基于转录组测序揭示光质对刺五加实生苗基因表达的调控作用

目的 对刺五加Acanthopanax senticosus实生苗进行转录组测序,分析其响应不同光质调控的分子机制。方法 以生长60 d的刺五加实生苗为材料,设置不同光质处理组（LED-1、LED-2）和对照组[高压钠灯（high pressure sodium,HPS）],应用Illumina HiSeq^TM对其叶片进行转录组测序,对测序后的结果进行基因功能注释、差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）筛选和共表达网络分析。结果 转录组测序共获得126 252条Unigene。其中92 681条被注释,3个处理组中筛选出DEGs 7664个。基因本体（gene ontology,GO）富集结果表明,DEGs在代谢过程、刺激响应、细胞结构、催化活性等功能中得到显著富集。京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）途径富集分析表明,DEGs显著富集在植物激素传导、糖代谢、苯丙烷类生物合成、类黄酮生物合成。适度光质胁迫可以促进刺五加实生苗中苯丙素类化合物生物合成途径关键酶基因的表达,是促进刺五加有效成分累积的基础。结论 通过高通量转录组测序,揭示了不同光质对刺五加实生苗基因表达的调控特征,可为深入研究刺五加药效成分的生物合成机制及栽培中的光环境设置提供科学依据。     

基于高通量测序的野生和栽培当归转录组分析

为获得甘肃省宕昌地区野生和栽培当归转录水平差异,运用PacBio SMRT三代高通量测序技术测定当归全长转录组,利用Illumina HiSeq X Ten PE150二代高通量测序技术进行野生和栽培当归转录组差异表达测序分析,全长转录共获得16.5 Gb数据,组装得到113 906个转录本,平均长度1 466 bp。BLAST分析显示分别有109 113(95.79%),93 276(81.89%),60 638(53.24%),48 928(42.95%),42 876(37.64%)条转录本在NR,Swiss-port,GO,KO,KOG数据库得到注释信息,可归为GO分类的生物过程、细胞组分和分子功能3大类,涉及128条KEGG标准代谢通路。2组样品二代测序共获得25 463条差异表达转录本,其中在野生当归中存在高表达的有15 090条,在栽培当归中存在高表达的有10 373条,对其进行GO和KEGG富集分析,差异转录本主要集中于植物-病原体相互作用(plant-pathogen interaction)、MAPK信号通路-植物(MAPK signaling pathway-plant)和植物激素信号转导(plant hormone signal transduction)等通路。该研究利用高通量测序手段获得当归全长转录信息,明确当归遗传信息的整体特征,通过比较野生当归和栽培当归在转录本层次的差异表达,为当归优良种质资源的筛选培育、抗性研究和次生代谢途径解析提供基础信息。     

金钗石斛根茎叶转录组测序及木脂素合成相关基因分析

目的 研究金钗石斛根、茎、叶基因表达差异情况,同时分析木脂素合成途径关键酶基因表达特性,为金钗石斛木脂素合成分子机制研究提供参考。方法 以金钗石斛为材料,分别提取根、茎、叶的总RNA,利用DNBSEQ平台进行转录组测序及生物信息学分析。结果 金钗石斛根和叶相比差异表达基因较多,叶和茎相比差异表达基因较少,有879个基因是3个样本比较组所共有的。GO分类中差异表达基因主要富集在生物学过程中,KEGG富集分析中差异表达基因主要被富集到α-亚麻酸代谢途径、甘油磷脂代谢途径、氰基氨基酸代谢途径等途径中。在木脂素合成相关基因中,发现2个CAD基因、1个DIR基因、4个UGT基因在根、茎、叶中的表达模式与木脂素含量分布一致。结论 该研究获得了金钗根、茎、叶中差异表达基因信息,筛选到了与木脂素合成相关基因,初步构建了金钗石斛木脂素合成网络图,为开展金钗石斛木脂素合成分子机制研究提供数据支持。     

珍稀药用植物珠子参的转录组测序及分析

药用植物珠子参的根茎在中国西南区域已有上千年的药用历史,三萜皂苷为珠子参最主要的活性成分。为了探索珠子参根茎中皂苷物质生物合成的分子基础,该文采用Illumina HiSeq 2000高通量测序获得珠子参根茎的转录组数据;使用Trinity和TGICL软件实现Unigene的de novo拼接;基于BLAST完成Unigene的蛋白功能注释、KOG功能注释、GO分类和KEGG代谢通路分析。最终获得了短读序15.6 Gb,通过de novo拼接注释得到Unigene 62 240个。研究发现,珠子参根茎部表达的19个Unigene与三萜碳环骨架合成相关;69个Unigene与介导三萜碳环骨架的氧化和羟基化等修饰的CYP450相关,18个Unigene与负责三萜碳环骨架的糖基化的糖基化转移酶相关。该研究发现的三萜皂苷合成相关候选基因对于阐明珠子参三萜皂苷合成方式研究提供了重要的基础。     

基于转录组测序的青天葵差异表达基因分析

目的在青天葵球茎和叶片两个组织的转录组测序数据的基础上,进行差异表达基因(differential expressed gene,DEG)的筛选和分析。方法采用Reads Per Kb per reads(RPKM)方法计算青天葵转录组测序获得的单基因(unigene)在球茎和叶片中表达量,根据球茎和叶片之间RPKM的log2倍数绝对值大于1且错误发现率小于0.01筛选DEG,将DEG归类至Nr、GO、KEGG等公共数据库获取其功能释义;并基于功能注释,挖掘参与青天葵激素合成和信号传导过程的DEG。结果筛选出符合条件的DEG共62 605条,包括了31 488条表达上调DEG和31 117条表达下调DEG。分别有51 652条和14 215条DEG在GO和KEGG数据库中获得注释,涵盖GO数据库的42个功能亚类和KEGG数据库的280条代谢途径。在挖掘到的16个与青天葵激素合成和信号传导过程的DEG中,7个为上调表达基因,9个为下调表达基因。结论通过转录组测序数据较全面地提供了青天葵球茎和叶片基因的差异表达情况,为青天葵的功能基因的克隆和功能分析等提供研究基础和理论依据。     

款冬叶不同发育阶段的转录组学分析

目的比较不同生长时期款冬叶中苯丙素类成分生物合成相关基因的表达,推测苯丙素类成分的最佳合成积累时期,为款冬叶资源的合理利用提供科学依据。方法利用Illumina Hi Seq2500测序技术对不同时期的款冬叶进行转录组测序,获得转录组数据后进行基因功能注释等生物信息学分析,对苯丙素类生物合成相关基因在不同时期的表达进行比较。结果通过转录组测序技术获得46 793个Unigenes,平均长度为952.144 8 bp,其中有4 774个可以被NR、Swiss-Prot、eggNOG、GO、KEGG等公共数据库共同注释。对注释得到的Unigenes进行KEGG代谢通路分析,结果显示款冬叶转录组中有144条Unigenes参与萜类、黄酮类和苯丙素类生物合成,其中萜类65条,苯丙素类64条,黄酮类15条。进一步对参与苯丙素类生物合成相关基因进行动态比较,发现其关键酶PAL、4CL、HCT、CCoAOMT等在9月的表达量最高,即苯丙素类成分在9月的生物合成量可能最高。结论为苯丙素类成分的生物合成途径及调控分析奠定了基础,也为款冬叶资源的开发利用奠定了科学依据。     

利用转录组测序分析与华重楼种子休眠解除相关差异基因

为探究华重楼种子休眠解除过程中差异基因的表达情况及相关代谢通路,以华重楼休眠解除前后种胚为材料,利用新一代高通量测序手段对供试样品进行转录组测序并进行系统生物信息学分析。从cDNA文库中分别获得62 882 650,62 263 366个clean reads,共得到69 248个差异表达基因,上调的表达基因有56 426个,下调的表达基因有12 822个。共有138 267个差异表达基因被GO功能注释到生物进程、分子功能和细胞组分3个大类58个亚类,注释的差异表达基因与代谢过程、生物调控、细胞组分合成和酶催化活性等密切相关。对58 722个差异表达基因进行pathway显著性富集分析,共发现139个代谢通路,休眠前后的DEGs主要富集在碳代谢、次生代谢产物生物合成和多糖代谢等途径。基于KEGG数据库中注释结果,共发现16条与华重楼休眠解除相关的代谢通路。华重楼种子发育与休眠解除过程中大量与种胚形态建成、多糖分解及蛋白质合成的差异基因参与表达,涉及到多个代谢途径的相互作用,构成复杂的休眠解除调控网络。     

罗勒花和叶的转录组数据组装及基因功能注释

目的系统了解罗勒Ocimum basilicum花和叶的转录组特征,丰富罗勒转录组数据信息。方法选取罗勒新鲜花朵和叶片为材料,利用Illumina Hi SeqTM 2500进行高通量测序,构建罗勒花和叶转录组文库,并用测序评估、转录组数据组装和基因功能注释等生物信息学方法进行分析。结果对原始数据进行除杂之后,共获得86 331 137个reads片段,包含了6 455 365 309个核苷酸序列信息;将质控后得到的高质量序列进行de novo拼接,得到了90 341个Unigene片段。将Unigene与COG数据库进行比对表明,罗勒的花和叶转录组中的Unigene根据功能可大致分为25类;根据GO功能分类可大致分为生物过程、细胞组分和分子功能3大类43分支;利用KEGG数据库作为参考,依据代谢通路可以将转录组中的数据分成111类,包括生化代谢通路、植物病原体互作、DNA剪切、植物激素生物合成、苯丙氨酸生物合成、萜类化合物与类固醇类化合物合成、脂类代谢、RNA降解等。MISA软件成功设计15 617对SSR引物,检测到10 254个SNP位点。结论研究结果为后期罗勒功能基因的挖掘、代谢途径及调控机制的研究奠定了理论基础。     

基于转录组测序的越南安息香根、茎和叶基因表达分析

目的对越南安息香Styrax tonkinensis进行转录组测序,获得其根、茎和叶的转录组信息特征。方法以越南安息香的根、茎和叶作为研究对象,使用Illumina HiSeq TM 2000进行越南安息香根、茎和叶的转录组测序分析。结果转录组测序根、茎和叶共获得53 835 045条高质量序列(clean reads),Trinity de novo组装获得69 151条Unigenes,平均长度778.51nt。BLAST分析表明分别有41 412(59.89%)、31 189(45.10%)、25 539(36.93%)、16 749(24.22%)个Unigenes在Nr、Swiss-port、KOG、KEGG数据库中得到注释,可归入GO分类的细胞组分、生物过程和分子功能3大类46分支,涉及129条KEGG标准代谢通路,其中有31个次生代谢标准通路。蛋白编码框序列3 461个,涉及高等植物转录因子54个家族。使用MISA软件挖掘10 974个简单重复序列(SSRs),二碱基重复SSRs数量最为丰富,有6282个(57.24%),五碱基重复SSRs最少,占2.45%。结论利用高通...     

天冬全长转录组测序分析

目的:获得天冬Asparagus cochinchinensis(Lour.)Merr.全长转录组数据库,为探索其活性成分生物合成提供参考。方法:利用RNA-Seq技术对天冬的根、茎、叶进行转录组测序并分析。结果:从天冬转录组中共获得169319条isoforms,最终有147762条isoforms在公共数据库中注释成功。非冗余蛋白(NR)数据库结果显示,天冬与石刁柏Asparagus officinalis L.同源性最高;真核生物相邻类的聚簇(KOG)功能注释信息334380条,可分为25个基因功能大类;京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析显示,代谢相关的通路分布最多,为74095条。在注释到的54个转录因子家族中,MYB家族数目最多,共309条。在所有isoform中共检测到48042个简单重复序列位点,从单核苷酸到六核苷酸重复单元均有分布。结论:获得了较为可靠的天冬全长转录组数据,可为深入研究天冬生物学特性、相关代谢途径、信号通路及其分子机制提供数据支持。     

刺五加GAPDH基因组DNA的克隆与分析

目的克隆刺五加GAPDH基因的DNA及启动子序列,并进行生物信息学分析。方法以刺五加的基因组DNA为模板,采用PCR和TAIL-PCR技术克隆GAPDH基因的全长DNA序列及5’端上游启动子序列,并对其进行生物信息学分析。结果克隆到长4 103 bp的刺五加GAPDH基因全长DNA及启动子序列。该基因共包含12个外显子和11个内含子,其剪切均符合GT-AG原则。刺五加GAPDH的启动子片段长1 304 bp,转录起始位点A位于起始密码子ATG上游61 bp处。启动子除含有TATA-box、CAAT-box等基本元件外,还有诸多与激素应答、光响应和胁迫信号等有关的顺式作用调控元件。结论首次克隆到刺五加GAPDH基因的全长DNA及启动子序列,为深入研究GAPDH基因结构特征与功能奠定基础。     

刺五加液泡膜内在蛋白基因的克隆与表达分析

目的克隆刺五加的液泡膜内在蛋白(tonoplast intrinsic proteins,TIP)基因,并对其进行生物信息学和表达分析。方法采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆刺五加TIP基因cDNA的全长序列。以GAPDH为内参照基因,通过RT-PCR法检测TIP基因在不同生长发育时期和器官中的表达情况。结果刺五加TIP基因cDNA的全长1 080 bp,开放阅读框长756 bp,编码251个氨基酸的蛋白,该蛋白包含TIP家族的标志性序列。刺五加的TIP蛋白具有6个跨膜螺旋,定位于液泡膜。表达分析结果显示,刺五加TIP基因在不同生长发育时期和不同器官中均有表达,但表达量具有显著差异(P<0.05)。其中盛花期的表达量最高,是最低量果实快速生长期的2.07倍;各器官中,叶片的表达量最高,是最低量根的1.73倍。结论首次分离到刺五加TIP基因的cDNA全长序列,并证实其在盛花期的叶中表达量最高,为进一步研究TIP基因对刺五加水分代谢的影响奠定基础。     

刺五加β-香树酯醇合成酶基因的克隆及其表达与皂苷量的相关性

目的克隆刺五加的β-香树酯醇合成酶(β-amyrin synthase,bAS)基因,并分析其表达对皂苷量的影响。方法利用同源克隆法克隆刺五加的bAS基因。利用Real time PCR技术,分析刺五加bAS基因的表达规律,分光光度法测定总皂苷量。结果克隆到cDNA长度分别为1223、1226 bp的刺五加bAS1、bAS2基因。bAS1和bAS2基因在各时期和器官中均有表达,但表达量差异显著(P0.05)。bAS1基因在萌芽期的表达量最高,之后迅速降低,并基本维持恒定。在整个生长期中bAS2表现出低→高→低的表达特点。bAS1基因在各器官中的表达量基本恒定,bAS2基因在叶片中的表达量最高。茉莉酸甲酯(MeJA)处理后,bAS1基因的表达未发生显著变化,bAS2的表达量显著上升。刺五加的皂苷量与bAS2呈极显著的正相关关系(P0.01),bAS1基因未达显著水平。结论 bAS2可能是催化刺五加三萜皂苷生物合成的关键酶。     

刺五加GPS基因克隆及表达特征与皂苷含量相关性研究

目的克隆刺五加香叶基焦磷酸合成酶(geranyl pyrophosphate synthase,GPS)基因的cDNA序列并分析基因序列特征、不同器官中基因表达水平及其与皂苷含量的相关性。方法提取刺五加的RNA,逆转录为cDNA。根据转录组测序结果中编码GPS的unigene(c37362.graph_c0),设计特异性引物,经过PCR扩增GPS基因的cDNA全长。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析GPS基因在不同器官中的表达水平,并通过分光光度法检测刺五加总皂苷含量。结果克隆得到长1260bp、编码419个氨基酸的刺五加GPS基因cDNA。GPS蛋白定位于线粒体内且不存在跨膜区域。GPS基因在各个器官中均有表达,在叶片中的表达量最高,是根中表达量的5.26倍。GPS基因的相对表达量与皂苷量呈现出同升同降的变化趋势,表现为显著正相关关系(r=0.851,P0.05)。结论首次克隆获得刺五加GPS基因的cDNA全长序列,明确了刺五加GPS基因的表达量与皂苷含量之间存在正相关关系。     

刺五加亚精胺合成酶基因的克隆及内生真菌对其表达的影响

目的 克隆刺五加亚精胺合成酶(spermidine synthase,SPDS)基因,并分析内生真菌对其表达的影响.方法 采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆刺五加SPDS基因全长cDNA序列.运用生物信息学方法对该基因进行分析.RT-PCR法检测内生真菌菌株P116-1a、P116-1b、P109-4和P312-1对SPDS基因表达的影响.结果 刺五加SPDS基因的cDNA全长为1 541 bp,开放阅读框长1 002 bp,编码333个氨基酸的蛋白,包含SPDS家族的基本结构和标志性序列.RT-PCR结果显示,内生真菌可显著提高刺五加SPDS基因的表达量(P＜0.05),最大表达量出现在菌株P116-1b回接90 d时,是对照的2.06倍.结论 首次克隆了刺五加SPDS基因的cDNA全长序列,并证实内生真菌可显著提高刺五加SPDS基因的表达,为阐明内生真菌提高刺五加三萜皂苷量的机制及刺五加的抗逆性改良奠定了基础.     

刺五加MDD基因启动子的克隆与生物信息学分析

目的克隆并分析刺五加甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(mevalonate diphosphate decarboxylase,MDD)基因的启动子序列。方法根据刺五加MDD基因的c DNA序列,采用PCR扩增和热不对称交错PCR(TAIL-PCR)技术,克隆MDD基因5’端的DNA序列及启动子序列。利用Plant CARE等软件对其进行生物信息学分析。结果克隆得到长1 423 bp的刺五加MDD基因启动子序列及长1 024 bp的5’端DNA序列。该启动子序列含有49个TATA-box、25个CAAT-box。还含有脱落酸响应元件、茉莉酸甲酯响应元件、胚乳表达必须顺式作用元件、干旱胁迫响应元件、光响应元件等多种顺式作用元件,以及2个MYBHv1与2个MBY结合位点。结论首次克隆并分析了刺五加MDD基因的启动子序列,为该基因的表达调控奠定了基础。     

刺五加P450基因的筛选及其表达对皂苷含量的影响

目的 筛选和鉴定刺五加Eleutherococcus senticosus中的细胞色素P450基因(EsP450),分析其进化特征,探究其与刺五加总皂苷含量的相关性.方法 根据转录组测序结果,筛选得到EsP450基因,并对其进行生物信息学分析与适应性进化分析,采用qRT-PCR法检测EsP450基因的表达量,采用分光光...     

刺五加肌动蛋白基因的克隆和表达稳定性分析

目的 克隆刺五加Eleutherococcus senticosus的肌动蛋白(actin,ACT)基因并使其成为可用的内参基因.方法 运用RT-PCR法克隆ACT基因的部分序列,并以其为内参基因进行半定量PCR和real-time PCR分析.结果 克隆了长度为1 031bp的刺五加ACT基因,推测其编码343个氨基酸,与光皮桦Betula luminifera、陆地棉Gossypium hirsutum、茶树Camellia sinensis的ACT氨基酸序列同源性分别为99.42％、98.83％、98.54％.刺五加ACT基因在不同器官和不同生长发育时期的表达量基本恒定,以其为内参基因的半定量PCR和real-time PCR均具有良好的扩增效果和重现性.结论 首次分离并报道了刺五加ACT的cDNA克隆,证实该序列可以作为基因表达分析的内参基因,建立了其real-time PCR反应体系.     

刺五加鲨烯环氧酶基因家族2成员表达特性的分析

刺五加的鲨烯环氧酶(SE)基因家族存在2个成员。 为了探明其表达特性,利用实时荧光定量PCR技术,分析刺五加SE1,SE2在不同生长发育时期、器官和茉莉酸甲酯(MeJA)处理对其表达及皂苷含量的影响。结果表明,刺五加SE2在各时期、器官中表达量均显著高于SE1。在整个生长期中SE1表现为低-高-低的特点,SE2则表现出随着生长的进行而显著降低的变化趋势,两者均在根中的表达量最低,MeJA处理对SE1的提升水平显著高于SE2。刺五加的皂苷含量与SE1表达量间的相关系数为0.858,呈显著的正相关关系(P<0.05),而SE2未达显著水平。说明SE1是催化刺五加三萜皂苷生物合成的关键酶。     

刺五加的化学成分研究

目的 对刺五加Acanthopanax senticosus的化学成分进行研究.方法 刺五加药材用75％乙醇提取,依次用石油醚、醋酸乙酯萃取,对醋酸乙酯部分采用硅胶柱色谱、反相制备色谱等技术进行分离,根据波谱学数据(MS、1H-NMR、13C-NMR)进行化合物的结构鉴定.结果 从醋酸乙酯部分分离得到19个化合物,分别鉴定为槲皮素(1)、槲皮苷(2)、山柰酚(3)、金丝桃苷(4)、芦丁(5)、金合欢素(6)、大豆苷(7)、3′-甲氧基大豆苷(8)、葛根素(9)、3′-甲氧基葛根素(10)、4′-甲氧基葛根素(11)、丁香醛(12)、丁香酸(13)、紫丁香酸葡萄糖苷(14)、异嗪皮啶(15)、2,3-二(3′,4 ′-二甲氧基苄基)-2-丁烯-4-内酯(16)、l-芝麻酯素(17)、methylpluviatolide (18)、4′-羟基-2′-甲氧基肉桂醛(19).结论 化合物6～11、14、16、18、19为首次从该属植物中分离得到.