脐血CD34+细胞向粒、红细胞和血小板定向诱导分化研究

目的 体外定向诱导脐带血CD34^ 细胞向粒细胞、红细胞和血小板的定向分化。方法 用免疫磁珠分选的方法从脐带血中分离CD34^ 细胞，采用SCF与G-CSF、EPO或TPO联合诱导CD34^ 细胞分别向粒细胞、红细胞或巨核细胞和血小板分化成熟，从形态学、免疫表型和功能等方面鏊定已诱导分化的细胞。结果 粒系诱导培养体系中CD15^ 细胞达81．17％，红系诱导培养体系中GPA^ 细胞达95．35％，巨核系诱导培养体系中CD41^ 细胞达77．82％。且分别具有各系成熟细胞形态。粒细胞具有吞噬功能；血小板样颗粒在凝血酶作用下产生聚集反应。结论 建立了CD34^ 细胞分别向粒细胞、红细胞和血小板诱导分化的培养体系，为细胞治疗、分化过程中基因的调控、外源基因的表达等相关研究奠定了基础。     

骨髓间充质干细胞诱导分化为胰岛样细胞及其功能的研究

目的体外诱导分化骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)为胰岛样细胞,鉴定诱导细胞并检测其功能。方法取周龄大鼠骨髓细胞,进行MSC培养纯化扩增,用bFGF、EGF、条件培养液、高糖培养液、B27、地塞米松、胰岛素等培养体系诱导MSC向胰岛细胞转化。双硫腙染色鉴定胰岛样细胞;免疫细胞化学鉴定胰岛素抗原表达;Western blot检测胰岛样细胞胰岛素的表达。结果体外诱导的MSCs由长梭形变成多角形并逐渐聚集成团。双硫腙染色细胞团成亮红色,初步表明为胰岛样细胞。诱导的细胞具有胰岛素抗原表达;Western blot检测诱导分化为胰岛样细胞的胰岛素表达阳性。结论骨髓间充质干细胞能够分化成胰岛样细胞,并具有分泌胰岛素的功能。     

人脐血CD34^＋细胞体外诱导分化为树突状细胞及其扩增

目的采用脐血CD34^＋细胞在rhGM—CSF、rhTNF—α诱导下体外分化扩增为成熟树突状细胞。方法应用CD34^＋干细胞分选试剂盒以及免疫磁珠法从脐血中分离CD34^＋细胞,用rhGM—CSF、rhTNF—α联合诱导分化发育14d,成为成熟DC,观察细胞形态及检测CD83分子表达。结果50ml脐带血可分离出CD34^＋细胞约1．1×10^6,在rhGM—CSF、rhTNF-α诱导下CD34^＋干细胞培养2周,约扩增10～20倍。CD34^＋干细胞培养第3d开始出现集落,第8～9天集落最大,CD34^＋千细胞分化发育为有树突状突起的成熟DC,表面分子CD83阳性率为81．7％。结论体外联合运用rhGM—CSF、rhTNF—α,能够成功诱导脐血CD34^＋细胞分化为大量成熟的DCs。     

间充质干细胞应用现状

<正>间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一类多能干细胞,最初是从骨髓中发现的除造血干细胞以外的又一类干细胞。MSCs具有多向分化潜能,在体外不同诱导条件下可分化为骨、软骨、脂肪、肌肉、神经细胞等;其来源方便,目前可从多种组织中分离提取,如骨髓、脐带血、脐带、胎盘、脂肪组     

胎儿骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为胰岛样细胞

目的探索体外诱导胎儿骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为胰岛样细胞的最佳分化条件。方法取流产胎儿的长骨骨髓,体外培养扩增MSCs,先后予以2-巯基乙醇、表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、B27及尼克酰胺,通过三阶段诱导MSCs分化为胰岛样细胞,观察细胞形态变化、免疫荧光鉴定巢素蛋白(nestin)、胰十二指肠同源异型盒基因(PDX-1)、胰岛素(insu lin)和胰高糖素(glucagon)的表达、双硫腙染色鉴定胰岛细胞中的锌离子、电化学发光法测定人胰岛素的分泌量。结果MSCs易于体外分离和扩增,诱导二阶段细胞表达nestin及PDX-1,诱导三阶段形成胰岛样细胞团,表达insu lin及glucagon;双硫腙染色呈棕红色;胞浆胰岛素分泌量为81.3±23.6μu/m l;有一定程度葡萄糖刺激的胰岛素释放。结论MSCs可以诱导分化为胰岛样细胞团,尼克酰胺20 mmol/L是合适的促进胰岛细胞分化和成熟的浓度。     

脐血与脐带间充质干细胞的分离、扩增、分化比较

目的比较人脐血、脐带组织间充质干细胞体外分离、扩增与成骨、成脂肪细胞分化的方法与条件,比较相应实验的难易度。方法脐血采用沉降红细胞后密度梯度法及CD34+免疫磁珠负选法分离单个核细胞+10%胎牛血清或MesencultTM培养基培养传代,集落生长细胞向成骨、脂肪细胞定向诱导分化;脐带沿血管灌入胶原酶悬液,获取细胞培养、扩增,细胞呈集落生长后传代,定向成骨、成脂肪细胞分化。结果脐血经沉降红细胞后分离的MNCs,使用MesencultTM培养基+10%胎牛血清培养成功率高,集落细胞能向成骨、成脂肪细胞定向诱导分化。脐带去除血管后灌注可获得贴壁生长的细胞,能扩增形成集落,并向成骨、成脂肪细胞定向分化。结论脐血中可分离出MSCs,并可在体外进行培养扩增及分化,但难度较大。脐带组织存在间充质干细胞,并可在体外进行培养扩增形成集落细胞传代,集落细胞能够向成骨、成脂肪细胞分化,方法较脐血容易。     

脐血与脐带间充质干细胞的分离、扩增、分化比较

目的比较人脐血、脐带组织间充质干细胞体外分离、扩增与成骨、成脂肪细胞分化的方法与条件．比较相应实验的难易度。方法脐血采用沉降红细胞后密度梯度法及CD34^＋免疫磁珠负选法分离单个核细胞＋10％胎牛血清或Mesencuit^TM培养基培养传代,集落生长细胞向成骨、脂肪细胞定向诱导分化;脐带沿血管灌入胶原酶悬液,获取细胞培养、扩增,细胞呈集落生长后传代,定向成骨、成脂肪细胞分化。结果脐血经沉降红细胞后分离的MNCs,使用Mesencult^TM培养基＋10％胎牛血清培养成功率高,集落细胞能向成骨、成脂肪细胞定向诱导分化。脐带去除血管后灌注可获得贴壁生长的细胞,能扩增形成集落,并向成骨、成脂肪细胞定向分化。结论脐血中可分离出MSCs,并可在体外进行培养扩增及分化,但难度较大。脐带组织存在间充质干细胞,并可在体外进行培养扩增形成集落细胞传代,集落细胞能够向成骨、成脂肪细胞分化,方法较脐血容易。     

胚胎肝细胞提取液体外诱导骨髓干细胞向肝系细胞分化的实验研究

目的探讨胚胎肝细胞提取液体外诱导骨髓干细胞向肝系细胞分化的可行性。方法通过密度梯度分离法分离出骨髓中单个核细胞,进行体外培养和鉴定。在BMSCs传代培养7d后,把培养细胞分为诱导组和非诱导组;诱导组加入胚胎肝细胞提取液的培养体系,非诱导组加入不含胚胎肝细胞提取液的基础培养体系。在诱导培养d0,d10,d20,d30,d40对诱导分化的细胞进行形态学观察、肝系细胞特异性标志物的鉴定。结果①形态学:诱导培养2周后,长梭形细胞大多数转变成圆形、卵圆形及多角形,细胞呈肝干细胞样圆形。②免疫细胞化学检测:诱导培养d10～20细胞表达AFP、CKl9逐渐增强,d30~40逐渐减弱;诱导培养d10~40细胞表达ALB呈上升趋势;阳性染色细胞胞浆内出现棕黄色颗粒。非诱导组细胞不表达AFP、CKl9、ALB3种蛋白,为阴性染色。③糖原染色:诱导培养的细胞d10~40BMSCs均有糖原表达,非诱导细胞未见糖原表达(P﹤0.05)。结论胚胎肝细胞提取液在体外可以诱导骨髓干细胞向肝系细胞分化,并分化为具有合成、代谢、分泌及储存功能的肝系细胞。     

骨髓间充质干细胞体外分化过程中细胞周期蛋白的表达变化

目的:研究大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外定向分化为多巴胺(DA)能神经元过程中细胞周期相关蛋白的表达变化。方法:体外分离、扩增和鉴定大鼠骨髓MSCs。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)预诱导24 h后,用1μmol/L全反式维甲酸(ATRA)和50 ng/ml GDNF联合诱导6 d,检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、酪氨酸羟化酶(TH)、增殖细胞核抗原(PCNA)、Bcl-2、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK2)、细胞周期蛋白(Cyclin)B1的表达。结果:诱导后大鼠骨髓MSCs能分化为具有典型神经元形态的细胞,大鼠MSCs经诱导后PCNA、CDK2、Cyclin B1的表达均较对照组明显减弱,Bcl-2表达与对照组无明显差别。结论:骨髓间充质干细胞体外开始分化后细胞增殖力下降。     

组织工程化软骨的体外培养

目的探讨体外诱导骨髓基质干细胞(MSCs)形成组织工程化软骨的条件。方法经体外原代及传代培养,获取骨髓基质干细胞,高密度传代培养第3代诱导MSCs分化为软骨样细胞,以纤维蛋白粘合剂(FS)为载体,两者混合培养形成组织工程化软骨植入物(细胞浓度为5×106/m l),观察细胞的形态及生长特点。结果骨髓基质干细胞具有明显的增殖能力,贴壁率高,能诱导分化为软骨样细胞,形成甲苯胺蓝异染的软骨基质。结论骨髓基质干细胞可诱导分化为软骨样细胞,并能形成组织工程化软骨组织。     

人脐带间充质干细胞的分离、鉴定及向肝细胞的定向诱导分化

目的 分离纯化人脐带间充质干细胞(UCMSCs),探讨UCMSCs是否能在体外条件下被诱导成为肝细胞样细胞.方法 无菌条件下采集健康新生儿脐带,采用胰酶、胶原酶顺序消化法分离单个细胞,通过贴壁培养方法分离纯化间充质干细胞(MSCs).从形态、表面抗原、成脂肪细胞和成骨细胞分化潜能三方面进行鉴定.随后通过细胞因子诱导的方法将间充质干细胞诱导为肝细胞样细胞.结果 从人脐带中成功分离纯化得到UCMSCs,细胞呈纤维状;表达CD44、CD105、CD73、CD90,不表达与造血细胞和内皮细胞相关的CD34、CD45、CD31等标志物,不表达与移植物抗宿主病相关的HLA-DR等分子;在不同细胞因子作用下,可以被诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞和卵圆形肝细胞样细胞.结论 人脐带中含有较丰富的MSCs,在体外条件下可以被诱导为肝细胞样细胞.     

人脐血间充质干细胞分离培养方法的优化

目的探索脐血来源的间充质干细胞体外分离培养的更优方法。方法无菌条件下抽取正常足月剖宫产胎儿的脐带血,肝素抗凝,用淋巴细胞分离液分离脐血单个核细胞。50份脐血分为对照组和改良组,每组25份,分别以1.5×10^7/ml的细胞密度接种于25 cm^2培养瓶中。对照组贴壁3 d后弃上清,去除未贴壁细胞,更换新鲜培养液;改良组贴壁0.5 h后弃上清,去除未贴壁细胞,更换新鲜培养液。结果对照组杂细胞较多,最终成功培养出8份脐血间充质干细胞;改良组杂细胞较少,最终成功培养出18份脐血间充质干细胞。经流式细胞仪检测脐血间充质干细胞的免疫表型,结果显示,所培养出的脐血间充质干细胞不表达或极弱表达CD34、CD106等造血细胞标志,稳定地高表达CD29、CD44、CD105等间充质细胞相关的表面抗原标记物。结论采取脐血单个核细胞贴壁0.5 h弃上清更换新鲜培养液可以明显提高脐血间充质干细胞的培养成功率,其结果优于脐血单个核细胞贴壁3 d弃上清更换新鲜培养液。     

改良的人脐带间充质干细胞培养方法

目的:建立人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)的分离和培养方法,探讨hUCMSCs的成脂成骨分化潜能。方法:用酶消化法、传统组织块法和改良组织块法从人脐带中分离间充质干细胞,流式细胞仪检测其免疫表型;用不同的培养体系诱导hUCMSCs向成骨细胞及成脂细胞分化,并对其进行鉴定。结果:改良的hUCMSCs培养方法培养细胞纯度更高,在相同的培养时间内,改良组织块法所获得的细胞数量是酶消化法的2～3倍,是传统组织块法的20～30倍,细胞呈长梭形生长;高表达CD73、CD90、CD44、CD105,不表达CD31、CD45、CD34;茜素红染色及油红O染色证实了hUCMSCs可分化为脂肪细胞和成骨细胞。结论:建立了hUCMSCs的培养新方法,证实了hUCMSCs的增殖能力和多向分化潜能,为其治疗应用提供支持。     

人脐带间充质干细胞的分离、鉴定及向肝细胞的定向诱导分化

目的 分离纯化人脐带间充质干细胞(UCMSCs),探讨UCMSCs是否能在体外条件下被诱导成为肝细胞样细胞.方法 无菌条件下采集健康新生儿脐带,采用胰酶、胶原酶顺序消化法分离单个细胞,通过贴壁培养方法分离纯化间充质干细胞(MSCs).从形态、表面抗原、成脂肪细胞和成骨细胞分化潜能三方面进行鉴定.随后通过细胞因子诱导的方法将间充质干细胞诱导为肝细胞样细胞.结果 从人脐带中成功分离纯化得到UCMSCs,细胞呈纤维状;表达CD44、CD105、CD73、CD90,不表达与造血细胞和内皮细胞相关的CD34、CD45、CD31等标志物,不表达与移植物抗宿主病相关的HLA-DR等分子;在不同细胞因子作用下,可以被诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞和卵圆形肝细胞样细胞.结论 人脐带中含有较丰富的MSCs,在体外条件下可以被诱导为肝细胞样细胞.     

骨髓间充质干细胞支持脐血造血干／祖细胞体外扩增的研究

目的体外分离培养人新鲜脐血（UCB）造血干细胞（HSC），利用骨髓间充质干细胞作为滋养层联合细胞因子组合以扩增脐血造血干／祖细胞。方法采用Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离UCBHSC，加入骨髓间充质干细胞和细胞因子，检测脐血造血干／祖细胞总有核细胞（NC）总数和CD34^＋细胞数。结果有核细胞总数扩增（75．2±15．0）倍，CD34^＋细胞数扩增（18．7±12．3）倍。结论体外HSC培养，加入骨髓间充质干细胞和细胞因子对造血干／祖细胞增殖有明显的作用。     

强肌健力口服液含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞成肌分化的影响

目的观察强肌健力口服液含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)成肌分化的影响。方法用密度梯度离心法分离大鼠MSCs,5-溴脱氧嘧啶(Brdu)和CD44双重免疫组化鉴定,传3代后的MSCs分为强肌健力口服液含药血清组和空白对照组,免疫组化染色鉴定肌凝蛋白(Myosin)、结蛋白(Desmin)的表达。结果诱导后第3d,部分细胞出现Desmin和Myosin。结论强肌健力口服液含药血清诱导MSCs向成肌细胞定向分化。     

负载乳腺癌抗原的脐血树突细胞外泌体抗肿瘤免疫作用

目的:探讨负载乳腺癌抗原的人脐带血树突状细胞(DCs)分泌的外泌体的抗肿瘤免疫效应。方法:提取新鲜脐血单个核细胞,体外诱导分化为DCs,提取乳腺癌细胞MCF-7肿瘤抗原,并冲击脐血DCs,加入LPS诱导其成熟,利用流式细胞仪检测表型;超速离心法收获负载抗原的脐血DC外泌体;MTT法检测外泌体诱导的T淋巴细胞增殖反应及其激活的CTL对肿瘤细胞的杀伤效应。结果:脐血DC表面标志CD34、CD80、CD86、CD11c阳性细胞数与新鲜脐血单个核细胞相比明显增加(P<0.05);Western-Blot结果显示,负载乳腺癌的脐血DC外泌体携带有MHC-Ⅱ类、CD40、CD80、CD86分子;成熟脐血DC组及负载乳腺癌抗原脐血DC外泌体对同种异体来源的T细胞均有明显促增殖作用;负载乳腺癌抗原的脐血DC及其外泌体激活的CTL均能对乳腺癌细胞MCF-7产生显著地杀伤作用(P<0.05)。且在效靶比100∶1时,外泌体的杀伤作用高于负载抗原的脐血DC(P<0.05)。结论:负载乳腺癌抗原脐血DC分泌大量外泌体,可促进同种异体T细胞增殖,并能诱导特异性抗乳腺癌的免疫效应。     

克隆筛选法体外纯化骨髓间充质干细胞

目的尝试使用简单的克隆筛选法来纯化骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）并进行鉴定。方法对早期分离培养的BMSCs，采取低密度接种（10／cm^2），待有单克隆形成，用细胞刮除去其他细胞，将克隆的细胞以低密度接种，待再次有单克隆形成时可重复以上操作，反复进行筛选。对筛选的BMSCs生物学特性进行观察，FACs鉴定BMSCs的标记物的表达，并进行成脂、成骨诱导试验。结果采用克隆筛选法培养BMSCs在传代筛选2—3代后即可获得形态均一的细胞群，FACs鉴定细胞高表达BMSCs的阳性标记物（CD2998．8％，CD9098．4％），低表达BMSCs的阴性标记物（CD312．6％，CIM53％）。BMSCs能被高效地诱导向脂肪和骨分化。结论本实验采用的克隆筛选法可在短期内获得高纯度的BMSCs，方法简单易行而效率高。