统一——医学基础课综合性考试模式初探

考试是检验教学效果的有效方法,是教学过程中不可缺少的环节。多年来,人们对考试改革不断进行探索,总结出不同的考试模式,例如教考合一与教考分离就是2种完全不同的考试模式。通过对比2种考试模式的优势与劣势,提出适合医学基础课的综合性考试模式。     

“医信融创”教育模式的构建与实践探索

从必要性、要求及实质3个角度梳理了“医信融创”教育的内涵,并在此基础上探索“医信融创”教育的模式。“医信融创”需要遵循由“融”到“创”的逻辑主线,通过“融行-融智-融心”的过程最后走向“创新”的目的。最后以山西医科大学的实践案例证明了“医信融创”教育的必然性和可行性。     

新生儿游泳对生长发育的影响研究

目的:探讨新生儿游泳的护理以及对生长发育的影响。方法:按照知情同意制度,选取125例实施游泳的新生儿为观察组,随机选取同期未游泳的新生儿为对照组(125例)。观察两组新生儿出生后42d头围、生长和体重的变化,比较两组生后7d、15d和28d的24h摄乳量。结果:42d后游泳组的婴儿头围、生长、体重增长明显,特别是体重增幅较大,两组统计学有明显差异;游泳组摄乳量从第7天开始均高于对照组,出生后28d更是明显增多,有显著统计学意义。结论:游泳有利于新生儿增加摄乳量,促进新生儿体格发育。     

躯体形式障碍患者医疗费用及相关因素

目的 了解消化科门诊躯体形式障碍诊疗费及相关因素.方法 对87例消化科门诊躯体形式障碍患者采用既往检查调查表(自编)、症状自评量表(SCL-90)进行评估.结果 患者既往检查总费用212-28652元(中位数为3792元),检查频率为5-82次,检查项目为3-11项,重复检查频率为3-72次,检查项目为血常规、彩超、X线、内窥镜、MRI、粪常规,重复度高的项目为彩超、内窥镜、X线、MRI.检查频度与病程、性别、年龄、文化程度有相关性,检查费用与检查频度呈正关(P<0.01).结论 消化科门诊躯体化障碍患者检查项目多,频度高,医疗花费多.     

解剖学与中医理论的隔阂与融合(上)

分析了解剖学与中医理论发展的历史关系。指出古代的解剖在构建了中医基础理论之后逐步走向式微,中医理论与解剖学之间的隔阂在近代达到顶峰。这种隔阂是一种历史性的结果,随着历史条件的改变,中医理论可以实现与解剖学的融合,从解剖脏器非对称特征中蕴含的阴阳规律具体论证了这一问题。在现代条件下,对解剖的反思和排斥已不具有积极意义,建立中医理论的形态学基础是中医理论发展的必然。     

解剖学与中医理论的隔阂与融合(下)

4 解剖脏器非对称特征中的阴阳规律显示出中医理论在新的历史条件下可以实现与解剖的融合 中医学认识解剖结构问题，当然要从自己的基本理论出发，最重要的首先是阴阳，同时要以确切的现代解剖内容为客观研究对象。就阴阳和解剖的关系这一具体问题而言，内脏基本结构的非对称性符合阴阳规律，中医理论在新的历史条件下可以实现与解剖的融合，从而为未来进一步的发展奠定新的基础。