重组日本血吸虫26 ku谷胱甘肽-硫-转移酶的表达、纯化及其免疫特性分析用于急性血吸虫病免疫诊断

目的将日本血吸虫(中国大陆株)26 ku谷胱甘肽-硫-转移酶(26 ku SjGST)基因克隆入pET28a(+)并诱导表达26 ku rSjGST蛋白,纯化并用于急性血吸虫病免疫诊断.方法构建重组质粒pET28a-SjGST,转化到E.coli BL21,经IPTG诱导表达并进行SDS变性蛋白质电泳,以小鼠抗GST单克隆抗体为一抗,进行Western-blot分析.用His·BandPurification Kit亲和层析纯化重组蛋白,以此重组蛋白作为抗原,用ELISA法检测急性血吸虫患者血清和非流行区正常人血清. 结果成功地构建了重组质粒pET28a-SjGST,SDS变性蛋白质电泳显示可见一与预期分子量大小相符的特异蛋白条带的表达.Western blot分析表明,该重组蛋白能被小鼠抗GST单克隆抗体识别.ELISA结果表明,rSj GST用于急性血吸虫患者血清中抗体检测的阳性率为92.3%.结论 rSj GST得到表达和纯化,该重组蛋白用于急性血吸虫患者血清中抗体的检测具有良好的免疫反应性,为进一步探讨其在血吸虫病诊断中的应用奠定了基础.     

日本血吸虫 Mr=26×103谷胱甘肽S-转移酶基因植物表达载体的构建

【目的】构建日本血吸虫Mr=26×103谷胱甘肽S-转移酶(GST)基因的植物表达载体,为研制血吸虫病口服疫苗做前期准备。【方法】采用PCR技术,扩增目的基因GST,与植物表达载体pBI121连结,构建重组表达载体pBI121-GST。【结果】通过PCR检测和双酶切鉴定以及重组质粒序列测定,结果表明,该目的基因片段已被整合到植物表达载体pBI121中,通过电激转化,将质粒转入农杆菌菌株LBA4404、EHA105中。【结论】本实验成功地构建了日本血吸虫Mr=26×103谷胱甘肽S-转移酶GST基因的植物表达载体。     

重组杆状病毒载体在哺乳动物细胞中的表达

目的 探讨重组杆状病毒作为哺乳动物基因转导载体的可行性及其转导特点。方法 应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统制备重组杆状病毒Bac-GFP,以不同MOI的病毒和不同终浓度丁酸钠感染各哺乳动物细胞系。通过荧光倒置相差显微镜和流式细胞仪观察检测细胞转导率和绿色荧光蛋白(GFP)表达强度。结果 发现HEK293细胞中,Bac-GFP转导率和GFP表达强度随着MOI和丁酸钠浓度的提高而显著增高(P<0.01),报告基因GFP的表达第2d最高,至少可持续9d。Bac-GFP可感染不同种属不同组织的哺乳动物细胞系,但转导率有差异。结论 重组杆状病毒可以用于体外基因转导。     

日本血吸虫重组蛋白SjGST的表达纯化及单克隆抗体的制备和特性鉴定

目的：获取高纯度的日本血吸虫重组GST蛋白（rSjGST）,并制备单克隆抗体。方法：纯化rSjGST后,以其作为抗原,免疫Balb/c雌鼠,并用杂交瘤技术制备抗rSjGST的单克隆抗体,以ELISA方法测定抗体的效价,以蛋白质免疫印迹法测定抗体的特异性。结果：纯化出大量的高纯度rSjGST,并且筛选出能够稳定分泌抗rSjGST单抗的杂交瘤细胞株3C12。用试剂盒检测出单抗的亚型为IgG1。结论：依靠大肠埃希菌表达系统,高效表达出rSjGST,成功制备单克隆抗体,为血吸虫病免疫诊断提供了研究基础。     

日本血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗对小鼠免疫应答的影响

采用日本血吸虫重组ＢＣＧ－Ｓｊ２６ＧＳＴ疫苗免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠。免疫８周时,断头取血,取脾脏,取腹腔巨噬细胞。以淋巴细胞刺激指数（ＳＩ）反映细胞增殖能力,以ＮＯ释放量检测巨噬细胞吞噬活性,以ＥＬＩＳＡ试剂盒检测血清及脾淋巴细胞培养上清的白细胞介素２（ＩＬ－２）和干扰素－γ（ＩＦＮ－γ）的含量。结果表明,ｒＢＣＧ－Ｓｊ２６ＧＳＴ疫苗以 １０~６ＣＦＵ剂量经皮下免疫小鼠后,小鼠脾淋巴细胞增殖能力明显高于对照组、载体组和ＢＣＧ组（均为Ｐ＜０．０５）;小鼠腹腔巨噬细胞ＮＯ的含量明显高于对照组和载体组（均为Ｐ＜０．０１）;小鼠血清ＩＬ－２的含量明显高于对照组（Ｐ＜０．０１）和载体组（Ｐ＜０．０５）;而小鼠脾淋巴细胞培养上清ＩＬ－２的含量分别高于对照组４４％、载体组４８％和ＢＣＢ组４２％;小鼠血清ＩＦＮ－γ的含量分别高于对照组２０％、载体组１９％和ＢＣＧ组１３％,均有升高趋势、结果提示,ｒＢＣＧ－Ｓｊ２６ＧＳＴ疫苗能明显增强小鼠的免疫应答反应,其抗感染作用一方面与ＢＣＧ本身的佐剂特性有关,另一方面与机体产生抗Ｓｊ２６－ＧＳＴ特异性抗体有关。     

日本血吸虫(大陆株)26ku谷胱甘肽转移酶基因真核表达载体构建及序列分析

目的　构建日本血吸虫大陆株 2 6ku谷胱甘肽转移酶 (GST)基因真核表达质粒 pBK SjGST并进行序列分析 ,为进一步进行重组蛋白的表达及保护性免疫研究提供条件。方法　根据日本血吸虫菲律宾株 2 6kuGST核苷酸序列 ,设计合成一对引物 ,以日本血吸虫中国大陆株成虫总RNA为模板 ,通过RT PCR合成日本血吸虫中国大陆株 2 6kuGSTcDNA片段。将其克隆入 pGEM T载体 ,经双酶切及PCR鉴定后 ,再亚克隆入 pBK CMV真核表达质粒 ,构建重组质粒pBK SjGST ,转化到大肠杆菌BL2 1感受态细胞 ,提取重组质粒双酶切鉴定并进行序列分析。结果　PCR、pGEM T SjGST及 pBK SjGST分别经双酶切获得一特异性基因片段 .经测序分析该片段具有一个 670bp的全基因序列 ,而其开放阅读框 (openreadingframe,ORF)为 65 7bp ,编码 2 18个氨基酸 ,并对其基因序列及编码的蛋白质进行了分析。结论　成功地构建了日本血吸虫中国大陆株 2 6kuGST基因真核表达重组质粒 ,并对其核苷酸序列及推导的氨基酸序列蛋白激酶磷酸化位点进行分析     

重组日本血吸虫副肌球蛋白的表达与纯化

用基因重组技术 ,将日本血吸虫副肌球蛋白 (rSj97)基因亚克隆至表达载体pQE30上。在IPTG诱导下 ,重组日本血吸虫副肌球蛋白在大肠杆菌中得以高效表达。通过快速蛋白质液相色谱仪 (FPLC) ,经TALON柱和离子交换柱两步分离纯化 ,获得大量高纯度的重组日本血吸虫副肌球蛋白 ,为水牛现场试验提供了充足的抗原     

日本血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗免疫小鼠血清IgG动态观察及免疫保护力的研究

为检测血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗免疫小鼠血清IgG动态变化和免疫保护力,采用106CFU疫苗皮下1次和3次接种小鼠,接种后8周用日本血吸虫尾蚴攻击感染。感染后6周剖杀小鼠,计算减虫率和减卵率,同时设有BCG对照组。结果发现实验组免疫后血清IgG抗体迅速升高并持续于高水平;减虫率分别为39.74%和39.74%,减卵率分别为62.86%和55.62%,与对照组相比均有非常显著的差异（P<0.01）。而免疫3次和免疫1次小鼠血清IgG抗体水平及减虫率、减卵率均无显著差异。血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗皮下注射1次即能诱导小鼠较高水平的IgG抗体和免疫保护力,是一种比较理想的新型疫苗,值得进一步研究。     

Comparative Study on the Immunogenicity between Recombinant MS-Sj26GST Vaccine and Recombinant BCG-Sj26GST Vaccine in Schistosoma japonicum

TuberculosisandSchistosomiasisarethemajorcontagiousdiseaseswhicharethemostdangeroustothepeople’shealth Inordertogetridofthem ,wemustlookforamoreusefulvaccine Bythetech niquesofmolecularbiology ,2 6 0 0 0DaGlutathionStransferase (GST) genewasclonedintotheE coli MycobacteriumtransferringandexpressionvectorpBCG 2 0 0 0totransformittoMycobacteriumsmeg matismc2 15 5 (MS)andBCGseparatelyinordertoconstructrMS Sj2 6GSTvaccineandrBCG Sj2 6GSTvaccine Inthisstudy ,theBALB/cmicewereimmu niz…     

日本血吸虫磷酸丙糖异构酶编码基因的克隆与序列测定

目的克隆和鉴定日本血吸虫磷酸丙糖异构酶(SjTPI)编码基因,为寻找血吸虫病的候选疫苗联合应用打基础.方法设计合成引物,抽提日本血吸虫成虫总RNA,用RT-PCR法从中扩增出SjTPI基因编码序列,将其克隆入pGEM-T载体,用双酶切、以重组质粒为模板进行PCR扩增和测序进行鉴定.结果 RT-PCR法从成虫总RNA中扩增出大小为759 bp SjTPI基因编码序列,重组质粒pGEM-SjTPI经双酶切、PCR扩增,均可获得一条与RT-PCR产物一致的DNA片段,序列测定结果表明具有一个长度为759 bp的完整开放阅读框,与日本血吸虫(菲律宾株)和曼氏血吸虫磷酸丙糖异构酶核苷酸序列有高度同源性(分别为99%和88%).结论该实验成功地克隆了SjTPI编码基因,为进一步研究提供了条件.     

人胰岛素基因重组杆状病毒在家蝇中表达的研究

目的:利用杆状病毒表达系统进行人胰岛素基因在家蝇中表达的研究.方法:用携带有人胰岛素基因的重组杆状病毒感染家蝇幼虫,用放射免疫技术、Tricine-SDS-PAGE和Western-blot技术对蝇蛆胰岛素表达水平进行检测.结果:重组的杆状病毒感染家蝇幼虫后,蝇蛆中有人胰岛素的表达,表达量为37.401μIU/ml,占蝇蛆总蛋白的0.583%.结论:利用杆状病毒表达系统可以在家蝇蝇蛆中表达人胰岛素.     

人的可溶性L-selectin(sL-selectin)在杆状病毒载体系统中的表达与纯化

目的利用昆虫细胞杆状病毒系统表达人的重组可溶性L-型选择蛋白配体凝集素（human recombinant soluble L-selectin：sL-selectin）,探索在真核细胞中高效表达人的重组可溶性L-型选择蛋白配体凝集素的新途径。方法将已经重组好的杆状病毒感染昆虫细胞,表达sL-选凝素于细胞培养上清,利用末端连接的ZZ-结构域（蛋白A来源的首尾相连的二聚化Z结构域）与IgG-琼脂糖-6的结合而分离纯化,通过SDS-PAGE鉴定分子量的大小,并用特异性抗体验证,另外通过重组的sL-选凝素与SMMC7721的黏附观察其活性。结果sL-选凝素可在昆虫细胞中表达,产物的分子量约为46000,与人肝癌细胞SMMC7721的结合率可达70％。结论sL-选凝素可通过杆状病毒载体在昆虫细胞中有效表达,分离纯化后依然保持生理活性。     

人肝细胞生长因子在CHO细胞中的表达

以ｐＲＣ／ＣＭＶ作为真核细胞表达性载体，用限制性内切酶ＢａｍＨＩ／ＸｂａⅠ将ＨＧＦｃＤＮＡ全序列定向重组到ｐＲＣ／ＣＭＶ的多克隆位点上。筛选得到的重组质粒以磷酸钙ＤＮＡ共沉淀的方法转染ＣＨＯ细胞，经８００ｍｇ／Ｌ的Ｇ４１８筛选，获得阳性细胞克隆。用ＨＣＣ－７９０２细胞及原代培养的成年大鼠肝细胞对转染阳性细胞培养基收集上清进行活性测定。３Ｈ－ＴｄＲ掺入等分析证明，它能有效地抑制体外培养的人肝癌细胞的生长，并可明显刺激鼠肝细胞ＤＮＡ的合成。结果表明，重组人ＨＧＦ基因在ＣＨＯ细胞中成功地获得表达，为基因工程大量制备和纯化ＨＧＦ奠定了基础     

日本血吸虫病流行区再感染人群血清IgG_4抗体的特异性免疫识别

目的对构建人群再感染易感性的预测系统提供有价值的信息。方法采用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ技术,以日本血吸虫病流行区化疗后再感染人群的４３份血清中ＩｇＧ４抗体,对日本血吸虫的可溶性虫卵抗原（ＳＥＡ）和可溶性成虫粗抗原（ＳＷＡＰ）进行免疫识别。结果ＳＥＡ中２００ｋｕ、７０ｋｕ及５５～６０ｋｕ蛋白组分和ＳＷＡＰ的８７ｋｕ蛋白组分被２１份以上血清的ＩｇＧ４抗体识别。结论上述血吸虫蛋白分子可能是人群日本血吸虫病再感染易感状态相关的抗原表位。     

日本血吸虫32ku抗原基因的克隆及在耻垢分枝杆菌中的表达

日本血吸虫３２ ｋｕ抗原（简称ｓｊ３２ｋｕ）是血吸虫的一种保护性抗原,为研究其重组疫苗的保护作用,将该抗原基因的全编码序列按正确的阅读框顺序插入到穿梭质粒 ｐＢＣＧ２１００,受控于人结核杆菌热休克蛋白 ７０（Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏ－ｔｅｉｎ ７０,简称ｈｓｐ７０）启动子,构建成重组表达质粒 ｐＢＣＧ－ｓｊ３２,在大肠杆菌－分枝杆菌两个系统中能稳定复制。重组分枝杆菌于 ４２℃诱导 ２ ｈ或 ４５℃诱导 ３０ ｍｉｎ,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,在 ３２ ｋｕ的位置能见到明显的蛋白条带,表明 ３２ ｋｕ抗原能在分枝杆菌中高效表达。     

日本血吸虫在小鼠体内不同发育时点的生长速度与蛋白组分差异

目的比较观察日本血吸虫发育中虫体在不同时点的生长速度和蛋白组分差异。方法选择昆明鼠人工感染日本血吸虫尾蚴,分别收集感染前和感染后第8、12、16、20、24和28d虫体;用MoticBA400病理图像处理系统及3.2分析软件采集虫体图象作形态观察和大小测量(包括水平面积、周长、长与宽);用SDS-PAGE平行分离各时点虫体蛋白,用图像分析软件QuantityOne4.4比较分析其区带差异。结果日本血吸虫感染昆明鼠后,发育中虫体在不同时点的生长速度不均衡,第8～12天的生长速度为最快,其他依次为12～16d、16～20d、20～24d、0～8d和24～28d的虫体;同一时点虫体间发育的个体差异也大,以12d后虫体较为明显。电泳分析7个不同时点的虫体蛋白区带显示:区带数在0、8、12、16、20、24和28d虫体中分别为27、30、33、32、31、36和29条,其中多数为相同分子量蛋白区带,但有些在蛋白表达量上有明显差异;各时点虫体特异性区带在0、8、12～24d和28d虫体中分别为7、4、8、3条,虫体特异性区带多为低表达量的条带。结论日本血吸虫童虫在小鼠体内的不同发育时点间存在着生长速度和蛋白组分的差异,其中以8～12d时段的虫体发育最快,两者间蛋白组分差异也较明显。     

硝酸甘油软膏局部应用对正常雄性大鼠性功能的影响

采用局部给药方式表明，１．５％、３．０％硝酸甘油软膏可使阴茎勃起持续期明显延长，阴茎直径明显增大。０．７０％、１．５％硝酸甘油软膏能明显缩短雄性大鼠扑捉雌鼠的潜伏期，增加扑捉次数，提示该药能增强大鼠阴茎对外部的刺激兴奋性，提高阴茎勃起质量。     

基于hNIS基因的辐射正反馈重组杆状病毒体系制备

目的构建含早期生长应答因子1（Egrl）辐射敏感启动子调控的人钠碘同向转运体（hNIS）基因重组杆状病毒,为进一步延长核素在细胞中的滞留时间,提高hNIS介导的恶性肿瘤放射性核素基因靶向治疗疗效提供理论基础。方法空载体pFB取自质粒pFB—CMV—EGFP,Egrl启动子取自质粒PGL3一Egrl—luc,hNIS取自质粒pcDNA3．1一CMV—hNIS,构建重组杆状病毒载体质粒pFB—Egrl—Hnis;同时构建含CMV启动子的质粒pFB—CMV—hNIS作为阳性对照,并将杆状病毒空载体质粒pFB-0作为阴性对照。随后制备各组杆状病毒,扩增收集重组杆状病毒并进行滴度测定。为进一步鉴定病毒功能,一方面通过体外感染U87脑胶质瘤细胞并采用131I刺激,通过免疫荧光检测131I刺激后的hNIS蛋白表达;另一方面通过摄碘实验进一步验证所表达的hNIS蛋白的摄碘功能和特性。结果成功构建重组杆状病毒载体质粒pFB—Egrl—hNIS和pFB—CMV—hNIS;转座成功并提取了重组Bacmid;重组Bacmid转染Sf9细胞后扩增收集的重组杆状病毒滴度可以达到1×1010pfu／mL。体外感染U87细胞后,免疫荧光检测表明131I刺激后可增加hNIS的表达,感染细胞表达的hNIS蛋白位于细胞膜上,且具有摄碘的功能。结论成功构建了重组杆状病毒载体质粒pFB—Egrl—hNIS及pFB—CMV—hNIS,获得高滴度的重组杆状病毒Bac—Egrl—hNIS、Bac．CMV—hNIS和Bac-0并得到验证;建立了基于hNIS基因的辐射正反馈重组杆状病毒体系,为进一步提高核素靶向治疗疗效奠定了重的理论基础。     

人IL-12在昆虫细胞中的表达及其体外生物活性的检测

目的：建立表达具有生物活性的人IL-12 的杆状病毒/昆虫细胞表达系统。方法：将p40和p35 cDNA一起构建入杆状病毒转移载体pAcUW42,然后与杆状病毒AcUW1.lacZ DNA共同转染昆虫细胞Sf9,使两者产生同源重组;随后利用病毒空斑实验筛选重组的杆状病毒,再由ELISA筛选及鉴定表达IL-12的重组病毒,并进行Western Blotting和体外生物活性的检测。结果：经病毒空斑试验、ELISA和Western Blotting逐步阳性选择的IL-12重组杆状病毒,其感染Sf9细胞的上清与IL-12标准品一样具备刺激正常人外周血T淋巴细胞增生的生物活性。结论：本研究建立了能表达具有体外生物活性的人重组IL-12的杆状病毒/昆虫表达系统。