不同发育阶段人表皮干细胞端粒酶反转录酶表达的比较

目的:目前已知端粒酶活性的丧失及其增殖相关基因表达的改变是造成多种成体干细胞体外复制和扩增受限的主要原因,而端粒酶反转录酶对端粒酶活性起关键作用。体外分离培养人胚胎、少儿、成人3种不同皮肤来源的表皮干细胞,对比观察不同发育阶段端粒酶反转录酶表达的差异。方法:实验于2005-09/2007-04在南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成。①对象:因创伤等原因致意外流产的妊娠24～26周龄胎儿皮肤标本,4～12周岁少儿及25～45岁成年人烧伤整形植皮手术剩余皮片标本,分别由南昌大学第一附属医院产科、烧伤科提供,产妇与烧伤患者对治疗及实验均知情同意,实验经医院医学伦理委员会批准。②实验方法:取胎儿、少儿和成年人的全层皮肤,用胰蛋白酶和EDTA联合消化法分离表皮,胶原快速贴附法纯化人表皮干细胞,用未黏附的角质细胞作为对照,以含表皮生长因子、角质细胞无血清培养液组成的表皮干细胞培养基进行体外培养。③实验评估:通过β_1整合素、角蛋白19、p63免疫细胞化学染色对培养细胞进行鉴定,计算克隆形成率。以免疫细胞化学染色法和图像定量分析法检测3种不同皮肤来源的表皮干细胞端粒酶反转录酶的表达差异。结果:①细胞生长特征:分离培养的人表皮干细胞呈明显克隆性生长,克隆形成率高于角质细胞对照组(P<0.05)。②表皮干细胞的鉴定:细胞克隆经免疫细胞化学染色后,β_1整合素、角蛋白19、p63均呈阳性表达。③端粒酶反转录酶免疫细胞化学染色及定量表达:不同皮肤来源的表皮干细胞端粒酶反转录酶均呈阳性,但表达强度不同,人胚胎>少儿>成人。3种皮肤来源的表皮干细胞平均吸光度值和阳性面积值均随年龄增加而逐渐降低,人胚胎>少儿>成人(P<0.05)。结论:人胚胎、少儿、成人皮肤来源的表皮干细胞均有端粒酶反转录酶表达,其表达强度依次减弱。提示诱导和增强端粒酶反转录酶的表达对维持表皮干细胞在体外自我更新和增殖能力可能具有重要意义。     

不同发育阶段人皮肤表皮干细胞增殖分化相关基因的表达特征

背景：目前研究认为表皮干细胞数量及增殖分化潜能的差异,可能是创面愈合能力随年龄增大而逐渐降低的重要原因之一。目的：探讨不同发育阶段人皮肤表皮干细胞B1整合素、角蛋白19、p63转录因子和端粒酶反转录酶的表达特征。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察,于2005—09／2007—04在南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成。材料：流产胎儿皮肤标本由南昌大学第一附属医院产科提供,4～12周岁少儿、25～45岁成人烧伤整形植皮手术剩余皮片标本由南昌大学第～附属医院烧伤科提供。方法：标本取材后立即用中性甲醛固定,常规石蜡包埋,4℃保存。所有标本经系列切片后,分别采用鼠抗人角蛋白19、β1整合素、p63转录因子、端粒酶反转录酶单克隆抗体作为一抗,以免疫组织化学EnVision法检测皮肤组织中表皮干细胞标志物的表达。 主要观察指标：200倍光镜下观察免疫组化染色结果,测定表皮干细胞标志物阳性表达率。结果：胎儿皮肤、少儿皮肤和成人皮肤表皮的基底部、毛囊周围细胞B1整合素、角蛋白19、p63和端粒酶反转录酶均呈棕黄色阳性表达。胎儿表皮基底层细胞β1整合素、角蛋白19和p63均呈强阳性表达：少儿表皮基底层细胞叶1大部分表达β1整合素、角蛋白19和p63,阳性细胞均匀分布;成人表皮基底层细胞B1整合素、角蛋白19和p63呈弱阳性表达,阳性细胞散在分布;胎儿表皮基底层端粒酶反转录酶阳性细胞表达强度,少儿表皮〉成人表皮。随年龄的增加,β1整合素、角蛋白19、p63和端粒酶反转录酶在胎儿、少儿、成人皮肤组织中的阳性表达率呈下降趋势（F=5．06,P〈0．01）。 结论：胎儿皮肤、少儿皮肤和成人皮肤表皮干细胞主要位于表皮基底层,端粒酶表达阳性区域及信号强度与表皮干细胞的定位分布及阳性表达强度相一致。提示表皮干细胞的数量、端粒酶活性表达的强弱可能与不同发育阶段皮肤组织的修复能力差异密切相关。     

黄芪诱导人骨髓间充质干细胞向表皮样细胞的分化

背景:课题组以往的研究证实黄芪对体外培养的人表皮体外扩展生长和表皮干细胞增殖均具有促进作用,但它对人骨髓间充质干细胞的体外作用如何特别是是否具有诱导骨髓间充质干细胞向表皮样细胞分化的效应,仍不清楚.目的:观察黄芪体外定向诱导人骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞的可行性.设计、时间及地点;细胞学体外对比观察,于2006-09/2008-06在南昌大学第一附属医院完成.材料:骨髓来源于临床骨髓穿刺检查正常患者,无血液系统疾病和家族遗传病史.方法:用密度梯度离心结合贴壁法分离纯化培养人骨髓间充质干细胞,以含黄芪、胎牛血清、角质细胞无血清培养基组成的诱导培养液进行体外培养,以不含黄芪的上述培养液作为对照.主要观察指标:倒置显微镜下观察细胞形态学变化,免疫细胞化学染色法检测D63和广谱细胞角蛋白的表达.结果:经黄芪诱导后部分细胞由长梭形转变为扁园形,呈表皮样细胞形态特征;免疫细胞化学染色显示部分诱导细胞p63、广谱细胞角蛋白表达均呈阳性.结论:黄芪可诱导人骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞.     

鼠胎肝干细胞生物学特性与人端粒酶反转录酶基因介导的影响

背景:研究表明,感染人端粒酶反转录酶基因后的干细胞具有稳定表达高水平端粒酶活性,且能使细胞增殖旺盛,这为建立基因工程的永生化干细胞系奠定了基础。目的:探讨人端粒酶反转录酶基因感染对体外培养鼠胎肝干细胞增殖及细胞周期的影响。方法:体外培养鼠胎肝干细胞,经重组腺相关病毒作为载体介导人端粒酶反转录酶基因感染,用RT-PCR、Western blot检测鼠胎肝干细胞人端粒酶反转录酶基因和蛋白的表达,CCK-8法、细胞生长曲线检测细胞生长增殖情况,流式细胞仪测定细胞周期分布的变化。结果与结论:与对照组、空载病毒组相比,基因感染组人端粒酶反转录酶基因和蛋白水平均有表达,细胞的生长速度明显增快,G0/G1期细胞减少,S期细胞数增多。结果表明以重组腺相关病毒作为载体介导人端粒酶反转录酶基因感染能促进体外培养的鼠胎肝干细胞增殖,对其培养有优化作用。     

Ⅳ型胶原快速黏附法体外分选人胎儿表皮干细胞

背景:发育生物学研究表明,表皮干细胞是皮肤及其附属器发生、修复、重建的关键性源泉,如何从皮肤组织中分离获得更多的表皮干细胞,并在体外培养过程中保持干细胞特性是其在皮肤组织工程中应用的重要前提。目的:观察Ⅳ型胶原快速黏附法分选的人胎儿表皮干细胞体外生长状态及克隆形成情况,并与角质细胞进行对照。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-01/06在南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成。材料:因创伤等原因致意外流产的妊娠24~26周龄胎儿皮肤标本,由南昌大学第一附属医院产科提供。Ⅳ型胶原为美国Sigma公司产品,角质细胞无血清培养基为美国Gibco公司产品。方法:将Ⅳ型胶原用磷酸盐缓冲液稀释成100mg/L,均匀涂被培养板后于超净工作台中风干备用。无菌条件下取胎儿皮肤标本,剪成3.0mm×5.0mm皮条片,4℃胰蛋白酶 EDTA联合消化8~10h,表皮真皮分离,用角质细胞无血清培养基将表皮反复吹打,获得单细胞悬液接种于预处理好的Ⅳ型胶原培养板,置37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中,20min后吸去培养液和未黏附细胞,加入含体积分数为0.1的胎牛血清、10μg/L表皮生长因子及角质细胞无血清培养基的表皮干细胞培养液,细胞约70%~80%融合后传代扩增;将未黏附细胞接种于另一培养板中,相同条件下作为角质细胞对照培养。主要观察指标:表皮干细胞的形态变化、免疫细胞化学染色鉴定结果及克隆形成率。结果:经贴壁筛选的表皮干细胞接种后呈圆形,折光性较强;1d后细胞略伸展为扁平的多角形,胞质近中央处有圆形核;3d时出现表皮干细胞克隆;5d时克隆数量明显增多,细胞之间紧密衔接,呈铺路石状;14d左右细胞基本融合。分离培养的人表皮干细胞克隆β1整合素、角蛋白19、p63均呈阳性表达。表皮干细胞克隆形成率明显高于角质细胞克隆形成率(t=1.972,P<0.05)。结论:采用Ⅳ型胶原快速黏附法成功筛选出纯度较高的人胎儿表皮干细胞,且呈明显克隆性生长,具有典型的干细胞生物学特性。     

应用Ⅳ型胶原黏附法进行人表皮干细胞的体外快速分离与鉴定

目的:以Ⅳ型胶原黏附法体外快速分离人表皮干细胞,利用其特异性标记物β1整合素及角蛋白19鉴定所培养细胞是否为表皮干细胞。方法:实验于2004-05/2005-03在南昌大学医学院烧伤研究所完成。①包皮来自行包皮环切术的儿童,由南昌大学第一附属医院提供,患者及其家属均签署知情同意书。②取手术刚切下的新鲜包皮,剔除皮下组织,采用DispaseⅡ酶和胰蛋白酶两步法分离出角朊细胞和成纤维细胞。收集处于对数生长期的第2～3代成纤维细胞的上清液,过滤除菌后与角朊细胞无血清培养基等比例混合,再加入体积分数为0.1的胎牛血清、表皮生长因子5μg/L、氢化可的松400μg/L、氯化钙0.05mmol/L、L-谷氨酰胺0.1mol/L、牛垂体提取物1.0mg/L,组成表皮干细胞培养液。分离的表皮片浸入2.5g/L胰蛋白酶-0.2g/L乙二胺四乙酸消化液中5min,所得细胞以表皮干细胞培养液悬浮。③将获得的角朊细胞悬液接种于预铺Ⅳ型胶原的六孔板中,每孔接种约1.5mL,室温静置10min,吸除未贴壁细胞,磷酸盐缓冲液漂洗至无细胞悬浮,即为富集分离的人表皮干细胞。加入人表皮干细胞培养基常规培养,第3天换液,后每隔1d换液一次。以同一标本同一批次培养的角朊细胞作为对照。④通过检测β1整合素、角蛋白19的表达水平及其克隆形成率和克隆维持时间,对其进行鉴定,以角朊细胞作为对照。结果:①人表皮干细胞形态学观察:倒置显微镜下,从角朊细胞中分离出的表皮干细胞体积小,呈单个、圆形贴壁,分散生长;培养12d后呈克隆样生长。②人表皮干细胞的克隆形成率:与同一标本同一批次培养的角朊细胞比较,人表皮干细胞的克隆形成率高[(8.72±0.73)%,(17.04±1.01)%,P<0.01],克隆维持时间更长[(9～10)d,(15～18)d,P<0.01]。③人表皮干细胞β1整合素和角蛋白19的表达:β1整合素及角蛋白19免疫组织化学染色均呈阳性。结论:①应用Ⅳ型胶原黏附法可对人表皮干细胞进行体外快速分离。②结合细胞形态学、细胞高克隆形成率和特异性标记物阳性表达等多种手段,鉴定所培养细胞为表皮干细胞。     

人端粒酶反转录酶转染的骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠糖尿病

背景:人端粒酶反转录酶是调控增殖及定向分化的首选生长因子之一,具有多重生物学效应。目的:观察人端粒酶反转录酶表达的骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠糖尿病的效果。方法:体外培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,经反转录病毒PLXSN为载体介导人端粒酶反转录酶基因转染骨髓间充质干细胞,在转染前后用RT-PCR检测骨髓间充质干细胞人端粒酶反转录酶基因的表达。60只雌性SD大鼠中随机取15只作为正常对照组,一次性注射生理盐水,余45只按45 mg/kg的剂量注射链脲霉素建立糖尿病模型后,随机分为3组,分别通过大鼠尾静脉注射移植人端粒酶反转录酶基因转染的骨髓间充质干细胞0.2 mL、骨髓间充质干细胞0.2 mL、生理盐水0.2 mL。结果与结论:转染48 h后发现,骨髓间充质干细胞有人端粒酶反转录酶mR NA的表达,且重点集中于胞核内。移植后14 d,糖尿病组大鼠空腹血糖维持在较高水平,且高于正常对照组(P<0.05);与糖尿病组相比,各移植组大鼠空腹血糖水平显著下降(P<0.05);与骨髓间充质干细胞移植组相比,人端粒酶反转录酶基因转染的骨髓间充质干细胞移植组大鼠空腹血糖水平显著下降(P<0.05),接近正常对照组水平(P>0.05)。结果提示人端粒酶反转录酶表达的骨髓间充质干细胞移植能有效治疗大鼠糖尿病。     

人表皮干细胞的体外分离和培养

背景：如何获得高纯度的表皮干细胞以及维持其干细胞表型和体外增殖特性，是目前表皮干细胞体外培养过程中急需解决的问题。目的：建立人表皮干细胞体外分离和培养的技术方法。设计、时间及地点：细胞观察，于2005-03／2006-05在南昌大学第一附属医院烧伤科完成。材料：所用包皮来自2～12岁行包皮环切术的患者，患者无泌尿系统感染等疾病。方法：取包皮皮片，采用DispaseⅡ酶和胰蛋白酶两步法分离出角朊细胞和成纤维细胞，Ⅳ型胶原快速黏附法富集分离表皮干细胞。收集处于指数生长期第二三代成纤维细胞的上清液，过滤后与角朊细胞无血清培养基等比例混合，并加入胎牛血清、表皮生长因子、牛垂体提取物等组成表皮干细胞培养液，用以人表皮干细胞的体外扩增培养，以角朊细胞作对照。主要观察指标：传至第2代，通过平板克隆形成实验计算克隆形成率和克隆维持时间，采用免疫组织化学染色检测β1整合素和角蛋白19的表达。结果：①与同一标本同一批次培养的角朊细胞相比，人表皮干细胞的克隆形成率明显升高，克隆维持时间延长（P〈0．01）。②表皮干细胞β1整合素及角蛋白19免疫组织化学染色均呈阳性。结论：应用Ⅳ型胶原快速黏附法及人成纤维细胞条件培养基，对人表皮干细胞成功进行了体外分离和培养。     

不同供者来源及不同传代次数人脂肪间充质干细胞端粒酶的活性检测

背景:目前对于脂肪间充质干细胞端粒酶的表达尚无统一定论.目的:探讨不同供者来源和不同传代次数的成人脂肪间充质干细胞是否表达端粒酶活性.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2009-08在中国医学科学院血液学研究所泰达生命科学技术研究中心完成.材料:成人脂肪组织来源于天津怡丽医学美容整形门诊接受抽脂术的5例健康供者,Hela细胞由中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心提供.方法:分别从每例健康供者抽取20 mL脂肪组织,胶原酶消化法体外分离培养人脂肪间充质干细胞,待细胞生长至80%融合时胰酶消化传代.以Hela细胞作为对照,加入含体积分数为10%胎牛血清的1640培养基,待细胞生长至80%融合时胰酶消化传代.主要观察指标:人脂肪间充质干细胞的形态、表型、分化潜能,RT-PCR法检测人脂肪间充质干细胞端粒酶基因的表达,TRAP-ELISA法检测人脂肪间充质干细胞的端粒酶活性.结果:实验分离得到的人脂肪间充质干细胞呈贴壁生长,显微镜下呈梭形,当细胞密度较大时表现出漩涡状生长:CD19,CD34,CD11b,CD45,HLA-DR呈阴性表达,CD73,CD90,CD105呈阳性表达:成脂诱导后油红O染色可见明显红色油滴,成骨诱导后Von Kossa染色可见黑色颗粒,提示有钙沉积.P1,P4,P7代人脂肪间充质于细胞均不表达端粒酶反转录酶基因,5例不同供者来源的脂肪间充质干细胞亦均不表达端粒酶反转录酶基因.Hela细胞具有端粒酶活性,人脂肪间充质干细胞不表达端粒酶活性.结论:不同供者来源和不同传代次数的人脂肪间充质干细胞均不表达端粒酶mRNA,也无端粒酶活性.     

端粒酶反转录酶在长骨造釉细胞瘤中的表达

目的:端粒酶反转录酶作为端粒酶蛋白的主要组分,被称为端粒酶活性作用的限速因子,在细胞增生过程中起重要作用.观察长骨造釉细胞瘤中端粒酶反转录酶的表达及其反义寡核苷酸对其表达和细胞增生的抑制作用.方法:实验于2006-02/2007-04在沈阳市第四人民医院完成.体外培养长骨造釉细胞瘤细胞,在24,48,72 h 后采用链酶亲合素-生物素-过氧化物酶复合物法作端粒酶反转录酶免疫组织化学检测;将2.5,5.0 μmol/L 和10.0 μmol/L 不同浓度的端粒酶反转录酶反义寡核苷酸和正义寡核苷酸分别作用于体外培养的长骨造釉细胞瘤细胞,无寡核苷酸混合液的DMEM液作空白对照,采用免疫组织化学方法检测端粒酶反转录酶的表达;四甲基偶氮唑盐比色法检测在不同浓度的端粒酶反转录酶反义寡核苷酸和正义寡核苷酸作用下,长骨造釉细胞瘤细胞生长活性及其生长抑制率.结果:①体外培养的长骨造釉细胞瘤细胞可表达端粒酶反转录酶,在5.0,10.0 μmol/L 反义寡核苷酸作用下,端粒酶反转录酶的表达明显受抑制,与空白对照组比较,差异有显著性意义(P < 0.01).②端粒酶反转录酶反义寡核苷酸能明显抑制长骨造釉细胞瘤细胞增生活性,并呈剂量依赖性. 结论:一定浓度端粒酶反转录酶反义寡核苷酸能序列特异性地抑制长骨造釉细胞瘤细胞端粒酶反转录酶表达和增生活性.