SOX9在青少年特发性脊柱侧凸患者骨髓间质干细胞的表达及意义

目的：探讨SOX9在青少年特发性脊柱侧凸（AIS）发病机制中的作用。方法：30例12～18岁志愿者分为两组，AIS组20例，同年龄对照组10例。分别从髂前上棘处穿刺抽取10ml骨髓，肝素抗凝。采用密度梯度离心法分离骨髓间质干细胞（MSCs），体外培养并传至P2代行表型鉴定，分别采用RT—PCR法、Western blotting法及免疫荧光法检测两组MSCs中SOX9的表达情况。结果：不论是核酸水平还是蛋白水平，AIS组患者的SOX9表达均高于对照组（P〈0．01）。结论：转录因子SOX9在MSCs水平表达强度的异常可能与AIS发病相关。     

RANKL/QPG在青少年特发性脊柱侧凸患者低骨量发生机制中的作用

目的从骨髓间质干细胞（MSCs）水平探讨RANKL及OPG与青少年特发性脊柱侧凸（AIS）患者骨量降低的关系。方法46例12-17岁志愿者分为2组,其中AIS组30例,年龄12-17岁,平均14.1岁。正常对照组16例,年龄12-17岁,平均14.7岁。AIS组Lenke1型14例,2型2例,3型6例,5型8例。2组均采用双能X线吸收测量仪测量BMD,测量部位包括非优势侧股骨近端及腰椎。分别从2组志愿者髂前上棘处骨穿刺抽取10ml骨髓,肝素抗凝。体外密度梯度离心法分离培养MSCs,扩增至P3代行表型鉴定,RT-PCR法检测2组MSCs中RANKL及OPG的 mRNA表达强度。结果AIS组腰椎（L2-L4）及股骨近端的BMD值明显低于正常对照组。AIS组RANKL的 mRNA表达显著强于对照组（P〈0.01）,而OPG的 mRNA表达显著低于对照组（P〈0.01）。结论RANKL及OPG在MSCs水平表达强度的异常可能与AIS骨量降低的分子机制相关。     

Smad1在青少年特发性脊柱侧凸患者骨髓间质干细胞中的表达及意义

目的:探讨Smad1在青少年特发性脊柱侧凸(AIS)患者骨髓间质干细胞(MSCs)中的表达及其在发病机制中的作用。方法:30例12～18岁志愿者分为两组:AIS组20例,同年龄正常对照组10例。分别从髂前上棘处骨穿刺抽取10ml骨髓,肝素抗凝。采用密度梯度离心法分离MSCs,体外培养并传至P2代行表型鉴定,分别采用RT-PCR及免疫蛋白印记法检测两组患者MSCs中Smad1的表达情况。结果:AIS组与对照组Smad1mRNA水平的平均表达率分别为4.48±0.58和1.03±0.22,蛋白水平的平均表达率分别为2.62±0.55和0.84±0.22。不论是核酸水平还是蛋白水平AIS组Smad1的表达均高于对照组(P<0.01)。结论:Smad1在AIS患者MSCs中表达强度异常,可能与AIS发病的分子机制相关。     

青少年特发性脊柱侧凸患者椎体生长板中Runx2及X型胶原表达

目的：观察青少年特发性脊柱侧凸（AIS）患者上、下端椎和顶椎椎体生长板凸、凹侧软骨细胞的生物活性差异．探讨其在AIS发生和发展中的作用。方法：在对12例AIS患者行胸椎侧凸前路松解手术或前路矫形手术时获取上、下终椎和顶椎椎体生长板，分成凸、凹侧2组，共72枚标本，应用免疫组织化学方法检测Runx2和X型胶原蛋白的表达．原位杂交方法检测Runx2mRNA表达。所有染色结果通过图像分析系统进行半定量分析。结果：AIS患者顶椎椎体生长板凸、凹两侧的X型胶原、Runx2和Runx2 mRNA表达总量存在显著性差异（P〈0．05）。顶椎椎体生长板凹侧X型胶原的表达总量低于下终椎椎体生长板凹侧的表达总量（P〈0．05）。顶椎椎体生长板凹侧Runx2的表达总量低于上、下终椎椎体生长板凹侧的表达总量（P〈0．05）。顶椎椎体生长板凹侧单一软骨细胞Runx2表达量高于凸侧和上、下终椎椎体生长板凹侧单一软骨细胞的表达（P〈0.05）。顶椎椎体生长板凹侧高倍视野下平均Runx2mRNA表达总量低于上、下终椎椎体生长板的凹侧（P〈0．05）。顶椎椎体生长板凸侧单一细胞Runx2 mRNA表达量低于凹侧（P〈0.05）。顶椎椎体生长板凹侧高倍视野下平均X型胶原阳性细胞密度和Runx2阳性细胞密度低于凸侧和上、下终椎椎体生长板凹侧阳性细胞密度（P〈0．05）。结论：AIS患者上、下终椎和顶椎椎体生长板凸、凹侧软骨细胞存在不同的生物活性和细胞动力学，这可能是力学条件改变后的一种继发性改变，但其可能在AIS的进展中发挥重要作用。     

脊柱侧凸顶椎区椎间盘纤维环中多聚蛋白多糖的表达及意义

目的：探讨脊柱侧凸患者顶椎区椎间盘纤维环中多聚蛋白多糖的表达及其意义。方法：采集2003年7月至2004年9月间行前路松解或矫形手术的40例脊柱侧凸患者侧凸顶椎区椎间盘组织。青少年特发性脊柱侧凸患者（adolescent idiopathic scoliosis，AIS）25例，胸椎椎间盘11例，腰椎椎间盘14例；先天性脊柱侧凸患者（congenital scoliosis，CS）15例，胸椎椎间盘6例，腰椎椎间盘9例。利用RT—PCR扩增多聚蛋白多糖（Aguecan），琼脂糖凝胶电泳，在UVP（紫外光测定法）成像系统进行扫描．GelWork图像分析系统中进行灰度测定半定量分析。分别计算AIS组和CS组凹侧、凸侧纤维环中Aggrecan含量，并对CS组和AIS组胸椎和腰椎以及椎间盘的凹侧和凸侧进行比较。结果：AIS组和CS组椎间盘凹侧纤维环中Aggrecan含量低于凸侧．差异有显著性（P〈0．01），胸椎椎间盘纤维环中Aggrecan的含量低于腰椎，但无统计学差异。AIS组Aggrecan的含量和CS组相应部位Aggrecan的含量无明显差别。结论：AIS椎间盘纤维环凹凸侧存在Aggrecan代谢差异．并且可能是脊柱侧凸所致的继发改变．但也可能是脊柱侧凸发生、发展中的重要因素。     

M-CSF在青少年特发性脊柱侧凸患者成骨细胞中的表达及意义

目的从成骨细胞（osteoblast,OB）水平探讨巨噬细胞集落因子（macrophage colony stimulating factor,MCSF）与青少年特发性脊柱侧凸（adolescent idiopathic scoliosis,AIS）患者骨量降低的关系。方法AIS患者27例,其中男25例,女2例;年龄12～18岁,平均14.9岁;Cobb角40°～94°,平均57.3°。将所有AIS患者分为两组：A组14例,为骨量正常患者;B组13例,为骨量减低患者。正常对照组8例（定为C组）,年龄12～18岁,平均15.3岁。3组均采用双能X线吸收测量仪（dual-energy X-ray absorptiometry,DEXA）测量骨密度（bone mineral density,BMD）,测量部位包括非优势侧股骨近端及腰椎。所有受试者术中取适量髂前上嵴的松质骨,运用植块法培养成骨细胞。培养至P3代后行表型鉴定,用RT-PCR检测AIS组和正常对照组中M-CSF mRNA的表达水平。结果B组中M-CSFmRNA的表达量均较A组（P〈0.05）和C组高（P〈0.05）,A组与C组M-CSFmRNA的表达量无显著统计学差异（P〉0.05）。结论M-CSF在OB水平mRNA表达强度的异常可能与AIS骨量降低的分子机制相关。     

特发性脊柱侧凸患者两侧椎旁肌中肌梭与运动终板病理学变化的对比研究

目的：对青少年特发性脊柱侧凸（AIS）患者两侧椎旁肌中肌梭与运动终板的病理学变化进行对比研究，探讨其与脊柱侧凸病因学可能存在的关系。方法：选取手术治疗的脊柱病变患者共41例．分3组．其中AIS组20例，平均年龄15．3岁，平均Cobb角56．8^o，顶椎位于T7～T12；先天性脊柱侧凸（CS）组ll例。平均年龄13．9岁，平均Cobb角66．7^o，顶椎位于T7～T12；对照组10例，均为非脊柱侧凸病例，其中l例腰椎滑脱、l例腰椎管肿瘤、2例Scheuermann’s病、6例腰椎间盘突出症，平均年龄17．3岁。经患者知情同意，所有病例均于术中取材，AIS组和CS组取顶椎区两侧椎旁肌，对照组取非病变区两侧椎旁肌。标本分别行HE染色和非特异性酯酶（ANAE）染色，对3组病例两侧椎旁肌中肌梭的形态结构、梭内肌纤维数目、平均横截面积以及运动终板的类型进行比较。结果：AIS组患者两侧椎旁肌标本共发现19个肌梭，CS组患者两侧椎旁肌标本共发现13个肌梭，对照组两侧椎旁肌标本共发现5个肌梭。AIS和CS组患者凸侧椎旁肌肌梭内的肌纤维数目及平均横截面积显著大于凹侧椎旁肌（P〈0．05）。AIS和CS组凹侧椎旁肌哟型终板数目和病变终板数目均显著多于凸侧椎旁肌（Pl〈0．05）。对照组两侧椎旁肌哟型终板数目和病变终板数目无显著差异（P＞0．05）。结论：AIS患者两侧椎旁肌中肌梭的形态结构和运动终板的类型存在差异，这种差异可能是脊柱侧凸的继发性改变。     

青少年特发性和先天性脊柱侧凸患者与正常青少年平衡能力的差异性研究

目的 比较青少年特发性脊柱侧凸（adolescent idiopathic scoliosis,AIS）患者和先天性脊柱侧凸（congenital scoliosis,CS）患者与正常青少年平衡能力的差异,探讨AIS患者发生平衡功能障碍的原因。方法研究对象包括AIS患者12例、CS患者10例和正常青少年志愿者10例。检查分为4部分：（1）睁眼检查;（2）闭眼检查;（3）睁眼＋踝部震动检查;（4）闭眼＋踝部震动检查。应用静态姿势描记仪对所有受试者进行检测,测量总轨迹长（general locus length,GLL）和外周面积（external area,EA）。将AIS组、CS组和正常对照组组间相应的感觉状态下的检测指标进行方差分析,并对各组内受试者在不同感觉状态下的检查结果进行方差分析。结果4种感觉状态下AIS组和CS组的平衡功能较正常对照组差;而4种感觉状态下AIS组和CS组的平衡功能无显著性差异。在睁眼和闭眼检查时,AIS组组内GLL无显著性差异。闭眼和睁眼＋踝部震动检查时,正常对照组组内的GLL和EA无显著性差异。结论AIS出现平衡功能障碍继发于脊柱的三维畸形,AIS患者平衡的维持主要依赖本体感觉。     

转录因子Runx2在青少年特发性脊柱侧凸患者成骨细胞中的表达及其意义

目的 从成骨细胞(OB)水平探讨转录因子Runx2与青少年特发性脊柱侧凸(AIS)患者骨量降低的关系.方法 2008年3月至12月行后路手术的AIS患者28例为试验组,男性2例,女性26例;年龄12～18岁,平均14.9岁;Cobb角40～94°,平均57.3°.试验组根据骨密度(BMD)情况又分为:A组(骨量正常组)15例,B组(骨量减低组)13例.正常对照组(C组)为住院治疗的非脊柱畸形的8例患者,男性6例,女性2例;年龄12～18岁,平均15.3岁.各组均采用双能X线吸收测量仪(DEXA)测量骨密度(BMD),测量部位包括非优势侧股骨近端及腰椎.所有受试者术中取适量髂前上嵴的松质骨,运用植块法培养OB.培养至P2代后行表型鉴定,用RT-PCR和Western blot法检测各组Runx2 mRNA及蛋白的表达水平并进行统计学分析.结果 Runx2的mRNA及蛋白水平的表达,B组较A组和c组均降低,差异均有统计学意义(P<0.05),A组与C组差异无统计学意义(P>0.05).结论 Runx2在OB水平mRNA及蛋白表达水平的异常可能与MS骨量降低的分子机制相关.     

青少年特发性脊柱侧凸患者软骨细胞中Sox9的表达及意义

目的:检测转录因子Sox9在青少年特发性脊柱侧凸(AIS)患者软骨细胞中的表达,探讨其在AIS患者生长发育异常中的可能作用.方法:14例(男1例,女13例)年龄10～16岁(平均13.1岁)的AIS患者(AIS组),Cobb角41°～88°,平均51.4°;8例(男1例,女7例)非AIS患者(对照组),年龄10～15岁,平均12.9岁;腰椎骨折1例,脊髓室管膜瘤1例,腰椎间盘突出症1例,脊柱骨样骨瘤1例,先天性髋关节脱位4例.在行手术治疗时获取髂骨生长板软骨,采用酶消化法体外分离、培养、传代,并观察细胞形态;采用Ⅱ型胶原细胞免疫组织化学法对传至P2代的细胞行表型鉴定;采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western blotting)法检测两组软骨细胞中Sox9 mRNA及蛋白表达情况.结果:酶消化法体外单层培养软骨细胞成功;细胞传至P2代时具有软骨细胞的典型形态特征,呈多角状;Ⅱ型胶原细胞免疫组化染色呈阳性,细胞胞浆内可见棕褐色颗粒,很好地保持了软骨细胞的表型特征;AIS组患者软骨细胞中Sox9核酸表达强度为1.08±0.14,蛋白表达强度为0.38±0.14,均较对照组高(P<0.05).结论:转录因子SOx9在软骨细胞水平表达强度的异常可能与AIS患者生长发育异常有关.     

青少年特发性脊柱侧凸患者骨髓间充质干细胞褪黑素信号通路初步研究

目的 研究青少年特发性脊柱侧凸(Ms)患者骨髓间充质干细胞(BMSCs)褪黑素信号通路是否存在异常.方法 24例12～18岁志愿者,AIS患者15例,正常对照组9例.分别从患者髂前上棘处穿刺抽取10 ml骨髓,肝素抗凝.采用密度梯度离心法分离BMSCs,体外培养并传至P3代,进行表型鉴定.取P3代BMSCs,先采用福斯可林刺激BMSCs内环磷酸腺苷(cAMP)升高,然后用不同浓度褪黑素刺激细胞,检测细胞内cAMP的水平.结果 分离的单个核细胞经培养至P3代,使用流式细胞仪进行细胞表型鉴定,体外培养细胞的表型与BMSCs的表面标志相符.AIS组和正常对照组BMSCs的cAMP的基础水平都很低,在给予福斯可林刺激以后,cAMP的水平明显升高,此后再给予生理剂量的褪黑素刺激后,两组cAMP水平的抑制程度差异无统计学意义(P>0.05);给予药理剂量的褪黑素刺激后,两组cAMP水平的抑制程度差异同样无统计学意义(P>0.05).结论 MS患者BMSCs褪黑素信号通路可能不存在异常.     

犬骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞定向分化的研究

目的：研究犬骨髓间充质干细胞（MSCs）在体外定向诱导,向血管内皮细胞（ECs）方向分化,探讨其作为组织工程血管种子细胞的可行性。方法：获取犬骨髓单个核细胞,体外分离出MSCs。将分离的MSCs接种于含EBM-2完全培养液的培养瓶,向内皮样细胞定向诱导分化;LG-DMEM完全培养液培养的MSCs作为对照组。对MSCs表型进行流式细胞仪鉴定;诱导的内皮样细胞进行CD31、Ⅷ因子免疫细胞化学鉴定和摄取Dil-Ac-LDL、结合FITC-UEA的双染色功能鉴定。结果：流式细胞术检测培养的原代MSCs表面标志CD44表达呈阳性,而CD34表达则呈阴性;诱导分化的内皮样细胞具有内皮细胞形态特征,与成体内皮细胞相似;诱导的内皮样细胞Ⅷ因子染色和CD31免疫荧光染色均呈明显阳性,对照组细胞为阴性;诱导的内皮样细胞Dil-Ac-LDL摄取实验和FITC-UEA结合实验,细胞呈阳性表现。结论：在体外用骨髓MSCs能够成功诱导分化为血管内皮样细胞,为组织工程血管内皮化提供了一种可行的种子细胞来源。     

富血小板血浆对体外培养骨髓间充质干细胞增殖及成骨活性的作用

目的　观察富血小板血浆 (platelet- rich plasma,PRP)在体外培养骨髓间充质干细胞 (marrowmesenchymal stem cells,MSCs)的增殖及成骨作用 ,探讨 PRP促进骨修复的细胞和分子机制。　方法　体外培养人MSCs,分为实验组 (n=9)与对照组 (n=9) ,实验组进行 PRP干预 (10μl/ ml培养液 )。于不同时间点收集两组细胞 ,以流式细胞仪检测 S期比例 ,MTT法检测细胞增殖活性 ,碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase,AL P)测定和四环素荧光法检测细胞成骨活性 ,逆转录 PCR检测成骨启动基因 cbfa1的表达。　结果　 PRP作用于 MSCs,可刺激细胞增殖 ,流式细胞仪检测 PRP加入后 2 4 h S期比例由对照组 7.2± 0 .5至 14 .5± 0 .4具有统计学意义 (P<0 .0 1) ,MTT法显示 PRP作用后细胞增殖加速 ,第 4天达到平台期。而 AL P活性在作用后 3、6和 9d达到 7.79± 1.98、9.5 1± 2 .31和 14 .0 3± 3.0 2 ,与对照组 2 .0 6± 0 .77、2 .84± 0 .82和 2 .5 8± 0 .84组间比较差异有统计学意义 (P<0 .0 5 )。矿化结节形成增多 ,逆转录 PCR显示 cbfa1的表达在 PRP加入 2、4和 8h逐渐加强。　结论　 PRP对骨修复的促进作用与其促进 MSCs增殖、加强成骨启动基因的表达、增强成骨活性的作用有关。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导失巢凋亡过程中半胱氨酸蛋白酶-3的作用

[目的]探讨在体外诱导骨髓问充质干细胞失巢凋亡过程中半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）的作用。[方法]将体外培养的骨髓间充质干细胞随机分为3组：对照组、诱导凋亡组、抑制凋亡组。应用Caspase-3活性检测试剂盒，荧光比色法和Western blotting法检测失巢凋亡中Caspase-3活性的改变；借助流式细胞仪分析骨髓间充质干细胞凋亡的变化。[结果]流式细胞术显示诱导凋亡组出现了明显的凋亡峰，凋亡率随诱导时间的延长而明显增加；其它两组的凋亡率较低且较稳定。Westem blotting检测和Caspase-3活性荧光检测显示，诱导凋亡组Caspase-3的活性以及蛋白表达水平随诱导凋亡时间的延长而明显升高，且与细胞凋亡率相关，以后者更灵敏，其余两组活性无明显变化。[结论]Caspase-3蛋白在诱导骨髓间充质干细胞失巢凋亡的过程中发挥着重要作用；抑制Caspase-3的活性可以有效降低细胞失巢凋亡率。     

不同微环境对骨髓间充质干细胞分化为产胰岛素细胞的影响

目的 观察不同的微环境对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分化成为产胰岛素细胞(IPCs)的影响.方法 采用贴壁法分离纯化大鼠MSCs,用不同的微环境进行诱导,对照组诱导剂为含有角朊细胞生长因子、ITS、尼克酰胺的无血清DMEM/F12培养基、实验组在对照组基础上添加胰腺条件培养液;对诱导后细胞进行光、电镜观察,双硫腙和免疫细胞化学进行鉴定,并进行体外葡萄糖刺激实验,测定细胞分泌胰岛素及C-肽功能.结果 实验组及对照组均可诱导分化为IPCs,但实验组分化而成的IPCs在数量及功能上均高于对照组.结论 大鼠胰腺提取物模拟的微环境能促进大鼠MSCs体外诱导分化为较高质量的IPCs.     

兔骨髓间充质干细胞在HA/CS支架中的增殖活性

目的:研究骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在羟基磷灰石(HA)/壳聚糖(CS)复合支架材料中的生长和增殖情况,探讨复合材料与细胞的相容性。方法:穿刺法抽取新西兰大耳白兔骨髓3ml,通过密度梯度离心法获取MSCs,体外贴壁培养,倒置显微镜下观察原代及传代细胞形态、数量生长情况,描绘生长曲线。将第2代细胞以高密度接种到支架材料中体外三维培养,观察其细胞相容性。结果:经密度梯度离心结合贴壁筛选得到纯化的间充质干细胞,细胞能够连续传至9代以上,第2、5代细胞增殖能力最强。细胞进行体外三维培养时,可在HA/CS复合支架材料上良好的附着、生长和增殖。结论:兔骨髓间充质干细胞能在体外成功培养,HA/CS复合支架与MSCs具有良好的细胞相容性。     

Dexamethasone modulates BMP‐2 effects on mesenchymal stem cells in vitro

Dexamethasone/ascorbic acid/glycerolphosphate (DAG) and bone morphogenic protein (BMP)‐2 are potent agents in cell proliferation and differentiation pathways. This study investigates the in vitro interactions between dexamethasone and BMP‐2 for an osteoblastic differentiation of mesenchymal stem cells (MSCs). Bone marrow‐derived human MSCs were cultured with DAG (group A), BMP‐2 + DAG (group B), and DAG + BMP‐2 combined with a porous collagen I/III scaffold (group C). RT‐PCR, ELISA, immuncytochemical stainings and flow cytometry analysis served to evaluate the osteogenic‐promoting potency of each of the above conditions in terms of cell morphology/viability, antigen presentation, and gene expression. DAG induced collagen I secretion from MSCs, which was further increased by the combination of DAG + BMP‐2. In comparison, the collagen scaffold and the control samples showed no significant influence on collagen I secretion of MSCs. DAG stimulation of MSCs led also to a steady but not significant increase of BMP‐2 level. A DAG and more, a DAG + BMP‐2, stimulation increased the number of mesenchymal cells (CD105+/CD73+). All samples showed mRNA of ALP, osteopontin, Runx2, Twist 1 and 2, Notch‐1/2, osteonectin, osteocalcin, BSP, and collagen‐A1 after 28 days of in vitro culture. Culture media of all samples showed a decrease in Ca²⁺ and PO concentration, whereas a collagen‐I‐peak only occurred at day 28 in DAG‐ and DAG + BMP‐2‐stimulated bone marrow cells. In conclusion, BMP‐2 enhances DAG‐induced osteogenic differentiation in mesenchymal bone marrow cells. Both agents interact in various ways and can modify osteoblastic bone formation. © 2008 Orthopaedic Research Society. Published by Wiley Periodicals, Inc. J Orthop Res 26:1440–1448, 2008